第四章、第二講匯總

1、第四章、第二講第四章、第二講 4.3 4.3 發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)4.4 4.4 發(fā)酵培養(yǎng)基及設(shè)備管道發(fā)酵培養(yǎng)基及設(shè)備管道 滅菌滅菌4.3 發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù) 干熱滅菌法干熱滅菌法 濕熱滅菌法濕熱滅菌法 射線滅菌法射線滅菌法 化學藥劑滅菌化學藥劑滅菌法法 過濾除菌法過濾除菌法 火焰滅菌法火焰滅菌法 培養(yǎng)基滅菌的有關(guān)理論培養(yǎng)基滅菌的有關(guān)理論濕濕熱滅菌原理熱滅菌原理4.4 發(fā)酵培養(yǎng)基及設(shè)備管道滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基及設(shè)備管道滅菌（一）加熱滅菌原理（一）加熱滅菌原理1 1、微生物的熱阻、微生物的熱阻 每一種微生物都有一定的生長溫度范圍；每一種微生物都有一定的生長溫度范圍；

2、當微生物處在最低生長溫度以下，代謝作用幾乎停止，而當微生物處在最低生長溫度以下，代謝作用幾乎停止，而處于休眠狀態(tài)；當溫度超過最高限度時，細胞中原生質(zhì)體和處于休眠狀態(tài)；當溫度超過最高限度時，細胞中原生質(zhì)體和酶的基本成分就發(fā)生不可逆的變性，使微生物死亡。酶的基本成分就發(fā)生不可逆的變性，使微生物死亡。 微生物 相對熱阻大腸桿菌 1細菌芽孢 3106霉菌孢子 2-10病毒及噬菌體 1-5某些微生物對濕熱的相對熱阻（與大腸桿菌比較）不同種類微生物對熱的抵抗力不同。不同種類微生物對熱的抵抗力不同。微生物對熱的抵抗力稱為微生物對熱的抵抗力稱為熱阻（heat resistance）。下面介紹與熱阻相關(guān)的幾個概

3、念1）致死溫度（Death temperature）殺死微生物的極限溫度稱為致死溫度。殺死微生物的極限溫度稱為致死溫度。2）熱力致死時間 (Thermal Death Time; TDT) 在特定條件、特定溫度下，殺死某種微生物在特定條件、特定溫度下，殺死某種微生物所需的最短時間。所需的最短時間。e.g 傷寒桿菌傷寒桿菌58 30min 變形桿菌變形桿菌55 60min2 2、微生物的熱死規(guī)律、微生物的熱死規(guī)律對數(shù)殘留定律對數(shù)殘留定律 微生物的熱死是指微生物的受熱失活，但物理性質(zhì)不變。微生物的熱死是指微生物的受熱失活，但物理性質(zhì)不變。 微生物雖然是一復雜的高分子體系，但受熱死亡是由于微生物雖然

4、是一復雜的高分子體系，但受熱死亡是由于蛋白質(zhì)變性所致。蛋白質(zhì)變性所致。 在一定溫度下，微生物熱死遵循分子反應(yīng)速度理論。在一定溫度下，微生物熱死遵循分子反應(yīng)速度理論。對數(shù)殘留定律的概念： 數(shù)學表達式：數(shù)學表達式：- dN/d = NN 培養(yǎng)基中活的微生物個數(shù)；培養(yǎng)基中活的微生物個數(shù)； 時間（時間（s）; 比死亡速率比死亡速率（s-1） (死亡速率常數(shù)死亡速率常數(shù))dN/d 微生物的瞬間變化率，即死亡速率微生物的瞬間變化率，即死亡速率 對微生物進行濕熱滅菌時，培養(yǎng)基中的微生物受熱死對微生物進行濕熱滅菌時，培養(yǎng)基中的微生物受熱死亡的速率與殘存的微生物數(shù)量成正比，這就是對數(shù)殘留定亡的速率與殘存的微生物

5、數(shù)量成正比，這就是對數(shù)殘留定律。律。 若開始滅菌（ = 0）時，培養(yǎng)基中活的微生物數(shù)為N0 = 2.303 logN0/N /- dN/d = NlnN/N0 = - 積分積分2.303logN0/N = or = 2.303 lgN0/N /可見滅菌時間取決于污染程度可見滅菌時間取決于污染程度(N(N0 0) )、滅菌程度、滅菌程度（殘留菌數(shù)（殘留菌數(shù)N N）和）和 值值 在培養(yǎng)基中有各種各樣的微生物，不可能逐一加以考慮。在培養(yǎng)基中有各種各樣的微生物，不可能逐一加以考慮。一般只考慮芽孢細菌和細菌的芽孢數(shù)之和作為計算依據(jù)一般只考慮芽孢細菌和細菌的芽孢數(shù)之和作為計算依據(jù)。 滅菌程度，即殘留菌數(shù)，

6、如果要求完全徹底滅菌，即滅菌程度，即殘留菌數(shù)，如果要求完全徹底滅菌，即N = N = 0 0，則，則 為為，上式無意義，事實上也不可能。，上式無意義，事實上也不可能。 一般取一般取N = 0.001N = 0.001，即，即10001000次滅菌中有次滅菌中有1 1 次失敗。次失敗。例： 有一發(fā)酵罐內(nèi)裝有一發(fā)酵罐內(nèi)裝40m40m3 3培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基，在121121溫度下進行實罐滅溫度下進行實罐滅菌。原污染程度為每菌。原污染程度為每mlml有有2 210105 5個耐熱細菌芽孢，個耐熱細菌芽孢， 121121時滅時滅菌速度常數(shù)為菌速度常數(shù)為1.8min1.8min1 1。求滅菌失敗幾率為。求滅

7、菌失敗幾率為0.0010.001時所需的滅時所需的滅菌時間。菌時間。解：解： N0 = 40106 2105 = 8 1012 (個個) N = 0.001; = 1.8 (min1) =2.303 lgN0N=2.3031.8lg(81015)= 20.34 (min)3 3、死亡速率常數(shù)、死亡速率常數(shù) （比死亡速率）（比死亡速率） 死亡速率死亡速率 常數(shù)常數(shù) 是微生物耐熱性的一種特征，它隨是微生物耐熱性的一種特征，它隨微生物種類和滅菌溫度而異。微生物種類和滅菌溫度而異。 相同溫度下，相同溫度下， 值越小，則此微生物越耐熱。值越小，則此微生物越耐熱。 在在121121，細菌芽孢的，細菌芽孢的

8、 值約為值約為1 1minmin-1 -1, ,而營養(yǎng)細胞的而營養(yǎng)細胞的 值值為為10-1010-101010minmin-1 -1。細菌芽孢名稱值 min-1枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌FS5230FS5230硬脂嗜熱芽孢桿菌硬脂嗜熱芽孢桿菌FS1518FS1518硬脂嗜熱芽孢桿菌硬脂嗜熱芽孢桿菌FS617FS617產(chǎn)氣梭狀芽孢桿菌產(chǎn)氣梭狀芽孢桿菌PA3679PA36793.8-2.63.8-2.60.770.772.92.91.81.8121某些細菌芽孢的值4、培養(yǎng)基滅菌溫度的選擇 培養(yǎng)基滅菌過程中，除微生物被殺死外，還伴隨著培養(yǎng)基培養(yǎng)基滅菌過程中，除微生物被殺死外，還伴隨著培養(yǎng)基成分被破壞，

9、在加熱下氨基酸、維生素等受破壞。成分被破壞，在加熱下氨基酸、維生素等受破壞。 培養(yǎng)基滅菌時，必須選擇既能達到滅菌目的，又能使培養(yǎng)培養(yǎng)基滅菌時，必須選擇既能達到滅菌目的，又能使培養(yǎng)基成分破壞減至最少的條件?；煞制茐臏p至最少的條件。 滅菌過程微生物死亡屬于一級反應(yīng)動力學類型（從對數(shù)殘滅菌過程微生物死亡屬于一級反應(yīng)動力學類型（從對數(shù)殘留定律表達式可知）。留定律表達式可知）。 在其它條件不變時，比死亡速率在其它條件不變時，比死亡速率 與溫度的關(guān)系可用阿侖尼與溫度的關(guān)系可用阿侖尼烏斯方程式表示。烏斯方程式表示。Svante August Arrhenius was a Swedish physical

10、 chemist best known was a Swedish physical chemist best known for his theory that electrolytes, certain for his theory that electrolytes, certain substances that dissolve in water to yield a substances that dissolve in water to yield a solution that conducts electricity, are solution that conducts e

11、lectricity, are separated, or dissociated, into electrically separated, or dissociated, into electrically charged particles, or ions, even when there is charged particles, or ions, even when there is no current flowing through the solution. In no current flowing through the solution. In 1903 he was

12、awarded the Nobel Prize for 1903 he was awarded the Nobel Prize for Chemistry.Chemistry. = A eR TEArrhenius equationA A 比例常數(shù)；比例常數(shù)；E E 殺死細菌所需的活化能，殺死細菌所需的活化能，( ( E)E) （4.18 J/mol4.18 J/mol）; ;T T 絕對溫度，絕對溫度，(K)(K)R R 氣體常數(shù)，氣體常數(shù)，1.9781.9784.18 J/(molK)4.18 J/(molK)e 2.71 (exp)e 2.71 (exp) = A eR TElg = +

13、 lgAE2.303RT以以lg lg 對對1/T1/T作圖，得一直線，其斜率為作圖，得一直線，其斜率為-E/2.303R-E/2.303R，截距為，截距為lgAlgA，從斜率和截距科求得從斜率和截距科求得A A和和E E值。值。1/Tlg 截距 = lgA斜率 = E/2.303R培養(yǎng)基成分受熱破壞是化學分解反應(yīng)，為一級動力學反應(yīng)：培養(yǎng)基成分受熱破壞是化學分解反應(yīng)，為一級動力學反應(yīng)：- dC / d = CC 對熱不穩(wěn)定物質(zhì)的濃度, (mol/L); 分解速率常數(shù) （s1）； 分解反應(yīng)時間 （s） 隨反應(yīng)物質(zhì)種類和溫度不同隨反應(yīng)物質(zhì)種類和溫度不同在化學反應(yīng)中，其他條件不變，在化學反應(yīng)中，其他

14、條件不變， 和溫度的關(guān)系也可用和溫度的關(guān)系也可用阿阿侖尼烏斯方程表示：侖尼烏斯方程表示： = A eR TEA A 比例常數(shù)；比例常數(shù)；E E 分解活化能，分解活化能，( ( E) E) （4.18 J/mol4.18 J/mol）; ;T T 絕對溫度，絕對溫度，(K)(K)R R 氣體常數(shù)，氣體常數(shù)，1.9781.9784.18 J/(molK)4.18 J/(molK)e 2.71 (exp)e 2.71 (exp) 1= A eR T1E 2= A eER T2相除取對數(shù)相除取對數(shù)ln 2 1= E 1 1R T1 T2 在滅菌時，當溫度變化，菌死亡速率常數(shù)在滅菌時，當溫度變化，菌死亡

15、速率常數(shù) 和培養(yǎng)基成分破壞速率常數(shù)和培養(yǎng)基成分破壞速率常數(shù) 都變化。都變化。溫度由溫度由T T1 1升高到升高到T T2 2， 值分別為：值分別為：同樣，滅菌時培養(yǎng)基成分的破壞也可得類似關(guān)系：同樣，滅菌時培養(yǎng)基成分的破壞也可得類似關(guān)系：ln 2 1 = R T1 T2E 1 1ln( 2 / 1)ln( 2 / 1)EE上面兩式相除，得上面兩式相除，得由于滅菌的E大于培養(yǎng)基成分分解的E名稱E (J/mol)葉酸葉酸泛酸泛酸維生素維生素B12B12維生素維生素B1B1嗜熱脂肪芽孢桿菌嗜熱脂肪芽孢桿菌枯草桿菌枯草桿菌肉毒梭菌肉毒梭菌70.370.387.987.996.796.792.192.12

16、83283318318343343因此ln 2/ 1ln 2/ 1 即隨著溫度的上升，滅菌的速度常數(shù)的增加倍數(shù)大于培養(yǎng)即隨著溫度的上升，滅菌的速度常數(shù)的增加倍數(shù)大于培養(yǎng)基成分破壞的增加倍數(shù)?；蛘哒f，當滅菌溫度上升時，微生基成分破壞的增加倍數(shù)?；蛘哒f，當滅菌溫度上升時，微生物殺滅速度的上升超過培養(yǎng)基成分破壞的速度。物殺滅速度的上升超過培養(yǎng)基成分破壞的速度。 根據(jù)這一理論，培養(yǎng)基滅菌采用高溫短時間的方法，有利于減少營養(yǎng)成分的破壞。 滅菌溫度/ 滅菌時間/min 維生素B1破壞量/%100 400 99.3110 36 67115 15 50120 4 27130 0.5 8145 0.08 215

17、0 0.01 1（二）影響培養(yǎng)基滅菌的主要因素（二）影響培養(yǎng)基滅菌的主要因素1、微生物熱阻 （前述）2、pH 微生物在微生物在pH6.0pH6.08.08.0范圍內(nèi)耐熱性最大范圍內(nèi)耐熱性最大 pH pH低于低于6.06.0時，氫離子極易滲入微生物細胞，從而改時，氫離子極易滲入微生物細胞，從而改變細胞的生理反應(yīng)而促進其死亡，故培養(yǎng)基酸度愈高，變細胞的生理反應(yīng)而促進其死亡，故培養(yǎng)基酸度愈高，則所需的殺菌時間愈短。則所需的殺菌時間愈短。影響培養(yǎng)基滅菌的主要因素（影響培養(yǎng)基滅菌的主要因素（continued） 溫度 孢子數(shù) 滅菌時間 (min) () (個/ml)pH=6.1 5.3 5.0 4.7

18、4.5120 10000 8 7 5 3 3 115 10000 25 25 16 13 13110 10000 70 65 35 30 24100 10000 740 720 180 150 150 pH對滅菌時間的影響影響培養(yǎng)基滅菌的主要因素（影響培養(yǎng)基滅菌的主要因素（continued）3、菌的濃度濃度越高，所需滅菌時間越長濃度越高，所需滅菌時間越長例如： 如肉毒梭狀芽孢桿菌，在105濕熱滅菌時間芽孢桿菌數(shù)芽孢桿菌數(shù)/ml /ml 時間時間 (min)(min) 9 910108 8 48 9 48 910106 6 36 936 910104 4 20 20 9 910102 2 14

19、 9 14 9 2 2影響培養(yǎng)基滅菌的主要因素（影響培養(yǎng)基滅菌的主要因素（continued）4、 培養(yǎng)基成分 油脂、糖類及一定濃度的蛋白質(zhì)會增加微生物的耐熱性 因高濃度有機物會環(huán)繞細菌的四周形成一層薄膜，影響熱的因高濃度有機物會環(huán)繞細菌的四周形成一層薄膜，影響熱的傳入。傳入。 而高濃度的鹽類、色素等則削弱其抗性影響培養(yǎng)基滅菌的主要因素（影響培養(yǎng)基滅菌的主要因素（continued）5、泡沫 泡沫中的空氣形成隔熱層，使熱量難以滲透進去殺死其泡沫中的空氣形成隔熱層，使熱量難以滲透進去殺死其中潛伏的微生物；中潛伏的微生物； 易產(chǎn)生泡沫的培養(yǎng)基在滅菌時，可加入少量消泡劑。易產(chǎn)生泡沫的培養(yǎng)基在滅菌時，

20、可加入少量消泡劑。6、顆粒 顆粒小，滅菌容易，顆粒大，滅菌難。顆粒小，滅菌容易，顆粒大，滅菌難。影響培養(yǎng)基滅菌的主要因素（影響培養(yǎng)基滅菌的主要因素（continued）三、分批滅菌三、分批滅菌（實罐滅菌）（一）操作1、在進行培養(yǎng)基滅菌之前，通常應(yīng)先把發(fā)酵罐的 分空氣過濾器滅菌并用無菌空氣吹干。 若已先行空罐滅菌，此步可不進行若已先行空罐滅菌，此步可不進行2、 預熱向夾套或蛇管中通入蒸汽，間接將培養(yǎng)基加熱至向夾套或蛇管中通入蒸汽，間接將培養(yǎng)基加熱至7070左右。左右。作用： 利于糊化；減少冷凝水的生成；減輕噪音利于糊化；減少冷凝水的生成；減輕噪音有的工廠省卻此步；需通過試驗掌握冷凝水的生成量，確

21、保培養(yǎng)基的濃度。3、開啟蒸汽管，向培養(yǎng)基中通入蒸汽，升溫。4、罐壓達1kg/cm2 ( 0.1 MPa)時，按裝在發(fā)酵罐封 頭的接種管、補料管、消泡劑管等應(yīng)排汽。升升 溫溫 階階 段段5、保溫 調(diào)節(jié)好各進汽和排汽閥門，使罐壓和溫度 保持在一穩(wěn)定水平，維持一定時間。在保溫階段，凡進口在培養(yǎng)基液面下的各管道都在保溫階段，凡進口在培養(yǎng)基液面下的各管道都應(yīng)通入蒸汽；在液面上的其余管道則應(yīng)排放蒸汽，應(yīng)通入蒸汽；在液面上的其余管道則應(yīng)排放蒸汽，這樣才能保證滅菌徹底，不留死角。這樣才能保證滅菌徹底，不留死角。保保 溫溫 階階 段段6、保溫結(jié)束后，依次關(guān)閉各排汽、進汽閥；待罐內(nèi) 壓力降至0.5kg/cm2左右

22、時，向罐內(nèi)通入無菌空氣，向夾套或蛇管中通入冷水，使培養(yǎng)基降至所需溫度。通入無菌空氣的作用：加速降溫；保持罐內(nèi)正壓通入無菌空氣的作用：加速降溫；保持罐內(nèi)正壓降降 溫溫 階階 段段ABCD升溫 保溫 降溫小型罐升降溫小型罐升降溫快，可忽略；快，可忽略；但大型罐不可但大型罐不可忽視忽視min（二）（二） 滅菌時間的計算滅菌時間的計算V = V加熱 + V維持 + V冷卻 RT2 (E 2RT)V 加熱加熱 = t 加熱加熱 (T-T0)E2 RT2 (E 2RT)V 冷卻冷卻 = t 冷卻冷卻 (T-T0)E2R R ：氣體常數(shù)；：氣體常數(shù)；= 1. 986 = 1. 986 卡卡/ /克分子克分子

23、KKE E ：耐熱孢子致死的活化能；：耐熱孢子致死的活化能；= 65000 = 65000 卡卡/ /克分子克分子 T T：滅菌維持溫度；：滅菌維持溫度； 121 121 （393 K393 K）T T0 0：開始計算滅菌效果的溫度；：開始計算滅菌效果的溫度；100 100 （373 K373 K）例：1 1）小型發(fā)酵罐在）小型發(fā)酵罐在120120滅菌維持滅菌維持1515分鐘，由分鐘，由100 100 （100100以以下滅菌效果不計）加熱至下滅菌效果不計）加熱至120120的時間為的時間為5 5分鐘，由分鐘，由120120冷卻冷卻到到100100的時間為的時間為3 3分鐘，計算總的滅菌時間。

24、分鐘，計算總的滅菌時間。 1.9863932(65000 21.986 393)V加熱加熱 = 5 = 1.15 (393-373) 650002 1.9863932(65000 21.986 393)V冷卻冷卻 = 5 = 0. 69 (393-373) 650002V = V加熱 + V維持 + V冷卻 = 1.15 + 15 + 0.69 = 16.6 (min) 例 ）如果滅菌條件不變，大罐由如果滅菌條件不變，大罐由加熱到加熱到需分鐘；冷卻至需分鐘；冷卻至的時間為分鐘；求大罐的時間為分鐘；求大罐的維持時間的維持時間。 1.9863932(65000 1.986 393)V加熱加熱 V冷

25、卻冷卻 = （ ） (393-373) 650002.min則大罐維持時間V維持 = V（V加熱V冷卻）16.6 9.2 = 7.4 min在不同規(guī)模的發(fā)酵罐中達到同樣滅菌效果所需時間發(fā)酵罐規(guī)模（升） 維持時間（分） 200 17. 5 500 12. 6 5000 11. 3 50000 8. 8（三）分批滅菌的優(yōu)缺點優(yōu)點：不需專門的滅菌設(shè)備，投資少、設(shè)備簡單、滅菌效果可靠。不需專門的滅菌設(shè)備，投資少、設(shè)備簡單、滅菌效果可靠。對蒸汽的要求較低，一般對蒸汽的要求較低，一般3-4kg/cm3-4kg/cm2 2即可滿足。即可滿足。缺點：在滅菌過程中蒸汽用量變化大，造成鍋爐負荷波動大在滅菌過程中蒸

26、汽用量變化大，造成鍋爐負荷波動大中小型罐經(jīng)常采用四、培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌四、培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌 （連消） 將配制好的培養(yǎng)基在向發(fā)酵罐輸送的同時加熱、保溫和冷卻，進行滅菌。 溫度 （） 時間 （min) 121 24.8 130 4.1 138 0.72 146 0.14 154 0.029 163 0.0061滅菌時間與溫度的關(guān)系（以殺死細菌芽孢為準）（一）連續(xù)滅菌流程1 配料罐 3 連消裝置 4 維持罐 6 冷卻裝置 配料罐（兼作預熱） 輸料泵 連消塔（器）維持罐（管） 冷卻器 發(fā)酵罐連續(xù)滅菌流程1 1、預熱、預熱可在專門的預熱罐，也可用配料罐兼作溫度：一般預熱至一般預熱至7070左右左右預熱的物

27、料用泵泵入連消裝置預熱的物料用泵泵入連消裝置輸料泵： 常用常用 旋渦泵、往復泵、螺桿泵旋渦泵、往復泵、螺桿泵旋渦泵往復泵螺桿泵2 2、加熱、加熱常用連消裝置有三類： 套管式連消器套管式連消器 汽液混合式連消器汽液混合式連消器 噴射式加熱器噴射式加熱器物料泵入加熱器，培養(yǎng)基與蒸汽混合，溫度迅速上升至130140套管式連消塔上疏下密，上疏下密，4545小孔，孔小孔，孔徑徑6 6毫米左右毫米左右培養(yǎng)液流動線速度小于培養(yǎng)液流動線速度小于0.1m/s ; 0.1m/s ; 在管內(nèi)逗留時間在管內(nèi)逗留時間為為15152020秒秒 汽液混合式連消器1 1 噴嘴噴嘴 2 2 吸入口吸入口 3 3 吸入室吸入室

28、4 4混合噴嘴混合噴嘴 5 5 混合段混合段 6 6擴大管擴大管噴射加熱器3 3、保溫、保溫保溫設(shè)備保溫設(shè)備 （維持設(shè)備）（維持設(shè)備） 保溫材料包裹保溫材料包裹 兩種形式： 罐式；管式罐式；管式 1、維持罐連續(xù)滅菌時，關(guān)連續(xù)滅菌時，關(guān)2 2開開1 1；預熱罐中的物料輸送完后，預熱罐中的物料輸送完后，關(guān)關(guān)1 1開開2 2。培養(yǎng)基的平均停留時間 = V / FM-平均停留時間平均停留時間 （s s）V- V- 維持罐的體積維持罐的體積 （ m m3 3）FM - FM - 培養(yǎng)基的流量培養(yǎng)基的流量 （m m3 3/s/s）Note: 培養(yǎng)基在維持罐的流動不可能非常均勻，可能產(chǎn)生溝流，培養(yǎng)基在維持罐的流動不可能非常均勻，可能產(chǎn)生溝流，造成一部分培養(yǎng)基在罐內(nèi)的停留時間少于平均值。為保證造成一部分培養(yǎng)基在罐內(nèi)的停留時間少于平均值。為保證滅菌徹底，在設(shè)計罐式維持器時，通常取平均停留時間的滅菌徹底，在設(shè)計罐式維持器時，通常取平均停留時間的3 35 5倍。倍。經(jīng)驗： 在滅菌溫度為在滅菌溫度為130130時，實際平均時間可取時，實際平均時間可取1010分鐘；在分鐘；在140140時則可取時則可取3 34 4分鐘。分鐘。2、管式維持器在設(shè)計管式維持設(shè)備時，須采用在設(shè)計管式維持設(shè)備時，須采用停留時間分布