生物化學(xué)實驗：米氏常數(shù)_第1頁
生物化學(xué)實驗：米氏常數(shù)_第2頁
生物化學(xué)實驗：米氏常數(shù)_第3頁
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文檔簡介

1、蔗糖酶米氏常數(shù)的測定操作方法蔗糖酶米氏常數(shù)的測定操作方法1）將離子交換柱層析得的）將離子交換柱層析得的E3稀釋稀釋(pH4.6 HAC緩沖液緩沖液) )至至20U/mL20U/mL，共共16ml。2）取試管取試管8支，按支，按0-7編號，編號，0為對照管。為對照管。3）按表）按表1將蔗糖液、醋酸緩沖液分別加入試管中，于將蔗糖液、醋酸緩沖液分別加入試管中，于35水浴中保溫水浴中保溫（使（使溫度平衡，以下同）溫度平衡，以下同）10min。4）取約取約16ml酶液，放入酶液，放入同一水浴中保溫約同一水浴中保溫約10min。5）于各管中依次按于各管中依次按同樣時間間隔同樣時間間隔加入已保溫過的酶液加入

2、已保溫過的酶液2ml，記時，立即搖記時，立即搖勻。在勻。在35水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)3min。6）按按同樣次序和時間間隔同樣次序和時間間隔，加入，加入0.5ml的的1mol/L NaOH，搖勻，終止反應(yīng)。搖勻，終止反應(yīng)。7）吸取反應(yīng)混合物）吸取反應(yīng)混合物0.5ml，加入盛有加入盛有3ml DNS試劑和試劑和1.5ml去離子水的血糖去離子水的血糖管中，放入沸水中加熱管中，放入沸水中加熱5min，冷卻后稀釋定容至冷卻后稀釋定容至25ml，搖勻后，測定搖勻后，測定A540值。值。反應(yīng)物反應(yīng)物活力測定活力測定數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理管管號號0.1mol/L蔗糖液蔗糖液pH4.6buffer酶液酶液（ml

3、）1mol/LNaOH(ml)吸取吸取反應(yīng)物反應(yīng)物(ml)DNS試劑試劑(ml)水水(ml)A540底物底物濃度濃度(S)1/S1/A002.002.000.50.531.5010.41.602.000.50.531.50.01010020.51.502.000.50.531.50.01258030.61.402.000.50.531.50.01566.740.81.202.000.50.531.50.025051.01.002.000.50.531.50.0254061.50.502.000.50.531.50.037526.772.00.002.000.50.531.50.05020數(shù)據(jù)處理：數(shù)據(jù)處理： 以以A A值作為相對反應(yīng)速度，以值作為相對反應(yīng)速度，以1/1/S S為橫坐為橫坐標(biāo)，

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