第一次課現(xiàn)代生物技術(shù)綜合大實驗

1、現(xiàn)代藥學(xué)生物技術(shù)綜合大實驗基因克隆基因克隆基因表達(dá)基因表達(dá)重組蛋白重組蛋白純化純化鑒定鑒定基因克隆與重組子構(gòu)建基因克隆與重組子構(gòu)建基因表達(dá)與重組蛋白純化基因表達(dá)與重組蛋白純化多克隆抗體制備與鑒定多克隆抗體制備與鑒定第一部分基因克隆與重組子構(gòu)建參照藥學(xué)分子生物學(xué)第八章基因克隆與重組子構(gòu)建路線圖pET-28aEGFPpEGFPpEGFP菌株菌株培養(yǎng)培養(yǎng)提取質(zhì)粒提取質(zhì)粒經(jīng)酶切獲得經(jīng)酶切獲得EGFPpET-28a菌菌株株培養(yǎng)培養(yǎng)提取質(zhì)粒提取質(zhì)粒雙酶切雙酶切pET-28aEGFP提取質(zhì)粒、鑒提取質(zhì)粒、鑒定定擴(kuò)大培養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)PCR鑒定鑒定連接、轉(zhuǎn)化連接、轉(zhuǎn)化DH5a a2022-5-54中山大學(xué)藥學(xué)院 王

2、紅勝高壓滅菌法滅菌 概念 滅菌系指培養(yǎng)基、發(fā)酵設(shè)備或其他目標(biāo)物中所有微生物的營養(yǎng)細(xì)胞及其芽胞（或孢子）殺滅或去除，從而達(dá)到無菌的過程； 消毒 是指殺滅病原微生物和其他有害微生物，并不要求清除或殺滅所有微生物（如芽胞等）； 滅菌法 是指預(yù)先用物理方法，徹底消滅掉接觸物品上所附帶的微生物； 消毒法 常指應(yīng)用化學(xué)方法來消滅微生物。2022-5-56中山大學(xué)藥學(xué)院 王紅勝滅菌法 滅菌法所用的物理方法： 器械和應(yīng)用物品可用高溫來滅菌。 電離輻射主要用于藥物如抗生素、激素、類固醇、維生素等，以及塑料注射器和縫線等的滅菌。 紫外線可以殺滅懸浮在空氣中、水中和附于物體表面的細(xì)菌、真菌、支原體和病毒等。但它不能

3、射入食物和衣料、被服等紡織物，故一般常用于室內(nèi)空氣的滅菌。2022-5-57中山大學(xué)藥學(xué)院 王紅勝高壓蒸汽滅菌法的注意事項 無菌包不宜過大，不宜過緊； 液體要保證有透氣孔存在； 布類物品應(yīng)放在金屬類物品上； 高壓蒸汽滅菌效果的監(jiān)測： 第一種是工藝監(jiān)測：根據(jù)安裝在滅菌器上的量器（壓力表、溫度表、計時表）指示滅菌設(shè)備工作正常與否。 第二種是化學(xué)指示監(jiān)測，3M壓力滅菌指示膠帶：此膠帶上印有斜形白色指示線條圖案。在121經(jīng)20分鐘，130經(jīng)4分鐘后，膠帶變色（條紋圖案即顯現(xiàn)黑色斜條）。2022-5-58中山大學(xué)藥學(xué)院 王紅勝基因工程菌 用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達(dá)的菌類細(xì)胞株系一般稱為“工

4、程菌”。 工程菌是采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)加工出來的新型微生物，具有多功能、高效和適應(yīng)性強(qiáng)等特點 如：大 多數(shù)大腸桿菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，用于保護(hù)宿主 DNA 不被相應(yīng)的限制酶所切割。 Dam甲基化酶可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基 Dcm甲基化酶在CCA/TGC序列的第一個胞嘧啶 C-5位置上引入甲基2022-5-510中山大學(xué)藥學(xué)院 王紅勝DH5 是世界上最常用的生物工程菌株之一，特別是在克隆的應(yīng)用，其主要特征為： endA1突變： 使endA (限制性內(nèi)切酶) 無 酶活性，有利于質(zhì)粒的穩(wěn)定。 (lacZ)M15突變： 其表達(dá)產(chǎn)物與pUC載體編碼的-半乳糖苷酶

5、氨基端實現(xiàn)互補，可用于藍(lán)白斑篩選。 recA 突變： 限制DNA重組，使導(dǎo)入的DNA穩(wěn)定。2022-5-511中山大學(xué)藥學(xué)院 王紅勝互補 lacZ基因的突變體M15質(zhì)粒（缺失氨基酸殘基11到41）是沒有野生型lacZ基因產(chǎn)物那種分解X-gal能力的。 但如果在M15突變體的抽取物中加入-半乳糖苷酶的第3至第92氨基酸殘基的肽段（肽）則能恢復(fù)M15分解X-gal，而顯示藍(lán)色的能力。 這樣一種基因內(nèi)互補現(xiàn)象稱做互補（-complementation）。 白色克隆為陽性重組克隆，藍(lán)色的為載體自連的克隆2022-5-5中山大學(xué)藥學(xué)院 王紅勝12BL21(DE3)菌株 適合于重組蛋白表達(dá)的常用菌株 基因

6、組中整合有l(wèi)噬菌體 T7噬菌體RNA聚合酶基因位于噬菌體DE3區(qū)，表達(dá)受控于lacUV5啟動子的 用于以T7 RNA聚合酶為表達(dá)系統(tǒng)的高效外源基因的蛋白表達(dá)宿主。2022-5-513中山大學(xué)藥學(xué)院 王紅勝基因工程用載體 載體(vector, vehicle) 的本意就是媒介體，基因工程上的載體是能將分離或合成的基因?qū)爰?xì)胞的DNA分子。 基因工程中有三種主要類型的載體質(zhì)粒DNA、病毒DNA、科斯質(zhì)粒。2022-5-515中山大學(xué)藥學(xué)院 王紅勝載體必須具備的幾個性能1.分子較小，可攜帶比較大的DNA片段。 2.能獨立于染色體而進(jìn)行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。 3.要有盡可能多種限制酶的切割位點，但

7、每一種限制酶又要最少的切割位點（多克隆位點 multiple cloning sites ，MCS） 。 4.有適合的標(biāo)記，易于選擇。 5.有時還要求載體要能啟動外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，并且盡可能是高效的表達(dá)。 6.從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實驗室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等等。2022-5-516中山大學(xué)藥學(xué)院 王紅勝載體的分類 根據(jù)功能 克隆載體: 克隆一個基因或DNA片斷 表達(dá)載體: 用于一個基因的蛋白表達(dá) 整合載體: 把一個基因插入到染色體組中2022-5-517中山大學(xué)藥學(xué)院 王紅勝 根據(jù)來源： 質(zhì)粒載體 噬菌體載體 柯斯質(zhì)粒載體 真核細(xì)胞表達(dá)載體 其中質(zhì)粒DNA是

8、最常用的載體，但運載能力低，柯斯質(zhì)粒是質(zhì)粒和噬菌體DNA的結(jié)合體，運載能力最高。在這三種類型的基礎(chǔ)上，根據(jù)不同的目的，出現(xiàn)了各種類型的改造載體。2022-5-518中山大學(xué)藥學(xué)院 王紅勝質(zhì)粒（plasmid） 是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。 大小約為數(shù)千堿基對。 常有1 3個抗藥性基因。2022-5-519中山大學(xué)藥學(xué)院 王紅勝質(zhì)粒載體克隆的質(zhì)粒載體克隆的質(zhì)粒載體 允許外源的DNA插入，儲存。 主要用于DNA水平上的操作基因表達(dá)的質(zhì)粒載體基因表達(dá)的質(zhì)粒載體 允許外源DNA的插入、儲存和表達(dá)。 含有啟動子2022-5-520中山大學(xué)藥學(xué)院 王紅勝作為載體的質(zhì)粒都含有三種共同的組分

9、： 復(fù)制基因（replicator，Ori） 選擇性記號（Amp, Kana) 克隆位點(MCS)2022-5-521中山大學(xué)藥學(xué)院 王紅勝大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-28a 是原核基因表達(dá)質(zhì)粒 具有卡那霉素抗性基因 LacI基因序列 LacZ序列 T7聚合酶啟動子 His6標(biāo)簽2022-5-523中山大學(xué)藥學(xué)院 王紅勝2022-5-524中山大學(xué)藥學(xué)院 王紅勝真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP/N32022-5-526中山大學(xué)藥學(xué)院 王紅勝實驗內(nèi)容上午上午1.高壓滅菌1000、200 ul槍頭各1盒，1.5、0.5mlEP管各一盒，玻璃試管10個（分兩包）用報紙或布包好高壓滅菌；2.配制緩沖液配制50TAE 1000ml（1組），各組配制LB液體培養(yǎng)基200ml0.1M Tris-HCl （pH8.5）100ml（2組）。 各組取其1ml+9ml水（10mM Tr