xiap原核重組蛋白的表達(dá)和純化ppt課件

1、xiap原核重組蛋白的表達(dá)和純化報(bào)告人：周光現(xiàn)日期：09-06-01 簡介 資料和方法 結(jié)果 討論簡介X連鎖凋亡抑制蛋白X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP是一類細(xì)胞內(nèi)源性凋亡抑制蛋白，它特異性的抑制caspase活性，經(jīng)過多種途徑抑制細(xì)胞凋亡?？梢宰鳛槟[瘤檢測的一個(gè)目的也可以作為治療和預(yù)防腫瘤的一個(gè)靶標(biāo)?？梢宰鳛槟[瘤檢測的一個(gè)目的也可以作為治療和預(yù)防腫瘤的一個(gè)靶標(biāo)。 本文經(jīng)過pET151-XIAP載體在大腸桿菌中表達(dá)，Ni-NTA親和層析柱純化。表達(dá)和純化優(yōu)化初始OD600 0.6、溫度30、IPTG濃度0.5ug/ml、誘導(dǎo)時(shí)間4h時(shí)。純

2、化過程中，添加兩個(gè)不同pH的洗脫液pH 5.4、pH 4.9。 XIAP構(gòu)造和功能表示圖資料和方法 資料 實(shí)驗(yàn)用質(zhì)粒pET151-XIAP、菌種JMY109、Rosseta為實(shí)驗(yàn)室保管 主要試劑 誘導(dǎo)培育：LB培育基、氨芐、異丙基-硫代半乳糖苷IPTG 蛋白純化：尿素、Tris、NaH2PO4 SDS-PAGE電泳：30%丙烯酰胺、 1.5mol/L Tris(pH8.8)、10%SDS、 10%過硫酸銨 、TEMED 、1mol/L Tris(pH6.8)原核載體構(gòu)建pET151轉(zhuǎn)化Rossate小型誘導(dǎo)在最正確誘導(dǎo)條件下大型誘導(dǎo)200mlIPTG濃度誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)時(shí)間細(xì)胞破碎蛋白純化蛋白純化

3、條件優(yōu)化SDS-PAGE檢測實(shí)驗(yàn)技術(shù)道路圖 pET151原核載體構(gòu)建 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化 1.感受態(tài)細(xì)胞制備CaCl2 2.轉(zhuǎn)化 誘導(dǎo)條件優(yōu)化IPTG濃度、時(shí)間、OD、誘導(dǎo)溫度 蛋白純化條件優(yōu)化 1.Ni-NTA柱規(guī)范方法洗脫 2.透析結(jié)果：一、表達(dá)優(yōu)化1.初始OD值的影響 從圖中可以看出，當(dāng)OD為0.6時(shí)，目的蛋白表達(dá)最多。而且隨著OD值的繼續(xù)增大，蛋白表達(dá)量有下降，但是不明顯。闡明在溫度37，IPTG濃度5ug/ml，誘導(dǎo)時(shí)間4h的情況下，誘導(dǎo)前的OD值在0.6-1.0范圍內(nèi)時(shí)，目的蛋白表達(dá)量都較高。2.誘導(dǎo)溫度 OD值為0.6,IPTG濃度為IPTG濃度5ug/ml，誘導(dǎo)時(shí)間4h的情況下，30

4、誘導(dǎo)的結(jié)果明顯好于其他溫度，遺憾的是目的蛋白一直在沉淀中，沒有成為可溶性蛋白，即使是在低溫下誘導(dǎo)。3. IPTG濃度 溫度30，初始OD600 0.6，誘導(dǎo)時(shí)間4h的情況下。IPTG濃度低于0.5ug/ml是目的蛋白表達(dá)量較少，而高于0.5ug/ml時(shí)，目的蛋白表達(dá)量高，而且隨著IPTG濃度的增大，對目的蛋白表達(dá)量的影響不大?？梢猿醪酱_定IPTG濃度為0.5ug/ml是較為經(jīng)濟(jì)和高效的誘導(dǎo)濃度。同樣目的蛋白依然存在于沉淀中。4.誘導(dǎo)時(shí)間 溫度30，初始OD600 0.6，IPTG濃度0.5ug/ml時(shí)，設(shè)計(jì)不同的誘導(dǎo)時(shí)間梯度可以看出，誘導(dǎo)時(shí)間在4-8h時(shí)，目的蛋白表達(dá)較高，而且差別不大。當(dāng)誘導(dǎo)

5、時(shí)間到達(dá)10h時(shí)，蛋白表達(dá)量下降。這能夠是由于菌種中某種酶降解該蛋白的緣故?？偨Y(jié)： 經(jīng)過以上4個(gè)實(shí)驗(yàn)，可以初步確定，溫度30，初始OD600 0.6，IPTG濃度0.5ug/ml，誘導(dǎo)時(shí)間4h,是誘導(dǎo)XIAP原核重組蛋白表達(dá)的最經(jīng)濟(jì)最有效地條件。二、蛋白純化條件優(yōu)化Ni-NTA柱規(guī)范方法洗脫跑膠檢測M：Marker A：蛋白原液 B：穿透液 W：清洗液 5.9：洗脫液pH4.5:洗脫液pHNi-NTA柱改良方法洗脫后SDS-PAGE膠檢測M：Marker A：蛋白原液 B：穿透液 W：清洗液 5.9：洗脫液pH4.5:洗脫液pHNi-NTA柱改良方法洗脫后SDS-PAGE膠檢測添加了兩個(gè)PHM

6、：Marker A：蛋白原液 B：穿透液 W：清洗液 5.9：洗脫液pH4.5:洗脫液pH 5.4、4.9洗脫液pH 總結(jié)：在添加兩個(gè)不同pH洗脫液后，發(fā)如今洗脫液pH為4.9、4.5時(shí)洗脫下來的目的蛋白較規(guī)范方法多。但是純化后的蛋白依然有兩條雜帶，這有一條能夠是His標(biāo)簽蛋白，另外有能夠是由于與目的蛋白等電點(diǎn)很接近，沒法用不同梯度的pH將其分別。討論：1.原核表達(dá)操作簡單、生長周期短，能在短時(shí)間內(nèi)表達(dá)大量目的蛋白。但不能進(jìn)展內(nèi)含子的自我剪接，表達(dá)的蛋白質(zhì)不能進(jìn)展翻譯后加工，不能進(jìn)展正確折疊，使表達(dá)產(chǎn)物量少，活性低。2.原核表達(dá)中應(yīng)該留意的事項(xiàng)：1選擇適宜的載體 2選擇適宜的菌種3選擇標(biāo)簽4選

7、擇適宜的誘導(dǎo)條件3.怎樣提高可溶蛋白的含量4.原核生物表達(dá)的外源蛋白純化結(jié)論： 1. 原核重組蛋白的最正確誘導(dǎo)條件為：初始OD600 0.6、溫度30、IPTG濃度0.5ug/ml、誘導(dǎo)時(shí)間4h。 2. 在純化過程中，添加兩個(gè)不同pH的洗脫液，可以顯著添加純化后目的蛋白的含量。Thanks！Caspases 存在于胞質(zhì)溶膠中的構(gòu)造上相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶，它們的一個(gè)重要共同點(diǎn)是特異地?cái)嚅_天冬氨酸殘基后的肽鍵。 可以高度選擇性地切割某些蛋白質(zhì)，這種切割只發(fā)生在少數(shù)通常只需1個(gè)位點(diǎn)上，主要是在構(gòu)造域間的位點(diǎn)上，切割的結(jié)果或是活化某種蛋白，或使某種蛋白失活，但從不完全降解一種蛋白質(zhì)。Caspases現(xiàn)已確定至少存在11種caspase： 這些caspases中，caspase 1和caspase 11，以及能夠還有caspase 4被以為不直接參與凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，它們主要參與白介素前體的活化；而caspase 2，caspase 8，caspase 9和caspase 10參與細(xì)胞凋亡的起始；參與細(xì)胞凋亡執(zhí)行的那么是caspase 3，caspase 6和caspase 7，其中caspase 3和7具有相近的底物和抑制劑特異性，它們降解PARP，DFF-45DNA fragmentati