生物化學檢測技術(shù)

1、會計學1生物化學檢測技術(shù)生物化學檢測技術(shù)電泳槽和大分子分離結(jié)果電泳槽和大分子分離結(jié)果淀 粉 凝 膠 電 泳聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳凝 膠 支 持 物 區(qū) 帶 電 泳紙 電 泳 醋 酸 纖 維 薄 膜 電 泳 薄 層 電 泳非 凝 膠 支 持 物 電 泳用 支 持 物 區(qū) 帶 電 泳顯 微 電 泳 等 電 聚 焦 電 泳 等 速 電 泳不 用 支 持 物 電 泳是 否 用 支 持 物2022-4-30南京農(nóng)業(yè)大學南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院生命科學學院102022-4-30南京農(nóng)業(yè)大學南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院生命科學學院11nE 電場強度電場強度nq 顆粒所

2、帶電荷顆粒所帶電荷nr 顆粒半徑顆粒半徑n 介質(zhì)黏度介質(zhì)黏度上樣上樣buffer 0.25%溴酚藍 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液 0.25%溴酚藍 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液以上溶液4 保存?zhèn)溆?。瓊脂糖濃?%)線型DNA分子的大小(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.232.00.122022-4-30韶關(guān)大學生命科學學院韶關(guān)大學生命科學學院24PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳2022-4-3025 100 200 300 1,650 1,000 500 850 650 400 5,000 bp 2,000DNA ladderD

3、NA ladderPCR 產(chǎn)物產(chǎn)物1 2 3 4 5 6 7 8膠孔膠孔+ - - + - + + -引物二聚體引物二聚體2022-4-30南京農(nóng)業(yè)大學南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院生命科學學院262022-4-30南京農(nóng)業(yè)大學南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院生命科學學院302022-4-30南京農(nóng)業(yè)大學南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院生命科學學院48na Acr克數(shù)nb Bis克數(shù)2022-4-30韶關(guān)大學韶關(guān)大學 生命科學學院生命科學學院52n濃縮膠是樣品膠的延續(xù)，凝膠濃度及濃縮膠是樣品膠的延續(xù)，凝膠濃度及pH值與樣值與樣品膠完全相同，其作用是使樣品進入分離膠前，品膠完全相同，其作用是使樣品進入分離膠前，

4、被濃縮成窄的區(qū)帶，從而提高分離效果。被濃縮成窄的區(qū)帶，從而提高分離效果。n分離膠的分離膠的T=7.0%-7.5%，C=2.5%，緩沖液為，緩沖液為pH8.9的的Tris-HCl，大部分蛋白質(zhì)在此，大部分蛋白質(zhì)在此pH條件下條件下帶負電荷。此膠主要起分子篩作用。帶負電荷。此膠主要起分子篩作用。2022-4-30南京農(nóng)業(yè)大學南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院生命科學學院69n在防止對流的情況下，只要有電流存在就在防止對流的情況下，只要有電流存在就可以保持穩(wěn)定的可以保持穩(wěn)定的pH 梯度，因為此時由于梯度，因為此時由于擴散和電移動所引起的物質(zhì)移動處于動態(tài)擴散和電移動所引起的物質(zhì)移動處于動態(tài)平衡。平衡。v 在此

5、在此pH梯度中，各種蛋白質(zhì)遷移到各自的梯度中，各種蛋白質(zhì)遷移到各自的pI處而得到分離。由此可見，該蛋白質(zhì)在處而得到分離。由此可見，該蛋白質(zhì)在“自自然然”pH 梯度中，無論處于何種位置均會向其梯度中，無論處于何種位置均會向其等電點移動，并最終停留在該處。等電點移動，并最終停留在該處。pH3pH10IEFSDS 雙向電泳示意圖雙向電泳示意圖n氨基黑10B染不同蛋白質(zhì)時，著色度不等、色調(diào)不一，定量時誤差較大，需要對各種蛋白質(zhì)作出 本身的蛋白質(zhì)-染料量(吸收值)的標準曲線，更有利于定量測定。2022-4-30南京農(nóng)業(yè)大學南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院生命科學學院882022-4-30南京農(nóng)業(yè)大學南京農(nóng)業(yè)大

6、學 生命科學學院生命科學學院89光的互補光的互補：藍：藍 黃黃二、分光光度計的結(jié)構(gòu)原理二、分光光度計的結(jié)構(gòu)原理最常用的是最常用的是可見分光光度計可見分光光度計和和紫外紫外- -可見光分光光度計可見光分光光度計 光源光源單色器單色器樣品樣品吸收池吸收池檢測器檢測器信號指示系統(tǒng)信號指示系統(tǒng)五大部份五大部份n結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：（一）光源（一）光源u光源定義：光源定義： 指一種可以發(fā)射出供溶液或吸收物質(zhì)選擇性吸收的光。光指一種可以發(fā)射出供溶液或吸收物質(zhì)選擇性吸收的光。光源應在一定光譜區(qū)域內(nèi)發(fā)射出連續(xù)光譜，并有足夠的強度和良源應在一定光譜區(qū)域內(nèi)發(fā)射出連續(xù)光譜，并有足夠的強度和良好的穩(wěn)定性，在整個光譜區(qū)域內(nèi)光的

7、強度不應隨波長有明顯的好的穩(wěn)定性，在整個光譜區(qū)域內(nèi)光的強度不應隨波長有明顯的變化。變化。 u光源種類：光源種類： 可見光分光光度計常用光源是可見光分光光度計常用光源是鎢燈或鹵鎢燈。鎢燈或鹵鎢燈。 紫外光光度計常用紫外光光度計常用氫燈氫燈作為光源。作為光源。 （二）單色器（二）單色器u定義：定義： 將來自光源的復合光分散為單色光的裝置稱為分將來自光源的復合光分散為單色光的裝置稱為分光系統(tǒng)或單色器。光系統(tǒng)或單色器。 u種類：種類： 濾光片濾光片棱鏡棱鏡光柵光柵（三）比色杯（三）比色杯又稱為吸收池或比色皿又稱為吸收池或比色皿 u材料：材料：常用無色透明、耐腐蝕和耐酸堿的玻璃或石英材料做成常用無色透明

8、、耐腐蝕和耐酸堿的玻璃或石英材料做成 （五）信號指示系統(tǒng)（五）信號指示系統(tǒng)（四）檢測器（四）檢測器 檢測器是將透過溶液的光信號轉(zhuǎn)換為電信號，并將電信號檢測器是將透過溶液的光信號轉(zhuǎn)換為電信號，并將電信號放大的裝置。常用的檢測器為光電管和光電倍增管。放大的裝置。常用的檢測器為光電管和光電倍增管。 是將光電管或光電倍增管放大的電流通過儀表顯示出來的是將光電管或光電倍增管放大的電流通過儀表顯示出來的裝置。裝置。 三、分光光度計的操作方法三、分光光度計的操作方法（一）分光光度計的基本操（一）分光光度計的基本操作作以以721-A721-A型分光光度計為例，其基本的操作步驟為型分光光度計為例，其基本的操作步

9、驟為：1.1.開開721-A721-A分光光度計的開關(guān)，將比色池的蓋子打開，通分光光度計的開關(guān)，將比色池的蓋子打開，通電電2020分鐘使儀器預熱。分鐘使儀器預熱。2.2.將波長旋至測定的波長。將波長旋至測定的波長。3.3.將空白液、校準液或待測液放入比色池，將空白液置將空白液、校準液或待測液放入比色池，將空白液置于光路中。于光路中。4.4.將開關(guān)置于將開關(guān)置于T T位，打開比色池蓋子，用光量粗調(diào)和光量位，打開比色池蓋子，用光量粗調(diào)和光量細調(diào)調(diào)節(jié)細調(diào)調(diào)節(jié)T T為為0.0,0.0,關(guān)上關(guān)上比色池蓋子，調(diào)節(jié)比色池蓋子，調(diào)節(jié)T T為為100.0100.0。5.5.將開關(guān)置于將開關(guān)置于A A，用消光調(diào)零

10、調(diào)節(jié)，用消光調(diào)零調(diào)節(jié)A A為為0.00.06.6.重復步驟重復步驟4 4和和5 57.7.將校準液或待測液推入光路，測量溶液的吸光度（將校準液或待測液推入光路，測量溶液的吸光度（A A）721-A分分光光光光度計度計（二）分光光度技術(shù)的定量方法（二）分光光度技術(shù)的定量方法1.1.標準曲線法標準曲線法 根據(jù)根據(jù)Lambert-BeerLambert-Beer定律，液體的濃度在一定范圍定律，液體的濃度在一定范圍內(nèi)與吸光度成正比關(guān)系。配制一系列濃度的標準品溶內(nèi)與吸光度成正比關(guān)系。配制一系列濃度的標準品溶液（濃度應包含高、中、低濃度范圍），按標本處理液（濃度應包含高、中、低濃度范圍），按標本處理方法作

11、相同處理，在特定波長下測定吸光度，方法作相同處理，在特定波長下測定吸光度，以標準以標準液濃度為橫座標，以吸光度為縱座標液濃度為橫座標，以吸光度為縱座標，按最小二乘法，按最小二乘法的原理，將對應各點連成一條通過原點的直線，這條的原理，將對應各點連成一條通過原點的直線，這條直線稱為標準曲線。待測溶液測定吸光度后，從標準直線稱為標準曲線。待測溶液測定吸光度后，從標準曲線上可查出其相應的濃度。曲線上可查出其相應的濃度。u方法：方法：u制作和應用標準曲線時應注意下面幾點：制作和應用標準曲線時應注意下面幾點：（1 1）測定條件發(fā)生變化時（如更換標準品和試劑等），應重新）測定條件發(fā)生變化時（如更換標準品和試

12、劑等），應重新繪制。繪制。（2 2）標準品應有高的純度，標準液的配制應準確。）標準品應有高的純度，標準液的配制應準確。（3 3）當待測液吸光度超過線性范圍時，應將標本稀釋后再測定。）當待測液吸光度超過線性范圍時，應將標本稀釋后再測定。（4 4）標本測定的條件應和標準曲線制作時的條件完全一致。）標本測定的條件應和標準曲線制作時的條件完全一致。2 2標準對照法標準對照法 C Cu u=(A=(Au uC Cs s)/A)/As s 己知濃度的標準品和標本作同樣處理，使用相同的空白，己知濃度的標準品和標本作同樣處理，使用相同的空白，同時測定標準管和標本的吸光度，根據(jù)測定的吸光度及標準同時測定標準管和

13、標本的吸光度，根據(jù)測定的吸光度及標準品濃度，可直接計算出標本的濃度，計算公式為：品濃度，可直接計算出標本的濃度，計算公式為： 其中其中CuCu和和AuAu為標本管濃度和吸光度，為標本管濃度和吸光度，CsCs和和AsAs分別為標準分別為標準管濃度和吸光度。用標準品法定量時，標準品的濃度應盡量管濃度和吸光度。用標準品法定量時，標準品的濃度應盡量和標本管濃度相近。和標本管濃度相近。 3 3其它分析方法其它分析方法 包括差示法、多組份混合物分析和利用包括差示法、多組份混合物分析和利用摩爾吸光系數(shù)分析等方法。摩爾吸光系數(shù)分析等方法。熒光光度法熒光光度法NanoDrop ND-3300 Fluorospe

14、ctrometer 標準樣品CYYXC60（一）火焰光度法（一）火焰光度法（二）原子吸收分光光度法（二）原子吸收分光光度法 1 1基本原理基本原理 2 2組成組成1 1基本原理基本原理 2 2組成組成 3 3原子吸收分光光度法的特點原子吸收分光光度法的特點 三、其它光譜分析技術(shù)三、其它光譜分析技術(shù)火焰光度法火焰光度法等離子體發(fā)射光譜法等離子體發(fā)射光譜法原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法五種蛋白質(zhì)測定方法比較如下：五種蛋白質(zhì)測定方法比較如下： 方法靈敏度時間原理干擾物質(zhì)說明凱氏定氮法（Kjedahl法）靈敏度低，適用于0.2 1.0mg氮，誤差為 2費時 810小時將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨，用酸吸收后

15、滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離）用于標準蛋白質(zhì)含量的準確測定；干擾少；費時太長雙縮脲法（Biuret法）靈敏度低120mg中速 2030分鐘多肽鍵堿性Cu2紫色絡(luò)合物硫酸銨；Tris緩沖液；某些氨基酸用于快速測定，但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似紫外吸收法較為靈敏50100g快速 510分鐘蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收各種嘌吟和嘧啶；各種核苷酸用于層析柱流出液的檢測；核酸的吸收可以校正Folin酚試劑法（Lowry法）靈敏度高5g慢速 4060分鐘 雙縮脲反應；磷鉬酸磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸；各種硫醇耗費時間長；操作要嚴格計時

16、；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化考馬斯亮藍法(Bradford法)靈敏度最高15g快速515分鐘考馬斯亮藍染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時，其max由465nm變?yōu)?95nm強堿性緩沖液；TritonX-100;SDS最好的方法；干擾物質(zhì)少；顏色穩(wěn)定； 顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化 雙縮脲反應雙縮脲反應生化自動分析儀生化自動分析儀Vit C 還原產(chǎn)物鉬藍在波長還原產(chǎn)物鉬藍在波長660nm測測定吸光值，當無機磷含量在定吸光值，當無機磷含量在1-25g 范圍內(nèi)，光吸收和含磷量成正比。范圍內(nèi)，光吸收和含磷量成正比。 RNA的含磷量為的含磷量為9.5%，即，即1g RNA磷相當于磷相當于10.5 g RNA。DNA的含磷量平

17、均為的含磷量平均為9.9%。消化管123RNA/mL010標準磷原液/mL001dH2O/mL1005mol/L H2SO4/mL222消煮爐中消化2-6h至溶液無色透明，冷卻dH2O/mL111沸水浴中加熱10min（分解焦磷酸），冷卻用dH2O定容/mL505050混勻 1 2 34 5 6標準磷溶液/mL 00.10.20.30.40.5dH2O/mL 1.51.41.31.21.11.0定磷試劑/mL 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 用漩渦混合器混勻，45恒溫水浴保溫25分鐘 用去離子水作為空白，660nm測定吸光值A(chǔ)660(1) A660(2) A660平均值 A66

18、0平均值空白 07（空白） 8（樣品）9（標準）定容溶液/mL 1.51.50.15dH2O/mL 001.35定磷試劑/mL 1.5 1.5 1.5 用漩渦混合器混勻，45恒溫水浴保溫25分鐘 A660(1) A660(2) A660平均值 A660平均值空白 0(1) 計算回收率：計算回收率： (2) 計算樣品總磷量：計算樣品總磷量： (3) 計算計算RNA量：量： (4) 樣品樣品RNA含量：含量：100%1000500.15y 回收率回收率回收率總磷量總磷量505 . 1)/( xmLgRNA %100)/(2000)/()%( mLgmLgRNARNA 質(zhì)量濃度質(zhì)量濃度質(zhì)量分數(shù)質(zhì)量分數(shù)樣品樣品5 .105 .10%9 . 9)/ 總磷量總磷量）含量含量無機磷量無機磷量（總磷量（總磷量質(zhì)量濃度（質(zhì)量濃度（DNAmLgRNA慢慢中等中等快快Temporal course淋洗液淋洗液梯度混合儀梯度混合儀柱層析基本操作步驟基本操作步驟包括：包括：填料處理填料處理裝住裝住平衡平衡進樣進樣洗滌洗滌洗脫洗脫復蘇復蘇/保存保存血漿運輸層血漿運輸層試劑層試劑層反應層反應層密碼磁帶密碼磁帶血漿分離區(qū)血漿分離區(qū)輔助試劑層輔助試劑層外膜層外膜層干試條的組成干試條的組成化學干片示意圖化學干片示意圖袋式分析儀的試劑包袋式分析儀的試劑包謝謝 謝謝電泳槽和大分子分離結(jié)果電泳槽和大分