工程菌的高效表達和穩(wěn)定性

1、工程菌的高效表達和穩(wěn)定性工程菌的高效表達基因工程的最終目的是在一個合適的系統(tǒng)中，使外源基因高效表達，從而生產有價值的蛋白質產品。表達系統(tǒng)有原核系統(tǒng)和真核系統(tǒng)。第1頁/共35頁原核生物基因表達的特點：（1） 原核生物只有一種RNA聚合酶，識別原核的啟動子，催化所有RNA合成。（2） 原核生物的基因表達是以操縱子為單位。操縱子是數(shù)個相關的結構基因及其調控區(qū)的結合，是一個基因表達的協(xié)同單位。（3） 由于原核生物無核膜，所以轉錄與翻譯是耦聯(lián)的，二者也是連續(xù)進行的。原核生物染色體DNA是裸露的環(huán)型DNA，轉錄成mRNA后，可直接在胞漿中與核糖體結合翻譯成蛋白質。每個核糖體可獨立完成一條鏈的合成，多核糖體

2、可同時在1條mRNA合成多條肽鏈，大大提高了翻譯效率。第2頁/共35頁（4） 原核基因不含內含子（intron），沒有轉錄后加工過程。（5） 原核生物基因表達的控制主要是在轉錄水平。對RNA合成的調控有兩種方式：啟始控制（啟動子控制）和終止控制（衰減子控制）。（6） 在大腸桿菌mRNA的核糖體結合位點上，有一個轉譯啟始密碼子及同16S核糖體RNA3末端堿基互補的序列，即SD序列，真核基因則無此序列。第3頁/共35頁外源基因在原核中表達的關鍵：（1） 通過表達載體將外源基因導入宿主菌，并指導宿主菌的酶系統(tǒng)合成外源蛋白；（2） 外源基因不能帶有intron；（3） 利用原核細胞的強啟動子和SD序列

3、等控制外源基因的表達；（4） 外援基因與表達載體連接后，必須形成正確的開放閱讀框架；（5） 利用宿主菌的調控系統(tǒng)，調節(jié)外源基因的表達，防止表達的外源基因產物對宿主菌的毒害。第4頁/共35頁外源基因在真核細胞中的表達哺乳動物細胞做宿主表達體系的優(yōu)點：（1） 能識別和除去外源基因中的內含子，剪切加工成成熟的mRNA；（2） 表達的蛋白質在翻譯后被加工的機會多（如糖基化），更接近于體內構型；（3） 易被重組DNA轉染，具有遺傳穩(wěn)定性和可重復性；（4） 經轉化的哺乳動物細胞可將表達的產物分泌到培養(yǎng)基中，提純工藝簡單，成本低。第5頁/共35頁影響工程菌發(fā)酵的原因對發(fā)酵影響較大的幾個因素有：培養(yǎng)基的影響；

4、接種量的影響；溫度的影響；溶解氧的影響；誘導時機的影響；誘導表達程序的影響；pH的影響。第6頁/共35頁1.培養(yǎng)基的影響培養(yǎng)基的組成既要提高工程菌的生長速率，又要保持工程菌的穩(wěn)定性，從而使外源基因高效表達。第7頁/共35頁2.接種量的影響接種量的大小影響發(fā)酵的產量和發(fā)酵周期。接種量小，菌體延遲期較長，使菌齡老化，不利于外源基因表達；接種量大，可縮短生長延遲期，菌體迅速繁衍，很快進入對數(shù)生長期，適于表達外源基因；接種量過高，使菌體生長過快，代謝物積累過多，反而會抑制后期菌體的生長。第8頁/共35頁3.溫度的影響溫度對發(fā)酵過程的影響是多方面的。它影響各種酶的反應速度，改變菌體代謝產物的反應方向，影

5、響代謝調控機制。適宜的發(fā)酵溫度是既適合菌體的生長，又適合代謝產物合成的溫度。高溫或低溫都會使發(fā)酵異常，影響終產物的形成并導致減產。溫度還影響蛋白質的活性和包含體的形成。第9頁/共35頁4.溶解氧的影響對于好氧發(fā)酵,溶解氧濃度是重要的參數(shù)。好氧微生物利用溶解于培養(yǎng)液中的氧氣進行呼吸。若能提高溶氧速度和氧的利用率，則能提高發(fā)酵產率。發(fā)酵時，隨溶解氧濃度的下降，細胞生長減慢，發(fā)酵后期下降幅度更大。外源基因的高效表達需要大量的能量，促進細胞的呼吸作用，提高對氧的需求。維持較高的溶解氧值，才能提高工程菌的生長，利于外源蛋白產物的形成。采用調節(jié)攪拌轉速的方法,可改變培養(yǎng)過程中的氧供給，提高活菌產量。第10

6、頁/共35頁5. pH的影響根據(jù)工程菌的生長和代謝情況，對pH進行適當?shù)恼{節(jié)。如采取兩段培養(yǎng)工藝，培養(yǎng)前期重點是優(yōu)化工程菌的生長條件，培養(yǎng)后期重點是優(yōu)化外源蛋白的表達條件。第11頁/共35頁6.誘導時機的影響一般在對數(shù)生長期或對數(shù)生長后期升溫誘導表達。在對數(shù)生長期，細胞快速繁殖，這時菌體數(shù)目倍增，對營養(yǎng)和氧需求量急增，營養(yǎng)和氧成了菌群旺盛代謝的限制因素。 7.誘導表達程序的影響熱誘導的程序提高外源蛋白表達量。第12頁/共35頁基因工程菌的不穩(wěn)定性基因工程菌的不穩(wěn)定性 基因工程菌在傳代過程中常出現(xiàn)質粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象?；蚬こ叹趥鞔^程中常出現(xiàn)質粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象。 質粒不穩(wěn)定可分為：質粒不穩(wěn)定可分為

7、： 分裂不穩(wěn)定分裂不穩(wěn)定 結構不穩(wěn)定結構不穩(wěn)定第13頁/共35頁分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時出現(xiàn)一定比例不含質粒子代菌的現(xiàn)象。分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時出現(xiàn)一定比例不含質粒子代菌的現(xiàn)象。結構不穩(wěn)定：指外源基因從質粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變結構不穩(wěn)定：指外源基因從質粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變第14頁/共35頁導致質粒不穩(wěn)定的插入的外源基因影響了質粒穩(wěn)定區(qū)的結構 。第15頁/共35頁 對同一工程菌控制不同的比生長數(shù)率可改變質粒的拷貝數(shù)：對同一工程菌控制不同的比生長數(shù)率可改變質粒的拷貝數(shù)： 低拷貝質粒工程菌產生不含質粒子代菌頻率高如增加工程菌質?？截悢?shù)低拷貝質粒工程

8、菌產生不含質粒子代菌頻率高如增加工程菌質粒拷貝數(shù)可提高穩(wěn)定性；可提高穩(wěn)定性； 高拷貝質粒工程菌產生不含質粒子代菌頻率低但對穩(wěn)定性不利。高拷貝質粒工程菌產生不含質粒子代菌頻率低但對穩(wěn)定性不利。第16頁/共35頁質粒穩(wěn)定性的分析方法質粒穩(wěn)定性的分析方法樣品樣品不含抗性標記抗生素不含抗性標記抗生素 平平 板板 培培 養(yǎng)基養(yǎng)基10-12h10-12h100100個菌落個菌落含抗性標記抗生素含抗性標記抗生素平平 板板 培培 養(yǎng)養(yǎng) 基基 10-12h10-12h統(tǒng)計生長菌落數(shù)統(tǒng)計生長菌落數(shù)重復三次重復三次, ,計算比值計算比值 ( (穩(wěn)定性穩(wěn)定性stability)stability)第17頁/共35頁提

9、高質粒穩(wěn)定性的方法提高質粒穩(wěn)定性的方法1.1.選擇合適宿主菌選擇合適宿主菌 宿主菌的比生長速率、基因重組系統(tǒng)的特性、染色體上是否有與質粒和外源基宿主菌的比生長速率、基因重組系統(tǒng)的特性、染色體上是否有與質粒和外源基因同源序列等都會影響質粒的穩(wěn)定性。因同源序列等都會影響質粒的穩(wěn)定性。第18頁/共35頁2.選擇合適的載體 改造、構建能穩(wěn)定表達的質粒載體是構建工程菌的重要一環(huán)。針對不同的載體及不改造、構建能穩(wěn)定表達的質粒載體是構建工程菌的重要一環(huán)。針對不同的載體及不同的目的采取不同的策略。同的目的采取不同的策略。3.選擇壓力 從遺傳學來說，選擇意味著利用某些生長條件使得只有那些具有一定遺傳特性的從遺傳

10、學來說，選擇意味著利用某些生長條件使得只有那些具有一定遺傳特性的細胞才能夠生長。細胞才能夠生長。第19頁/共35頁4.4.分段控制培養(yǎng)分段控制培養(yǎng) 提高質粒穩(wěn)定性的目的是為了提高克隆菌的發(fā)酵生產率，但外源基因表達水平越高，提高質粒穩(wěn)定性的目的是為了提高克隆菌的發(fā)酵生產率，但外源基因表達水平越高，重組質粒往往越不穩(wěn)定。重組質粒往往越不穩(wěn)定。 可采用可采用兩階段培養(yǎng)法，即在發(fā)酵前期控制外源基因不過量表達，使重組質粒穩(wěn)定，即在發(fā)酵前期控制外源基因不過量表達，使重組質粒穩(wěn)定地遺傳；到后期通過提高質粒的拷貝數(shù)或轉錄、翻譯效率使外源基因高效表達。地遺傳；到后期通過提高質粒的拷貝數(shù)或轉錄、翻譯效率使外源基因

11、高效表達。第20頁/共35頁5.5.控制培養(yǎng)條件控制培養(yǎng)條件 對于一個已經組建完成的工程菌來說，選擇最適的培養(yǎng)條件是進行工業(yè)化生產的關對于一個已經組建完成的工程菌來說，選擇最適的培養(yǎng)條件是進行工業(yè)化生產的關鍵鍵 步驟。步驟。 環(huán)境因素對質粒穩(wěn)定性的影響機制錯綜復雜，許多尚屬未知。環(huán)境因素對質粒穩(wěn)定性的影響機制錯綜復雜，許多尚屬未知。 在眾多的環(huán)境因素中，培養(yǎng)基的組成、培養(yǎng)溫度、菌體的比生長速率在眾多的環(huán)境因素中，培養(yǎng)基的組成、培養(yǎng)溫度、菌體的比生長速率3 3個方面尤其個方面尤其重要。重要。第21頁/共35頁1）培養(yǎng)基的組成 培養(yǎng)基對克隆菌穩(wěn)定性的影響培養(yǎng)基 克隆菌 F20-25 不穩(wěn)定型PBB

12、 PBB W3110trpAE1trpR tnaAW3110trpAE1trpR tnaA 7% 7% 結構性結構性MM MM (RSF 2124-trp)(RSF 2124-trp) 99% 99% 結構性結構性PBB PBB W3110 trpAE1 trpRam27 W3110 trpAE1 trpRam27 12% 12% 分配性分配性MM MM (pSC101-trp)(pSC101-trp) 48% 48% 分配性分配性第22頁/共35頁2 2）培養(yǎng)溫度）培養(yǎng)溫度 對于溫度敏感性質粒，為了控制在生長前期其外源基因不表達，一般采用二階段溫度培養(yǎng)系統(tǒng)，即在菌種生長階段，采用較低的培養(yǎng)溫

13、度，當菌體生長至適宜濃度和生長時期時，提高溫度進行誘導，使外源基因表達。重組工程菌的生長和產物合成時的PH往往不同。第23頁/共35頁3 3）菌體比生長速率）菌體比生長速率 比生長速率對重組質粒穩(wěn)定性的影響結果不盡一比生長速率對重組質粒穩(wěn)定性的影響結果不盡一致，并可能與克隆菌本身和培養(yǎng)條件有關。致，并可能與克隆菌本身和培養(yǎng)條件有關。 例如例如: : 在酵母系統(tǒng)中，在酵母系統(tǒng)中， 大則質粒大則質粒pJDB248pJDB248穩(wěn)定穩(wěn)定性高。性高。 如果不含重組質粒的宿主細胞不比含有重組質粒如果不含重組質粒的宿主細胞不比含有重組質粒的工程菌生長快，則重組質粒的丟失也不會導致的工程菌生長快，則重組質粒

14、的丟失也不會導致非常嚴重的后果；調整這兩種菌的比生長速率可非常嚴重的后果；調整這兩種菌的比生長速率可以提高重組質粒的穩(wěn)定性。但很難達到。在某些以提高重組質粒的穩(wěn)定性。但很難達到。在某些情況下，可以利用分解代謝物效應控制菌的比生情況下，可以利用分解代謝物效應控制菌的比生長速率，降低長速率，降低值，提高重組質粒的穩(wěn)定性。值，提高重組質粒的穩(wěn)定性。第24頁/共35頁比生長速率 比生長速率為表征微生物生長速率的一個參數(shù),其大小為0.693除以倍增時間td（菌體量倍增）。 推算過程：假定在任何時間（t），微生物細胞數(shù)目的增長速率（dN/dt）正比于已經存在的總細胞數(shù)目（N），則得：dN/dt=N。 經積

15、分得：lnNt-lnN0=t，對于一倍增時間，t=td , Nt=2N0的培養(yǎng)物：ln2N0-lnN0=td 。易得：=ln2/td 。 參數(shù)含義： 比生長速率，單位h-1 t時間，單位h N任何時間處微生物細胞量 Nt開始培養(yǎng)t時間過后生物細胞量 N0開始時微生物細胞量 td倍增時間，即為微生物細胞量變?yōu)樵瓉淼膬杀端璧臅r間第25頁/共35頁6.6.固定化固定化 固定化技術包括固定化酶技術與固定化微生物技術。固定化微生物技術是用化學或物理手段將游離微生物定位于限定的空間區(qū)域,以提高微生物細胞的濃度,使其保持較高的生物活性并反復利用的方法。第26頁/共35頁良好固定化細胞方法的條件：1 1）應

16、該能夠控制固定化細胞的大小和空隙度；）應該能夠控制固定化細胞的大小和空隙度；2 2）原料易得、成本較低，方法簡便、易行，載體對細胞是）原料易得、成本較低，方法簡便、易行，載體對細胞是惰性的，固定過程溫和，對細胞損傷輕；惰性的，固定過程溫和，對細胞損傷輕；3 3）固定化細胞應具有穩(wěn)定的網狀結構，在所使用的）固定化細胞應具有穩(wěn)定的網狀結構，在所使用的pHpH值值和溫度下，不會被破壞；和溫度下，不會被破壞；4 4）在反應器內長時間運轉過程中，固定化細胞具有良好的）在反應器內長時間運轉過程中，固定化細胞具有良好的機械穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性；機械穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性；5 5）固定化細胞應使底物、產物和其他代謝

17、物能夠自由擴散，）固定化細胞應使底物、產物和其他代謝物能夠自由擴散，因為產物和其他代謝產物常能抑制細胞的酶反應；因為產物和其他代謝產物常能抑制細胞的酶反應；6 6）單位體積的固定化細胞應擁有盡可能多的細胞。）單位體積的固定化細胞應擁有盡可能多的細胞。第27頁/共35頁固定化細胞的制備方法常用的有常用的有吸附法、包埋法、共價結合法、交聯(lián)法、多孔物質包絡法、超過濾法等，其中等，其中包埋法最為普遍。包埋法最為普遍。第28頁/共35頁工程菌的高效表達基因工程的最終目的是在一個合適的系統(tǒng)中，使外源基因高效表達，從而生產有價值的蛋白質產品。表達系統(tǒng)有原核系統(tǒng)和真核系統(tǒng)。第29頁/共35頁外源基因在原核中表

18、達的關鍵：（1） 通過表達載體將外源基因導入宿主菌，并指導宿主菌的酶系統(tǒng)合成外源蛋白；（2） 外源基因不能帶有intron；（3） 利用原核細胞的強啟動子和SD序列等控制外源基因的表達；（4） 外援基因與表達載體連接后，必須形成正確的開放閱讀框架；（5） 利用宿主菌的調控系統(tǒng)，調節(jié)外源基因的表達，防止表達的外源基因產物對宿主菌的毒害。第30頁/共35頁基因工程菌的不穩(wěn)定性基因工程菌的不穩(wěn)定性 基因工程菌在傳代過程中常出現(xiàn)質粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象?；蚬こ叹趥鞔^程中常出現(xiàn)質粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象。 質粒不穩(wěn)定可分為：質粒不穩(wěn)定可分為： 分裂不穩(wěn)定分裂不穩(wěn)定 結構不穩(wěn)定結構不穩(wěn)定第31頁/共35頁 對同一工程菌控制不同的比生長數(shù)率可改變質粒的拷貝數(shù)：對同一工程菌控制不同的比生長數(shù)率可改變質粒的拷貝數(shù)： 低拷貝質粒工程菌產生不含質粒子代菌頻率高如增加工程菌質?？?/p>