動(dòng)物細(xì)胞工程制藥

1、動(dòng)物細(xì)胞工程制藥動(dòng)物細(xì)胞工程制藥張忠山張忠山生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 一、概述 二、動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和生理特點(diǎn) 三、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得 四、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基 五、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的方法和操作方式 六、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器及其檢測(cè)控制系統(tǒng) 七、動(dòng)物細(xì)胞制藥的前景和展望第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 （1）發(fā)現(xiàn)細(xì)胞和細(xì)胞學(xué)說(shuō)創(chuàng)立。1665年英國(guó)物理學(xué)家Hooke通過(guò)自制的顯微鏡觀察切成薄片的軟木時(shí)看到死細(xì)胞的細(xì)胞壁。 （2）組織培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)。1885年德國(guó)生理鹽水培養(yǎng)雞胚組織，至1907年，細(xì)胞體外培養(yǎng)宣布進(jìn)入一個(gè)新時(shí)代。 （3）細(xì)胞工程學(xué)時(shí)代。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行人工改造及培養(yǎng)以使其為人類(lèi)服務(wù)的時(shí)代，

2、包括真核細(xì)胞的基因重組、導(dǎo)入、擴(kuò)增和表達(dá)的理論和技術(shù)，細(xì)胞融合的理論和技術(shù)，細(xì)胞器特別是細(xì)胞核移植的理論和技術(shù)，染色體改造的理論和技術(shù)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)、植物的理論和技術(shù)，細(xì)胞大量培養(yǎng)的理論和技術(shù)，以及產(chǎn)物分離純化的理論和技術(shù)。 （4）細(xì)胞工程制藥成為現(xiàn)代制藥技術(shù)中常用的手段。應(yīng)用領(lǐng)域應(yīng)用領(lǐng)域 生產(chǎn)藥品：作為宿主細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)原核細(xì)胞所不能生產(chǎn)的藥用蛋白。 基礎(chǔ)研究的細(xì)胞材料：細(xì)胞模型 種子細(xì)胞：為組織修復(fù)與器官再生提供種子細(xì)胞。第二節(jié)第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和特點(diǎn)形態(tài)和特點(diǎn) 一、動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài) 二、動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn) 一、動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)細(xì)胞的分化（或特化）形態(tài)分化在離體培養(yǎng)同樣也存在。離體培養(yǎng)

3、的細(xì)胞分為兩類(lèi)：貼壁依賴(lài)型（anchorage-dependent）和非貼壁依賴(lài)型（anchorage-independent），前者可簡(jiǎn)稱(chēng)為貼壁細(xì)胞，后者可簡(jiǎn)稱(chēng)為懸浮細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞 結(jié)構(gòu)圖結(jié)構(gòu)圖 1、貼壁細(xì)胞 特點(diǎn)：支持物 兩種形態(tài)，即成纖維樣細(xì)胞型或上皮樣細(xì)胞型。前者主要來(lái)源于中胚層組織的細(xì)胞，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀、旋渦狀或火焰狀走行；后者主要來(lái)源于外胚層和內(nèi)胚層組織的細(xì)胞，生長(zhǎng)時(shí)彼此緊密連接成單層細(xì)胞片。 2 2、懸浮細(xì)胞、懸浮細(xì)胞 這類(lèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)這類(lèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)不依賴(lài)支持物不依賴(lài)支持物表面，可在培養(yǎng)表面，可在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)，如血液的淋巴細(xì)胞和用以生液中呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)，如血液的淋

4、巴細(xì)胞和用以生產(chǎn)干擾素的產(chǎn)干擾素的Namalwa細(xì)胞等，細(xì)胞呈圓形。細(xì)胞等，細(xì)胞呈圓形。 3 3、兼性貼壁細(xì)胞、兼性貼壁細(xì)胞 兼具上述兩種生長(zhǎng)方式的細(xì)胞，稱(chēng)為兼性貼壁細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、小鼠L929細(xì)胞。當(dāng)它們貼附在支持物表面上生長(zhǎng)時(shí)呈上皮或成纖維細(xì)胞的形態(tài)，而當(dāng)懸浮于培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)則呈圓形，但有時(shí)它們可相互支持貼附在一起生長(zhǎng)。 二、動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)二、動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn) 1、細(xì)胞的分裂周期長(zhǎng) 一般為1248h，細(xì)胞分裂周期=間期（G1期+S期+G2期）+分裂期（M期） G1期：凡細(xì)胞無(wú)增殖活動(dòng)時(shí)皆滯留在G1期 S 期：DNA的合成，一般為68小時(shí) G2期：DNA量加倍，RNA合成和染色體螺

5、旋化，持續(xù)時(shí)間短，一般為25h。 M期：一般持續(xù)時(shí)間很短，僅0.51h。相當(dāng)于有絲分裂的中后期和末期，主要是染色體的變化、分裂，并形成子細(xì)胞。 細(xì)胞分裂代數(shù)與培養(yǎng)中的代數(shù)及相互關(guān)系。 2、細(xì)胞生長(zhǎng)需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象 大多數(shù)正常二倍體（dipoid）細(xì)胞的生長(zhǎng)都需要一定的基質(zhì)（如玻璃，塑料等）上貼附，伸展后才能生長(zhǎng)增殖，其機(jī)制可能與電荷、鈣鎂離子的作用以及許多貼附因子有關(guān)。 當(dāng)細(xì)胞在基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯合成片時(shí)，細(xì)胞與其周?chē)?xì)胞相互接觸時(shí)，細(xì)胞才停止增殖。保持一定的營(yíng)養(yǎng)，細(xì)胞仍可存活一段時(shí)間，但細(xì)胞密度不再增加，該現(xiàn)象就稱(chēng)為接觸抑制或密度依賴(lài)抑制現(xiàn)象。一旦細(xì)胞轉(zhuǎn)化為異倍體后，該現(xiàn)象

6、消失，細(xì)胞可多層生長(zhǎng)，細(xì)胞密度可大大增加。 3、正常二倍體細(xì)胞的生長(zhǎng)壽命是有限的、正常二倍體細(xì)胞的生長(zhǎng)壽命是有限的 當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)開(kāi)始，稱(chēng)之為原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)傳代后，即成為有限細(xì)胞系，即有限的生長(zhǎng)傳代時(shí)間，取決于細(xì)胞來(lái)源的種族和年齡，人胚成纖維細(xì)胞約可培養(yǎng)50代，雞胚的30代，小鼠的8代。但是若向培養(yǎng)基中加入表皮生長(zhǎng)因子，可使上皮細(xì)胞的壽命從原來(lái)的50代增加至150代。 當(dāng)細(xì)胞突變?yōu)楫惐扼w異倍體后，該細(xì)胞可轉(zhuǎn)變成無(wú)限細(xì)胞系，或稱(chēng)連續(xù)細(xì)胞系。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)一代生長(zhǎng)過(guò)程動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)一代生長(zhǎng)過(guò)程 4、動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周?chē)h(huán)境比較敏感、動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周?chē)h(huán)境比較敏感 無(wú)細(xì)胞壁細(xì)胞壁保護(hù)，因而外界的物理化學(xué)因素很

7、容易產(chǎn)生影響。 5、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的要求高、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的要求高 與細(xì)菌和植物細(xì)胞不同，其需要12種必需氨基酸、8種以上的維生素、多種無(wú)機(jī)鹽和微量元素、作為主要碳原的葡萄糖以及多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子和貼附因子，而且不同種類(lèi)要求又有變化。 6、動(dòng)物細(xì)胞蛋白合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不、動(dòng)物細(xì)胞蛋白合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同同 場(chǎng)所：游離的核糖體以及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體，前者合成的蛋白質(zhì)都用于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)，后者上合成的蛋白質(zhì)是分泌性的和膜中的整合蛋白，多數(shù)為糖蛋白。 蛋白質(zhì)上的糖鏈有的在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上加接，有的在高高爾基體爾基體中加接。其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中加接的是N-鏈寡糖，在高爾基體內(nèi)加接的是O-鏈寡糖。動(dòng)

8、物細(xì)胞生產(chǎn)藥物的優(yōu)缺點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)藥物的優(yōu)缺點(diǎn) 缺點(diǎn)：培養(yǎng)條件高、成本貴、產(chǎn)量低。 優(yōu)點(diǎn)：分泌胞外、純化方便、翻譯后修飾糖基化，與天然產(chǎn)品一致。第三節(jié)第三節(jié) 生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得求和獲得 一、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求 二、生產(chǎn)動(dòng)物細(xì)胞的獲得 三、常用生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的特性 四、基因工程細(xì)胞的構(gòu)建和篩選 五、細(xì)胞庫(kù)的篩選傳代細(xì)胞的要求傳代細(xì)胞的要求 正常原代細(xì)胞 二倍體細(xì)胞 無(wú)限制 癌細(xì)胞生產(chǎn)藥物需謹(jǐn)慎需謹(jǐn)慎！ 一、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要一、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求求 （1）原代正常組織分離的細(xì)胞 （2）二倍體細(xì)胞，即使是傳代細(xì)胞 （3）傳代細(xì)胞用于生產(chǎn) （4）按照FDA對(duì)細(xì)胞株的要求

9、，控制最終產(chǎn)品中DNA殘留量。 1、原代細(xì)胞：、原代細(xì)胞：是直接取自動(dòng)物組織、器官，經(jīng)過(guò)粉碎、消化而獲得的細(xì)胞懸液。一般1g組織約有109個(gè)細(xì)胞。 雞胚細(xì)胞、原代兔腎或鼠腎細(xì)胞、淋巴細(xì)胞 費(fèi)錢(qián)費(fèi)勞力費(fèi)錢(qián)費(fèi)勞力 2、二倍體細(xì)胞系：、二倍體細(xì)胞系：原代細(xì)胞經(jīng)過(guò)傳代、篩選、克隆，從而從多種細(xì)胞成分的組織中挑選并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞株。 WI-38、MRC-5、2BS等 3、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系：、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系：失去了正常細(xì)胞的特點(diǎn)，可以無(wú)限增殖。 自發(fā)轉(zhuǎn)化、人為轉(zhuǎn)化 Namalwa、CHO、BHK-21、Vero等。 各單位細(xì)胞庫(kù)保存 4、融合細(xì)胞系、融合細(xì)胞系 動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)-也稱(chēng)動(dòng)物體細(xì)胞雜交技術(shù)

10、，是指二個(gè)或者二個(gè)以上的動(dòng)物細(xì)胞在外力作用下，合并為一個(gè)多核細(xì)胞的過(guò)程。促融因素促融因素（1）病毒誘導(dǎo)融合（2）PEG誘導(dǎo)融合（3）電場(chǎng)誘導(dǎo)融合（4）其它誘導(dǎo)融合（1 1）病毒誘導(dǎo)融合）病毒誘導(dǎo)融合 仙臺(tái)病毒、流感病毒、新城疫雞瘟病毒、皰疹病毒等 當(dāng)二種不同的動(dòng)物細(xì)胞混合物中存在大量病毒時(shí)，病毒或其組分會(huì)在細(xì)胞間起粘連作用而使細(xì)胞聚集成團(tuán)，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)雙分子層產(chǎn)生重排、進(jìn)而結(jié)合成一個(gè)整體。 隨機(jī)的，無(wú)法人為控制，同時(shí)融合率較低。（2 2）PEG誘導(dǎo)融合誘導(dǎo)融合當(dāng)二種不同的動(dòng)物細(xì)胞混合物中存在PEG時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞聚集作用。在除去PEG的過(guò)程中，即產(chǎn)生細(xì)胞融合現(xiàn)象。所用的PEG分子量在

11、1000-6000之間，一般濃度為40-50%，在37下作用2-3分鐘，其促融效果最佳。PEG促融合的作用機(jī)理不清，其促融作用也具有隨機(jī)性，無(wú)法人為控制。（3 3）電場(chǎng)誘導(dǎo)融合）電場(chǎng)誘導(dǎo)融合將二種細(xì)胞混合物經(jīng)過(guò)10-100V/cm的低強(qiáng)度非均勻交變電場(chǎng)作用時(shí)，細(xì)胞之間就會(huì)發(fā)生緊密接觸，形成穩(wěn)定的串珠狀偶極子排列。在此基礎(chǔ)上再對(duì)細(xì)胞實(shí)施瞬間高強(qiáng)度電脈沖就會(huì)發(fā)生膜擊穿，不同細(xì)胞間通過(guò)膜脂質(zhì)分子重排就能實(shí)現(xiàn)融合，形成一個(gè)雙核或者多核的細(xì)胞。一般來(lái)說(shuō)，擊穿電壓為0.5-10KV/cm，作用時(shí)間為30-50微秒。電場(chǎng)誘導(dǎo)融合不損傷細(xì)胞，具有可人為操作的控制的特性，融合率較高。三、常用生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的特性

12、三、常用生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的特性 （1）WI-38：1961年來(lái)源于女性高加索人正常胚肺組織的二倍體細(xì)胞系，核型2n=46。該細(xì)胞是成纖維細(xì)胞，能產(chǎn)生膠原，培養(yǎng)基用BME（Eagles basal medium）加小牛血清，pH控制在7.2，同工酶為G6PD B型。細(xì)胞的倍增時(shí)間為24h，有限壽命為50代，上世紀(jì)60年代被廣泛用于制備疫苗。 （2）MRC-5：特性和用途與WI-38相似，1966年來(lái)源于14周正常男性，對(duì)多種人的病毒敏感，用于疫苗的生產(chǎn)。 （3）CHO-K1：1957年從中國(guó)地鼠卵巢中分離的一株上皮樣細(xì)胞。在培養(yǎng)時(shí)需加入脯氨酸。核型為2n=2022。目前廣泛用于構(gòu)建工程細(xì)胞的是一株

13、缺乏二氫葉酸還原酶的營(yíng)養(yǎng)缺陷突變株CHO-dhfr-，它常用的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，加0.1 mol/L次黃嘌呤和0.01m mol/L胸苷，以及10%小牛血清。 （4）BHK-21：1961年從5只無(wú)性別的生長(zhǎng)1天的地鼠幼鼠的腎臟中分離的?，F(xiàn)在廣泛采用的是1963年用單細(xì)胞分離的方法經(jīng)13次的克隆的細(xì)胞。成纖維細(xì)胞，2n=44。通常用的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，添加7%胎牛血清。過(guò)去多用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒和狂犬病疫苗，現(xiàn)在已被用于構(gòu)建工程細(xì)胞。 （5）Vero：1962年來(lái)源于正常的成年非洲綠猴腎。是貼壁依賴(lài)的成纖維細(xì)胞，2n=60，高倍體率為1.7%，可持續(xù)地進(jìn)行培養(yǎng)。通

14、常用的培養(yǎng)基為199培養(yǎng)基，添加5%胎牛血清。該細(xì)胞可支持多種病毒的增殖，包括脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病病毒，已被批準(zhǔn)用于人體。 （6）Namalwa：1972年來(lái)源于肯尼亞患有Burkitt淋巴瘤的病人體中，后在瑞典構(gòu)建的一株人的類(lèi)淋巴母細(xì)胞，高細(xì)胞有2.8%的高倍體率，多數(shù)細(xì)胞有1214條標(biāo)記染色體，單條X染色體，無(wú)Y染色體。通常用的培養(yǎng)基為RPMI 1640，添加7%胎牛血清。用于大規(guī)模生產(chǎn)-干擾素。 （7）SP2/0-Ag14：該細(xì)胞是1978年中通過(guò)融合的方法，從有抗羊紅細(xì)胞活性的BALB/c小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞系P3X63Ag8融合的雜交瘤SP2/HL-Ag亞克隆中分離得到。它不分泌任

15、何免疫球蛋白抗體鏈，能耐受8-氮鳥(niǎo)嘌呤（8-azaguanine）20g/ml，但在含HAT選擇培養(yǎng)基中不能存活。通常用的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清。 （8）Sf-9：1983年從親代IPLB-SF21 AE中克隆形成。親代細(xì)胞則在1977年從秋粘蟲(chóng)（Spodoptera frugiperda)的蛹卵組織中分離獲得。它對(duì)苜宿尺蠖核型多角體病毒（Autographa california MNPV）和其他桿狀病毒（Baculovirus）高度敏感。通常用的培養(yǎng)基為Grace培養(yǎng)基，添加3.3g/L 水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液，以及10%胎牛血清。目前已經(jīng)被廣泛用于高效表達(dá)外

16、來(lái)蛋白制品。四、基因工程細(xì)胞的構(gòu)建和篩選四、基因工程細(xì)胞的構(gòu)建和篩選 原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞系和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系三者在生產(chǎn)中都有使用，但在生產(chǎn)中采用更多的、更有前景的是融合細(xì)胞及采用基因工程手段構(gòu)建的各種工程細(xì)胞。當(dāng)前被用以構(gòu)建工程細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞有CHO-dhfr-、BHK-21、Namalwa、Vero、SP2/0和Sf-9等細(xì)胞。 那么如何獲得動(dòng)物工程細(xì)胞呢？ 1 1、真核細(xì)胞基因表達(dá)、真核細(xì)胞基因表達(dá) 載體的構(gòu)建載體的構(gòu)建 目前一般使用的載體有兩類(lèi)：一是病毒載體，如牛痘病毒、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒和桿狀病毒等。牛痘病毒已被廣泛地用來(lái)構(gòu)建成多價(jià)疫苗，腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體正被試用用于基因治療中，而桿狀

17、病毒載體-昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)已被成功地用于300多種外源基因的高效表達(dá)。 用桿狀病毒做載體有許多優(yōu)點(diǎn)： （1）該病毒基因組是雙鏈DNA，容易進(jìn)行重組。 （2）插入78kb的DNA不影響正常病毒粒子的形成。 （3）多角體蛋白多角體蛋白和病毒粒子的形成無(wú)直接關(guān)系，因此用外源基因更換多角體蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒子。（4）多角體蛋白基因有非常強(qiáng)的啟動(dòng)子，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可占全部蛋白質(zhì)的2030%。（5）用光學(xué)顯微鏡可看到多角體，容易以此為標(biāo)記物來(lái)挑選陽(yáng)性克隆。（6）如果用家蠶桿狀病毒，還可在蠶體直接表達(dá)外源基因。 另一類(lèi)是質(zhì)粒載體，而且常常是穿梭質(zhì)粒載體，即在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞兩者體內(nèi)都能擴(kuò)增。構(gòu)建

18、此類(lèi)載體一般含有如下基本成分： （1）允許載體在細(xì)菌體內(nèi)擴(kuò)增的質(zhì)粒序列質(zhì)粒序列。多數(shù)含有質(zhì)粒pBR322或其衍生載體pAT153的序列，包括能使質(zhì)粒在細(xì)菌體內(nèi)復(fù)制的起始位點(diǎn)和抗生素標(biāo)記基因。 （2）含有能使基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控元件調(diào)控元件，在5端轉(zhuǎn)錄起動(dòng)需要有啟動(dòng)子，包括帽狀位點(diǎn)（RNA轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)）上游約30堿基處的TATA框和上游7090堿基處的CAAT框序列和增強(qiáng)子。當(dāng)前構(gòu)建載體的許多啟動(dòng)子序列都來(lái)自病毒。也有其它來(lái)源的啟動(dòng)子。此外，在基因3端應(yīng)有終止序列、RNA 3端的切割序列和poly A序列等。近來(lái)有人在載體里加入顯性活動(dòng)調(diào)控區(qū)（DCR）序列，以此來(lái)克服因載體整合在宿主基因組位點(diǎn)而產(chǎn)生

19、的表達(dá)水平降低。 （3）能用以篩選出外源基因已整合的選擇標(biāo)記。一般有兩類(lèi)標(biāo)記：一類(lèi)僅適合用于密切相關(guān)的突變細(xì)胞株，如采用標(biāo)記基因hgprt、tk和aprt等基因，它們僅適用于hgprt-、tk-和aprt-等基因缺失的細(xì)胞株。另一類(lèi)是顯性作用基因，如neo基因，它能使氨基糖苷抗生素新霉素磷酸化而失活，從而使原來(lái)對(duì)新霉素敏感的哺乳動(dòng)物細(xì)胞一旦獲得含該基因的載體后，就能在含該抗生素的培養(yǎng)基中存活。（4）有時(shí)還帶有選擇性增加拷貝數(shù)的擴(kuò)增系統(tǒng)。最常用的是編碼二氫葉酸還原酶的基因。該酶的擴(kuò)增可防止氨甲喋呤（MTX）對(duì)細(xì)胞的毒害作用。利用該原理，在構(gòu)建載體時(shí)可有意識(shí)地將它與目的基因重組在一起，當(dāng)在培養(yǎng)基內(nèi)

20、增加MTX濃度時(shí)，就會(huì)促使dhfr基因的擴(kuò)增，同時(shí)也會(huì)使其毗鄰的目的基因隨之?dāng)U增，從而大大提高表達(dá)量。類(lèi)似的擴(kuò)增系統(tǒng)還有谷氨酰胺合成酶和腺苷脫氫酶等系統(tǒng)。 2、基因載體的導(dǎo)入和高效表達(dá)、基因載體的導(dǎo)入和高效表達(dá) 工程細(xì)胞株的篩選工程細(xì)胞株的篩選（1）DNA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞方法： 融合法、化學(xué)法、物理法、病毒法 （2）篩選： 篩選系統(tǒng)、克隆純化 五、細(xì)胞庫(kù)的建立五、細(xì)胞庫(kù)的建立 除原代細(xì)胞外，其它的細(xì)胞株、細(xì)胞系都需要建細(xì)胞庫(kù)加以保存。按照我國(guó)和美國(guó)FDA的規(guī)定，用于生產(chǎn)的工程細(xì)胞必須建立兩個(gè)細(xì)胞庫(kù)：原始細(xì)胞庫(kù)（master cell bank， MCB）和生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)（manugactures w

21、orking cell bank，MWCB）或稱(chēng)工作細(xì)胞庫(kù)（working cell bank， WCB）。 儲(chǔ)存于MCB的細(xì)胞應(yīng)該是單一來(lái)源的均質(zhì)的細(xì)胞，對(duì)于二倍體細(xì)胞應(yīng)該是群體倍增水平盡可能低的細(xì)胞。儲(chǔ)存時(shí)應(yīng)具有該細(xì)胞詳細(xì)檔案，包括： （1）該細(xì)胞系的歷史：（2）該細(xì)胞的特性：（3）對(duì)各種有害因子的檢查結(jié)果： 儲(chǔ)存于MWCB的細(xì)胞應(yīng)該是從MCB來(lái)的，或從單一安瓿來(lái)，或從多個(gè)安瓿在融化即刻混合在一起的，然后經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增到一定數(shù)量后，再分裝儲(chǔ)存形成的細(xì)胞庫(kù)。同樣該細(xì)胞庫(kù)也必須建立檔案，而且需要進(jìn)行無(wú)菌性和無(wú)細(xì)胞交叉污染的檢查。生產(chǎn)時(shí)需確定其最高使用的傳代數(shù)。第四節(jié)第四節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件動(dòng)物細(xì)

22、胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基和培養(yǎng)基 為了使細(xì)胞培養(yǎng)在體外培養(yǎng)成功，需要一些基本條件： （1）絕對(duì)無(wú)菌操作；（2）足夠的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，排除有害物質(zhì)包括極其微量的離子摻入；（3）適量氧氣供應(yīng)；（4）隨時(shí)清除細(xì)胞代謝中產(chǎn)生的有害產(chǎn)物；（5）有良好的適于生存外界環(huán)境，包括pH、滲透壓和離子濃度等；（6）及時(shí)分種，保持合適的細(xì)胞密度。 一、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件一、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件 1、器材的清洗和消毒、器材的清洗和消毒 器材的清洗：一般來(lái)說(shuō)，需經(jīng)浸泡、刷洗、泡酸和沖洗四個(gè)步驟，用過(guò)的器材最好盡快地浸泡在3%的磷酸三鈉溶液內(nèi)過(guò)夜，以除去蛋白質(zhì)和殘余細(xì)胞等污垢。 器材的消毒滅菌：主要通過(guò)物理方法和化學(xué)方法來(lái)達(dá)到嚴(yán)格無(wú)

23、菌的操作過(guò)程。書(shū)中表3-4是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的消毒劑、濃度和使用場(chǎng)合的列表。盡量避免使用抗生素，但在工業(yè)生產(chǎn)中還是經(jīng)常使用的。常用抗生素及其濃度見(jiàn)表3-5。 2、水質(zhì)、水質(zhì) 蒸餾、離子交換、電滲析、反滲透、中空纖維過(guò)濾等單獨(dú)使用或配合使用，制備純水，一般要求金屬離子含量很低，電阻值在18M以上。動(dòng)物細(xì)胞制藥用水，要求去熱源。 3、pH pH的高低對(duì)細(xì)胞各種酶的活性、細(xì)胞壁的通透性以及許多蛋白的功能都有重要的影響。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的最適pH為7.27.4，低于6.8或高于7.6時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起細(xì)胞退變甚至死亡。 4、滲透壓、滲透壓 在細(xì)胞培養(yǎng)的所有操作中，為了使與細(xì)胞接觸的所有液體

24、都保持有較合適的滲透壓和pH，一般都需要使用平衡鹽溶液（balanced salt solution, BSS），它由無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖組成。表3-6列出了幾種常用平衡鹽溶液（BSS）組成。 5、溫度、溫度 哺乳動(dòng)物 ：（370.5） 昆蟲(chóng)：27 6、空氣、空氣二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類(lèi)和組成種類(lèi)和組成 細(xì)胞種系不同對(duì)培養(yǎng)基的要求亦有差異，主要有三類(lèi)：天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)基。 1、天然培養(yǎng)基、天然培養(yǎng)基：在細(xì)胞培養(yǎng)的早期階段使用的培養(yǎng)基，主要為來(lái)自天然的材料如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。 優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高 缺點(diǎn)：成分復(fù)雜、來(lái)源有限、成本較高 血

25、清（serum）：纖維蛋白已被除去(如通過(guò)血凝或去纖維蛋白法)的血漿。 2、合成培養(yǎng)基：、合成培養(yǎng)基：優(yōu)點(diǎn)是成分明確，組分穩(wěn)定，可大量生產(chǎn)供應(yīng)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中常用的有BME、MEM、DMEM、HAM F12、RPMI 1640以及ISOCOV、199和McCoy等。 缺點(diǎn)：無(wú)法替代一些未知成分。 解決途徑合成培養(yǎng)基中添加小牛血清，彼此互補(bǔ) 上述合成培養(yǎng)基中主要有： 氨基酸：12種必需+谷氨酰胺 維生素：脂溶性和水溶性 糖類(lèi)：葡萄糖、谷氨酰胺 無(wú)機(jī)鹽：保持滲透壓 其它一些特定成分如核酸的前體腺苷、鳥(niǎo)苷等。 為了給細(xì)胞培養(yǎng)以更大的方便，以便于其增殖或貼附生長(zhǎng)，長(zhǎng)向培養(yǎng)基中加入一定量的動(dòng)物血清，常用

26、的是添加5%10%的小牛血清，雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)中，血清可能要求的更高，常用1020%的胎牛血清。 血清的作用機(jī)制可能為：（1）提供有利于細(xì)胞生長(zhǎng)增殖所需要的各種生長(zhǎng)因子和激素；（2）提供有利于細(xì)胞貼壁所需要的貼附因子和伸展因子；（3）提供可識(shí)別金屬、激素、維生素和脂類(lèi)的結(jié)合蛋白；（4）提供細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的脂肪酸和微量元素。 3、無(wú)血清培養(yǎng)基 無(wú)血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)如下：提高了細(xì)胞培養(yǎng)的可重復(fù)性，避免，避免了由于血清批之間差異的影響；減少了由血清帶來(lái)的病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險(xiǎn)；供應(yīng)充足、穩(wěn)定； 細(xì)胞產(chǎn)品容易純化；避免了血清中某些因素對(duì)有些細(xì)胞的毒性；減少了血清中蛋白對(duì)某些生物測(cè)定的干擾，

27、便于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。 目前已經(jīng)有市售無(wú)血清培養(yǎng)基（書(shū)中表5-8所示）。無(wú)血清培養(yǎng)基中都是在合成培養(yǎng)基內(nèi)加入不同種類(lèi)的添加劑所構(gòu)成，大致有以下幾類(lèi)：（1）激素和生長(zhǎng)因子：使用最多的是胰島素，促進(jìn)糖原和脂肪酸的合成，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有刺激作用。（2）結(jié)合蛋白：最經(jīng)常被補(bǔ)充的是鐵傳遞蛋白和白蛋白。為了便于純化，有時(shí)可用硫酸亞鐵、檸檬酸鐵、葡萄糖酸鐵代替鐵傳遞蛋白。 （3）貼附和伸展因子：目前多數(shù)無(wú)血清培養(yǎng)基只適用于懸浮細(xì)胞，真正能用以培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的很少，也很貴，原因在于它們均缺少必需的貼附和伸展因子，除這些因子外，有的還添加維生素A酸和重組的小肽，它可與細(xì)胞的受體結(jié)合。（4）其它有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的因子和元素

28、：它們包括有消除氧自由基損害的谷胱甘肽，某些微量元素，如硒等。三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)所需儀器設(shè)備三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)所需儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)室要求實(shí)驗(yàn)室要求（A）和緩沖間相連，緩沖間內(nèi)備消毒服裝和鞋，口罩等，入內(nèi)換上。（B）室內(nèi)空氣不流通，有適當(dāng)?shù)墓饩€，清潔，干燥。（C）側(cè)部可設(shè)傳遞窗，用于物品傳遞。（D）有消毒用紫外線燈（1 1）培養(yǎng)器具）培養(yǎng)器具培養(yǎng)瓶培養(yǎng)瓶培養(yǎng)板培養(yǎng)板培養(yǎng)皿培養(yǎng)皿（2 2）超凈工作臺(tái)）超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái)的工作原理超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過(guò)高效濾器除去氣遁過(guò)高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。使空氣得到凈化。100100級(jí)超凈

29、工作臺(tái)指標(biāo)：級(jí)超凈工作臺(tái)指標(biāo)：（0.5m3.50.5m3.5粒粒/L/L） （3 3） COCO2 2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ，5CO2 。二氧化碳的作用：維持PH值。（4 4）倒置顯微鏡）倒置顯微鏡 （5 5）純化水裝置）純化水裝置四、進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的材料四、進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的材料1、胚胎組織-如1020日齡的雞胚、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎、人工流產(chǎn)的胎兒。胚胎組織的細(xì)胞由于互相之間粘連作用較弱、易于消化和分散、并且其細(xì)胞生命力強(qiáng)，易于培養(yǎng)和增殖。2、成體組織-如肝臟、脾臟、心臟、腎臟、白血球等等，由于其細(xì)胞之間具有較強(qiáng)的粘合作用，培養(yǎng)難度較大。3、腫瘤組織-細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，可在體外

30、長(zhǎng)期培養(yǎng)和繁殖，并且可以采用微生物培養(yǎng)方法進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。第五節(jié)第五節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的概念 : 從動(dòng)物機(jī)體中取出相關(guān)細(xì)胞,將它分散成單個(gè)細(xì)胞,放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖 細(xì)胞系的分離與培養(yǎng)細(xì)胞系的分離與培養(yǎng)胰蛋白酶：細(xì)胞間質(zhì)較少的軟胰蛋白酶：細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，胚胎、肝、腎及傳代細(xì)組織，胚胎、肝、腎及傳代細(xì)胞胞膠原酶：纖維、上皮、癌組織膠原酶：纖維、上皮、癌組織鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶酶動(dòng)物組織或器官動(dòng)物組織或器官洗滌洗滌 粉碎粉碎酶解消化酶解消化離心或過(guò)濾離心或過(guò)濾接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞培養(yǎng)液稀

31、釋細(xì)胞洗洗 滌滌細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù) 1、自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù) 2、血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù) 3、結(jié)晶紫染色細(xì)胞核計(jì)數(shù) 4、MTT染色計(jì)數(shù) ADAM-MC全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 細(xì)胞傳代 1、懸浮細(xì)胞傳代 2、貼壁細(xì)胞傳代：消化液消化細(xì)胞凍存與復(fù)蘇1、凍存 溫度：液氮（-196） 速度：1 /min2、復(fù)蘇屠呦呦與拉斯克獎(jiǎng)屠呦呦與拉斯克獎(jiǎng) 2011年9月24日，拉斯克基金會(huì)將臨床醫(yī)學(xué)研究獎(jiǎng)授予81歲的中國(guó)中醫(yī)研究院研究員屠呦呦，以表彰其在治療瘧疾的治療瘧疾的青蒿素研究青蒿素研究中的貢獻(xiàn)。 這是“拉斯克獎(jiǎng)”設(shè)立65年來(lái)首次首次頒予中國(guó)科學(xué)家中國(guó)科學(xué)家，也是中國(guó)生物醫(yī)學(xué)界迄今獲得的世界級(jí)最高大獎(jiǎng)。 研究背景研究背景 瘧疾瘧疾（Malaria）經(jīng)按蚊叮咬而感染瘧原蟲(chóng)所引起的蟲(chóng)媒傳染病。 19世紀(jì)，從金雞納樹(shù)皮中分離出抗瘧成分奎寧奎寧。隨后，科學(xué)家人工合成了奎寧，又找到了奎寧替代物氯喹氯喹。氯喹藥物一度是抗擊瘧疾的特效藥。 二戰(zhàn)后，瘧原蟲(chóng)產(chǎn)生了抗藥性抗藥性。20世紀(jì)60年代初，瘧疾再次肆瘧，疫情難以控制?？茖W(xué)家開(kāi)始尋找新藥尋