真核轉染穩(wěn)定篩選標記及原理

1、LOGO真核細胞穩(wěn)定轉染篩選標記真核細胞穩(wěn)定轉染篩選標記及原理及原理 小組：周四班二組小組：周四班二組 組員：薛瑩超（報告者）組員：薛瑩超（報告者） 滕達滕達 曾欣宜曾欣宜 席杰席杰 賴惠英賴惠英 鄧宇星鄧宇星 外源基因表達的三個概念外源基因表達的三個概念 通過生化或者物理方法將目的基因導入真核細胞中 。分類分類 轉導轉導 通過病毒介導，用基因組中攜帶有克隆目的片斷的病毒來感染靶細胞。 轉化 通過生化或者物理方法將目的基因導入原核細胞中 。常用的真核表達系統(tǒng)常用的真核表達系統(tǒng)v酵母表達系統(tǒng)v絲狀真菌表達系統(tǒng)v昆蟲表達系統(tǒng)v哺乳動物表達系統(tǒng)轉轉 染染 方方 法法 理想的細胞轉染方法，應該具有轉染

2、效率高、細胞毒性小等特點。病毒介導的轉染技術，是目前轉染效率最高、細胞毒性很低，但準備程序復雜，對細胞類型有很強的選擇性很難普及。非病毒介導的轉染技術中，以陽離子非脂性物質為主的混合物配方轉染效率最高。該類轉染具有廣譜、細胞毒性小、性能穩(wěn)定等特點，且不受培養(yǎng)液中的血清和抗生素的干擾，比脂質體介導的轉染方法更方便。轉染后的表達1.瞬時表達 質粒轉染到細胞中，一部分轉運進入細胞核，進行轉錄輸出mRNA進行蛋白質合成。幾天內大部分的質粒都會被降解或傳代而稀釋。一周以后幾乎檢測不到。轉染的質粒不整合到染色體上，出現短暫的（24-96h）高水平表達，依賴于質粒純度、濃 度和轉染效率。2.穩(wěn)定表達 轉染的

3、質粒DNA整合到染色體上可以持續(xù)存在，轉染的細胞可以長期表達。 整合的概率比較小，要獲得穩(wěn)定轉染的細胞株需要篩選標記共同轉染，通過選擇壓力維持表達穩(wěn)定。需要長時間的抗性選擇培養(yǎng)。酵母表達系統(tǒng)常用的選擇性標記酵母表達系統(tǒng)常用的選擇性標記v營養(yǎng)缺陷性酵母 trp1-，ura3-，his3-，leu2-， lys2-。v顯性選擇標記，用于野生型酵母菌的轉染。G418篩選。哺乳動物細胞遺傳性標記胸苷激酶基因（tk）選擇系統(tǒng)二氫葉酸還原酶基因（dhfr）選擇系統(tǒng)黃嘌呤-鳥嘌呤轉移酶基因（HGPRT）選擇系統(tǒng)新霉素抗性基因（neo）選擇系統(tǒng)氯霉素乙酰轉移酶基因（cat）選擇系統(tǒng)潮霉素抗性選擇系統(tǒng)細胞內細胞

4、內DNA的合成途徑的合成途徑細胞的細胞的DNA合成有主要途徑和旁路途徑兩種方式合成有主要途徑和旁路途徑兩種方式1.主要途徑就是利用谷氨酰胺或單磷酸脲甘酸在二主要途徑就是利用谷氨酰胺或單磷酸脲甘酸在二氫葉酸還原酶的催化下合成氫葉酸還原酶的催化下合成DNA2.旁路途徑則是利用次黃嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤旁路途徑則是利用次黃嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)或胸腺嘧啶激酶或胸腺嘧啶激酶（TK）的催化下補救合成）的催化下補救合成DNA。胸苷激酶基因選擇基因選擇系統(tǒng)系統(tǒng)v 遺傳標記：遺傳標記：TKv 編碼產物：編碼產物：胸苷激酶胸苷激酶v 篩選藥物：篩選藥物：HA

5、T選擇法選擇法 H：次黃嘌呤；補救合成核苷酸的原料：次黃嘌呤；補救合成核苷酸的原料 A：氨基喋呤；抑制四氫葉酸合成：氨基喋呤；抑制四氫葉酸合成 T：胸苷；補救合成：胸苷；補救合成dTTP的原料的原料v 作用機理：作用機理：TK是核苷酸補救合成途徑的一個關鍵是核苷酸補救合成途徑的一個關鍵酶酶二氫葉酸還原酶（DHFR）基因選擇系統(tǒng)v 遺傳標記：遺傳標記：DHFR：真核細胞生物合成核苷酸的關：真核細胞生物合成核苷酸的關鍵酶，功能是催化二氫葉酸還原成四氫葉酸鍵酶，功能是催化二氫葉酸還原成四氫葉酸v 編碼產物：編碼產物：二氫葉酸還原酶（二氫葉酸還原酶（DHFR）v 篩選藥物：篩選藥物：葉酸類似物葉酸類似

6、物氨基喋呤或氨甲喋呤氨基喋呤或氨甲喋呤v 作用機理：作用機理：dhfr缺陷型細胞缺陷型細胞因不能合成核酸而因不能合成核酸而死亡，而導入了外源基因的細胞成功存活，并且死亡，而導入了外源基因的細胞成功存活，并且在氨甲喋呤的選擇壓力下大量表達蛋白。在氨甲喋呤的選擇壓力下大量表達蛋白。黃嘌呤黃嘌呤-鳥嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖磷酸核糖轉移酶（轉移酶（XGPRT）基因基因選擇系統(tǒng)選擇系統(tǒng)v 遺傳標記：遺傳標記：XGPRTv 編碼產物：編碼產物：黃嘌呤黃嘌呤-鳥嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖磷酸核糖轉移酶轉移酶v 篩選藥物：篩選藥物：霉酚酸霉酚酸v 作用機理：作用機理：XGPRT合成合成GMP。 哺乳動物細胞無哺乳動物細胞無

7、XGPRT酶，不能利用黃嘌呤形成黃嘌酶，不能利用黃嘌呤形成黃嘌呤磷酸（呤磷酸（XMP），但有鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（），但有鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT），），可催化黃嘌呤形成次黃嘌呤磷酸（可催化黃嘌呤形成次黃嘌呤磷酸（IMP）。哺乳動物細胞可）。哺乳動物細胞可通過通過IMP生成生成GMP。當用。當用IMP脫氫酶抑制劑霉酚酸，抑制了脫氫酶抑制劑霉酚酸，抑制了GMP的合成，使細胞失去合成的合成，使細胞失去合成DNA能力而死亡。能力而死亡。 將含將含XGPRT基因的重組體導入真核細胞后，能表達基因的重組體導入真核細胞后，能表達XGPRT酶，可在含有黃嘌呤的培養(yǎng)基中通過酶，可在含有黃嘌呤的培養(yǎng)基中

8、通過XMP中間體補中間體補救合成救合成GMP，使，使DNA合成正常進行合成正常進行。加入霉酚酸后，陽性克加入霉酚酸后，陽性克隆因不受霉酚酸的抑制而存活，而陰性細胞則受霉酚酸的抑隆因不受霉酚酸的抑制而存活，而陰性細胞則受霉酚酸的抑制而死亡，以此來篩選陽性細胞。制而死亡，以此來篩選陽性細胞。新霉素抗性基因選擇系統(tǒng)v 遺傳標記遺傳標記：APHv 編碼產物編碼產物：氨基糖苷磷酸轉移酶：氨基糖苷磷酸轉移酶v 篩選藥物篩選藥物：新霉素，：新霉素，即即G418一種氨基糖苷類抗生素，一種氨基糖苷類抗生素，影響影響80S核糖體功能核蛋白質的合成核糖體功能核蛋白質的合成v 作用機理作用機理：新霉素抗性基因編碼新霉素抗性基因編碼3磷酸轉移酶降解磷酸轉移酶降解G418。適用于所有的真核細胞適用于所有的真核細胞氯霉素乙酰轉移酶（CAT）基因選擇系統(tǒng)v 遺傳標記遺傳標記：CAT，大腸桿菌大腸桿菌Tn9轉座子編碼的催化氯霉素轉座子編碼的催化氯霉素 乙?；磻牡鞍踪|乙酰化反應的蛋白質v 編碼產物編碼產物：氯霉素乙酰轉移酶氯霉素乙酰轉移酶v 篩選藥物篩選藥物：氯霉素：氯霉素v 作用機理作用機理：真核細胞缺乏真核細胞缺乏CAT，將，將CAT作為報告基因作為報告基因與目與目的基因一起導入到真核細胞，可在加入氯霉素的培養(yǎng)基中的基因一起導入到真核細胞，可在加入氯霉素的培養(yǎng)