流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用

1、會(huì)計(jì)學(xué)1流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用 科研型科研型 分選功能分選功能488nm488nm激光激光 四色熒光四色熒光(525(525、575575、610610、675nm675nm） 流式細(xì)胞儀的發(fā)展起源于細(xì)胞計(jì)數(shù)自動(dòng)化的流式細(xì)胞儀的發(fā)展起源于細(xì)胞計(jì)數(shù)自動(dòng)化的研究。其原理是被熒光染色的單細(xì)胞或顆粒，研究。其原理是被熒光染色的單細(xì)胞或顆粒，經(jīng)過高速的液流系統(tǒng)形成細(xì)胞柱，排列成單細(xì)經(jīng)過高速的液流系統(tǒng)形成細(xì)胞柱，排列成單細(xì)胞依次通過流動(dòng)室，在激光照射區(qū)域，攜帶熒胞依次通過流動(dòng)室，在激光照射區(qū)域，攜帶熒光素細(xì)胞受激發(fā)產(chǎn)生不同的熒光信號(hào)，這些熒光素細(xì)胞受激發(fā)產(chǎn)生不同的熒光信號(hào)，這些熒

2、光信號(hào)可以反映細(xì)胞的生物特性。光信號(hào)可以反映細(xì)胞的生物特性。前向散射激光FCMFCM的液流系統(tǒng)（如的液流系統(tǒng)（如何形成單個(gè)細(xì)胞流）何形成單個(gè)細(xì)胞流）樣本管樣本管鞘液管鞘液管流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用范圍流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用范圍細(xì)胞大小細(xì)胞大小細(xì)胞表面分子細(xì)胞表面分子:CD:CD系列系列細(xì)胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞核內(nèi)分子：細(xì)胞核內(nèi)分子：P53P53細(xì)胞功能檢測(cè)細(xì)胞功能檢測(cè): :細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡其他：線粒體膜電位、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度其他：線粒體膜電位、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度激發(fā)光波長(zhǎng)（激發(fā)光波長(zhǎng)（nm ） 發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)(nm)異硫氰酸（異硫氰酸（FITC） 488

3、525（綠）（綠）藻紅蛋白（藻紅蛋白（PE） 488 575（橙）（橙）碘化丙啶（碘化丙啶（PI） 488 610（紅）（紅）藻紅蛋白偶聯(lián)物（藻紅蛋白偶聯(lián)物（PE-CY5） 488 667（紅）（紅）藻紅蛋白偶聯(lián)物（藻紅蛋白偶聯(lián)物（PE-CY7） 488 767（紅外）（紅外）別藻青蛋白（別藻青蛋白（APC）633 660（紅）（紅）別藻青蛋白偶聯(lián)物別藻青蛋白偶聯(lián)物（APC-CY7）633767（紅外）（紅外）三、單克隆抗體標(biāo)記熒光探針選擇三、單克隆抗體標(biāo)記熒光探針選擇1.了解激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)了解激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)2. 2. 要有高的光子產(chǎn)量要有高的光子產(chǎn)量-提高信號(hào)強(qiáng)度。提高信號(hào)強(qiáng)度。

4、3. 3. 對(duì)激光有強(qiáng)的吸收對(duì)激光有強(qiáng)的吸收-降低背景噪音。降低背景噪音。4. 4. 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間差距大激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間差距大-減少減少 干擾。干擾。5. 5. 易與被標(biāo)記的物質(zhì)結(jié)合，而不影響被標(biāo)記易與被標(biāo)記的物質(zhì)結(jié)合，而不影響被標(biāo)記 物的特異性。物的特異性。6. 6. 穩(wěn)定性好，不易受光、溫度、標(biāo)本抗凝劑穩(wěn)定性好，不易受光、溫度、標(biāo)本抗凝劑 和固定劑等影響。和固定劑等影響。單細(xì)胞的分離制備單細(xì)胞的分離制備 分離液分離液 血液血液+ +生理鹽水生理鹽水 離心離心 2500r/min2500r/min，20-30min20-30min 單個(gè)核細(xì)胞單個(gè)核細(xì)胞單核細(xì)胞單核細(xì)胞: :

5、利用單核細(xì)胞在短時(shí)培養(yǎng)貼壁快利用單核細(xì)胞在短時(shí)培養(yǎng)貼壁快的特性（的特性（30-40min30-40min），可采用短時(shí)培），可采用短時(shí)培養(yǎng)獲得較純的單核細(xì)胞養(yǎng)獲得較純的單核細(xì)胞. . 4. 4. 石蠟包埋組織石蠟包埋組織單細(xì)胞懸液的單細(xì)胞懸液的制備制備 醇乙脫水醇乙脫水：707080%9080%90 95% 95% 100%100%醇乙醇乙二甲苯二甲苯石石蠟包埋蠟包埋脫蠟水化：脫蠟水化：二甲苯脫蠟二甲苯脫蠟 100100醇乙醇乙90%80%7090%80%705050蒸餾水蒸餾水羊抗兔羊抗兔兔抗小鼠兔抗小鼠 小鼠小鼠直直 標(biāo)標(biāo)間間 標(biāo)標(biāo)3.3.陰性染色對(duì)照陰性染色對(duì)照已知不表達(dá)某種抗原的細(xì)胞即

6、為陰已知不表達(dá)某種抗原的細(xì)胞即為陰性細(xì)胞群，如性細(xì)胞群，如CD3/CD19CD3/CD19雙染檢測(cè)健康人血液淋巴雙染檢測(cè)健康人血液淋巴細(xì)胞亞群時(shí)，應(yīng)有一群不表達(dá)這兩種抗原的雙陰細(xì)胞亞群時(shí)，應(yīng)有一群不表達(dá)這兩種抗原的雙陰性細(xì)胞群（主要是性細(xì)胞群（主要是NKNK細(xì)胞），可作陰性對(duì)照。細(xì)胞），可作陰性對(duì)照。4. 4. 同型對(duì)照同型對(duì)照 與染色的單克隆抗體特異性無關(guān)的免與染色的單克隆抗體特異性無關(guān)的免疫球蛋白亞型，如疫球蛋白亞型，如IgG-FITCIgG-FITC、IgG-PEIgG-PE任意門、矩形門任意門、矩形門 線性門線性門 四象門四象門 淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞T淋巴細(xì)胞（淋巴細(xì)胞（CD3+）CD3+

7、CD8-IFN-rIL-4（CD4+）參數(shù)的意義參數(shù)的意義: :FSCFSC的強(qiáng)度與細(xì)胞的大小有關(guān)，也就是說，細(xì)胞越大的強(qiáng)度與細(xì)胞的大小有關(guān)，也就是說，細(xì)胞越大，散射光越強(qiáng)，細(xì)胞越小，散射光越強(qiáng)，細(xì)胞越小, ,散射光越弱散射光越弱; ;SSCSSC對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，可反對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，可反映細(xì)胞顆粒性程度大小。映細(xì)胞顆粒性程度大小。單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖X X軸代表熒光或散射光的強(qiáng)度，軸代表熒光或散射光的強(qiáng)度，Y Y軸代該軸代該道所具有相同光信號(hào)細(xì)胞的頻率或相對(duì)的細(xì)胞數(shù)；道所具有相同光信號(hào)細(xì)胞的頻率或相對(duì)的細(xì)胞數(shù)；雙參數(shù)散點(diǎn)圖雙參數(shù)散點(diǎn)圖X X軸和軸

8、和Y Y軸均代表散射光或熒光的強(qiáng)度軸均代表散射光或熒光的強(qiáng)度. .SSCFSC2C2C4C4C FCMFCM進(jìn)行細(xì)胞周期進(jìn)行細(xì)胞周期DNADNA含量分析時(shí)，需要對(duì)含量分析時(shí)，需要對(duì)DNADNA進(jìn)行染色，進(jìn)行染色，DNADNA染料（染料（PIPI）與）與DNADNA結(jié)合具有特異結(jié)合具有特異性，有一定量效關(guān)系，即性，有一定量效關(guān)系，即DNADNA含量的多少與熒光含量的多少與熒光染料的結(jié)合量成正比，熒光強(qiáng)度與染料的結(jié)合量成正比，熒光強(qiáng)度與DNADNA吸收熒光吸收熒光分子多少成正比。分子多少成正比。FCMFCM分析一個(gè)分析一個(gè) 細(xì)胞群周期與細(xì)胞群周期與DNADNA倍倍 體時(shí)，將體時(shí)，將DNADNA含量

9、直含量直 方圖分為三部分，方圖分為三部分， 即即G0/G1G0/G1、S S、G2/MG2/M 三個(gè)細(xì)胞峰。三個(gè)細(xì)胞峰。G2/M(4C)G0/G1(2C) S(2C4C)G2/M(4C)G0/G1(2C) S(2C4C)G2/M(4C) 當(dāng)人體癌變或者具有惡性潛能的癌前病變時(shí)，當(dāng)人體癌變或者具有惡性潛能的癌前病變時(shí)，在其發(fā)生、發(fā)展過程中可伴隨有細(xì)胞在其發(fā)生、發(fā)展過程中可伴隨有細(xì)胞DNADNA倍體及倍體及S S期的改變（異倍體）期的改變（異倍體） 惡性腫瘤細(xì)胞增殖周期的判斷：惡性腫瘤細(xì)胞增殖周期的判斷： S10S10、G2/M15G2/M15或或S20S20、G2/M5G2/M5CD3+CD3+

10、CD4+CD3+CD8+ T淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞（CD3+）淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞（CD19+） NK細(xì)胞細(xì)胞（CD16+56）+NKNK細(xì)胞細(xì)胞: :CD(16+56)CD(16+56)+ +/CD3/CD3- -B B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞: :CD19CD19+ +/CD3/CD3- -NK+/CD3-CD（16+56）+/CD3+（T-cell）CD19+/CD3+（T-cell）CD19+/CD3-、淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞T淋巴細(xì)胞（淋巴細(xì)胞（CD3+）CD3+CD8-（CD4+）IFN-rIL-4PIPI單染色法單染色法Annexin VAnnexin VPIPI雙染法。雙染法。TU

11、NELTUNEL法法機(jī)械損傷細(xì)胞：機(jī)械損傷細(xì)胞： Annexin V -/PI+Annexin V -/PI+ 晚期凋亡、壞死細(xì)晚期凋亡、壞死細(xì)胞：胞：Annexin V Annexin V +/PI+/PI+早期凋亡細(xì)胞：早期凋亡細(xì)胞： Annexin V +/PI-Annexin V +/PI-活細(xì)胞：活細(xì)胞： Annexin V -/PI-Annexin V -/PI-FCMFCM的液流系統(tǒng)（如的液流系統(tǒng)（如何形成單個(gè)細(xì)胞流）何形成單個(gè)細(xì)胞流）樣本管樣本管鞘液管鞘液管羊抗兔羊抗兔兔抗小鼠兔抗小鼠 小鼠小鼠直直 標(biāo)標(biāo)間間 標(biāo)標(biāo)CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+ T淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞（CD3+）淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞（CD19+） NK細(xì)胞細(xì)胞（CD16+56）+NKNK細(xì)胞細(xì)胞: :CD(16+56)CD(16+56)+ +/CD3/CD3- -B B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞: :CD19CD19+ +/CD3/CD3- -NK+/CD3-CD（16+56