基礎(chǔ)學習實驗_目的基因的PCR擴增及其擴增產(chǎn)物的鑒定_第1頁
基礎(chǔ)學習實驗_目的基因的PCR擴增及其擴增產(chǎn)物的鑒定_第2頁
基礎(chǔ)學習實驗_目的基因的PCR擴增及其擴增產(chǎn)物的鑒定_第3頁
基礎(chǔ)學習實驗_目的基因的PCR擴增及其擴增產(chǎn)物的鑒定_第4頁
基礎(chǔ)學習實驗_目的基因的PCR擴增及其擴增產(chǎn)物的鑒定_第5頁
已閱讀5頁,還剩66頁未讀 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)

文檔簡介

1、會計學1基礎(chǔ)學習實驗基礎(chǔ)學習實驗_目的基因的目的基因的PCR擴增及其擴增及其擴增產(chǎn)物的鑒定擴增產(chǎn)物的鑒定第1頁/共71頁此實驗共包括如下六個部分此實驗共包括如下六個部分1.1. 第一部分,目的基因選擇第一部分,目的基因選擇2.2. 第二部分,第二部分,PCRPCR引物設(shè)計引物設(shè)計3.3. 第三部分,第三部分,PCRPCR實驗操作實驗操作4.4. 第四部分,第四部分,PCRPCR產(chǎn)物電泳鑒定產(chǎn)物電泳鑒定5.5. 第五部分,第五部分,PCRPCR產(chǎn)物測序鑒定產(chǎn)物測序鑒定6.6. 第六部分,目的基因序列變異分析第六部分,目的基因序列變異分析 第2頁/共71頁PCR技術(shù)的發(fā)明技術(shù)的發(fā)明第3頁/共71頁

2、PCR與臨床診斷與臨床診斷第4頁/共71頁第5頁/共71頁第一部分,目的基因選擇第一部分,目的基因選擇候選基因簡介候選基因簡介在本實驗中,有三個候選基因,分別是在本實驗中,有三個候選基因,分別是NGAL,F(xiàn)ascin和和Ezrin。這三個基因在食管癌及其他多種腫瘤中呈過表達,說明它們在腫瘤的發(fā)生發(fā)展這三個基因在食管癌及其他多種腫瘤中呈過表達,說明它們在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要的生物學作用。中起重要的生物學作用。汕頭大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室李恩民課題組曾對這三個基因進汕頭大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室李恩民課題組曾對這三個基因進行了深入研究,在國外雜志上發(fā)表行了深入研究,在國外雜

3、志上發(fā)表SCI收錄研究論文收錄研究論文20余篇,已形成系列優(yōu)勢。余篇,已形成系列優(yōu)勢。同學們可查閱相關(guān)資料,選擇感興趣的基因來做同學們可查閱相關(guān)資料,選擇感興趣的基因來做PCR實驗。實驗。第6頁/共71頁NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)即中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載)即中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白,是脂質(zhì)運載蛋白(蛋白,是脂質(zhì)運載蛋白(lipocalin) 家族的一個成員。家族的一個成員。 NGAL基因的蛋白產(chǎn)物具有保護調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶基因的蛋白產(chǎn)物具有保護調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶-9的活性,作為小分子鐵配合物結(jié)的活性,作為小分子

4、鐵配合物結(jié)合蛋白參與機體鐵代謝和天然免疫反應(yīng)等功能。另外,合蛋白參與機體鐵代謝和天然免疫反應(yīng)等功能。另外,NGAL作為一種早期標志物還可作為一種早期標志物還可以幫助判定缺血性腎損傷程度。以幫助判定缺血性腎損傷程度。 NGAL的的mRNA信息在信息在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中有來自不同實驗室登記的多個版本,包含完核酸數(shù)據(jù)庫中有來自不同實驗室登記的多個版本,包含完整編碼區(qū)的有整編碼區(qū)的有BC033089和和NM_005564等,編碼區(qū)長為等,編碼區(qū)長為597 bp,編碼,編碼198個氨基酸,包含個氨基酸,包含了了N端前部長為端前部長為20個氨基酸的信號肽序列(為核酸序列的個氨基酸的信號肽序列(為核酸序列

5、的1-60 bp)。)。NGAL 基因基因第7頁/共71頁NGAL核酸編碼區(qū)序列及其相應(yīng)的蛋白序列核酸編碼區(qū)序列及其相應(yīng)的蛋白序列:前前20個個AA為信號肽序為信號肽序列列第8頁/共71頁2001年汕頭大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室李恩民課題組以永生化食管上皮細胞年汕頭大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室李恩民課題組以永生化食管上皮細胞系系SHEE 和食管癌細胞系和食管癌細胞系SHEEC 互為對照,用互為對照,用cDNA 微列陣進行篩選,用微列陣進行篩選,用RNA 印跡和印跡和RT-PCR 進行鑒定,進行鑒定,cDNA 克隆測序后與克隆測序后與GenBank 進行進行BLAST 分析比較

6、。結(jié)果表明分析比較。結(jié)果表明NGAL 基基因在因在SHEEC中出現(xiàn)顯著差異過表達,其中出現(xiàn)顯著差異過表達,其cDNA 序列與小鼠序列與小鼠24p3、大鼠、大鼠NRL (neu-related lipocalin) 和人中性粒細胞和人中性粒細胞NGAL 具有較高的相似性。這提示具有較高的相似性。這提示NGAL 基因在永生化食管上皮基因在永生化食管上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化中可能發(fā)揮著重要作用,可能是一種新的癌基因或促癌基因。細胞惡性轉(zhuǎn)化中可能發(fā)揮著重要作用,可能是一種新的癌基因或促癌基因。AB利用利用cDNA 芯片篩選兩種細胞的差異表達基因芯片篩選兩種細胞的差異表達基因A.永生化食管上皮細胞系永生化食管上

7、皮細胞系SHEE B.食管癌細胞系食管癌細胞系SHEEC A B C反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCR檢測檢測NGAL在兩種細胞的在兩種細胞的mRNA水平水平A.永生化食管上皮細胞系永生化食管上皮細胞系SHEE B.食管癌細胞系食管癌細胞系SHEECC. 100 bp DNA marker第9頁/共71頁Fascin蛋白的蛋白的mRNA全長為全長為2767bp,由,由5端非翻譯區(qū)端非翻譯區(qū)111bp堿基,堿基,3端非翻譯區(qū)端非翻譯區(qū)1174bp堿基,堿基,1482bp的全編碼序列區(qū)和的全編碼序列區(qū)和6個個PloyA信號肽組成,編碼信號肽組成,編碼493個氨基酸,分子量約個氨基酸,分子量約為為55kD。Fasc

8、in蛋白定位于細胞質(zhì)張力纖維和細胞膜皺褶蛋白定位于細胞質(zhì)張力纖維和細胞膜皺褶(ruffles),邊緣的絲狀偽足,邊緣的絲狀偽足(filopodia)、微棘、微棘(microspikes)的核心肌動蛋白束中。的核心肌動蛋白束中。以往研究發(fā)現(xiàn),以往研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)ascin基因在許多上皮來源的腫瘤細胞系,如宮頸癌基因在許多上皮來源的腫瘤細胞系,如宮頸癌Hela、胃癌、胃癌AGS、大腸癌、大腸癌LM1215和和SW480、胰腺癌、胰腺癌BxPC3和和T3H4等細胞系中均上調(diào)表達。等細胞系中均上調(diào)表達。細胞的絲狀偽足和微棘與細胞的運動,癌細胞的轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系,提示細胞的絲狀偽足和微棘與細胞的運動,癌細胞的

9、轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系,提示Fascin蛋白可蛋白可能在細胞遷移、細胞粘附以及細胞間信息交流等過程中發(fā)揮作用。能在細胞遷移、細胞粘附以及細胞間信息交流等過程中發(fā)揮作用。Fascin 基因基因第10頁/共71頁ATGACCGCCAACGGCACAGCCGAGGCGGTGCAGATCCAGTTCGGCCTCATCAACTGCGGCAACAAGTACCTGACGGCCGAGGCGTTCGGGTTCAAGGTGAACGCGTCCGCCAGCAGCCTGAAGAAGAAGCAGATCTGGACGCTGGAGCAGCCCCCTGACGAGGCGGGCAGCGCGGCCGTGTGCCTGCGCAGCCACCTGGG

10、CCGCTACCTGGCGGCGGACAAGGACGGCAACGTGACCTGCGAGCGCGAGGTGCCCGGTCCCGACTGCCGTTTCCTCATCGTGGCGCACGACGACGGTCGCTGGTCGCTGCAGTCCGAGGCGCACCGGCGCTACTTCGGCGGCACCGAGGACCGCCTGTCCTGCTTCGCGCAGACGGTGTCCCCCGCCGAGAAGTGGAGCGTGCACATCGCCATGCACCCTCAGGTCAACATCTACAGCGTCACCCGTAAGCGCTACGCGCACCTGAGCGCGCGGCCGGCCGACGAGATCGCCGTGGACCG

11、CGACGTGCCCTGGGGCGTCGACTCGCTCATCACCCTCGCCTTCCAGGACCAGCGCTACAGCGTGCAGACCGCCGACCACCGCTTCCTGCGCCACGACGGGCGCCTGGTGGCGCGCCCCGAGCCGGCCACTGGCTACACGCTGGAGTTCCGCTCCGGCAAGGTGGCCTTCCGCGACTGCGAGGGCCGTTACCTGGCGCCGTCGGGGCCCAGCGGCACGCTCAAGGCGGGCAAGGCCACCAAGGTGGGCAAGGACGAGCTCTTTGCTCTGGAGCAGAGCTGCGCCCAGGTCGTGCTGCAGGC

12、GGCCAACGAGAGGAACGTGTCCACGCGCCAGGGTATGGACCTGTCTGCCAATCAGGACGAGGAGACCGACCAGGAGACCTTCCAGCTGGAGATCGACCGCGACACCAAAAAGTGTGCCTTCCGTACCCACACGGGCAAGTACTGGACGCTGACGGCCACCGGGGGCGTGCAGTCCACCGCCTCCAGCAAGAATGCCAGCTGCTACTTTGACATCGAGTGGCGTGACCGGCGCATCACACTGAGGGCGTCCAATGGCAAGTTTGTGACCTCCAAGAAGAATGGGCAGCTGGCCGCCTCGGT

13、GGAGACAGCAGGGGACTCAGAGCTCTTCCTCATGAAGCTCATCAACCGCCCCATCATCGTGTTCCGCGGGGAGCATGGCTTCATCGGCTGCCGCAAGGTCACGGGCACCCTGGACGCCAACCGCTCCAGCTATGACGTCTTCCAGCTGGAGTTCAACGATGGCGCCTACAACATCAAAGACTCCACAGGCAAATACTGGACGGTGGGCAGTGACTCCGCGGTCACCAGCAGCGGCGACACTCCTGTGGACTTCTTCTTCGAGTTCTGCGACTATAACAAGGTGGCCATCAAGGTGGGCGG

14、GCGCTACCTGAAGGGCGACCACGCAGGCGTCCTGAAGGCCTCGGCGGAAACCGTGGACCCCGCCTCGCTCTGGGAGTACTAGMTANGTAEAVQIQFGLINCGNKYLTAEAFGFKVNASASSLKKKQIWTLEQPPDEAGSAAVCLRSHLGRYLAADKDGNVTCEREVPGPDCRFLIVAHDDGRWSLQSEAHRRYFGGTEDRLSCFAQTVSPAEKWSVHIAMHPQVNIYSVTRKRYAHLSARPADEIAVDRDVPWGVDSLITLAFQDQRYSVQTADHRFLRHDGRLVARPEPATGYTLEFRS

15、GKVAFRDCEGRYLAPSGPSGTLKAGKATKVGKDELFALEQSCAQVVLQAANERNVSTRQGMDLSANQDEETDQETFQLEIDRDTKKCAFRTHTGKYWTLTATGGVQSTASSKNASCYFDIEWRDRRITLRASNGKFVTSKKNGQLAASVETAGDSELFLMKLINRPIIVFRGEHGFIGCRKVTGTLDANRSSYDVFQLEFNDGAYNIKDSTGKYWTVGSDSAVTSSGDTPVDFFFEFCDYNKVAIKVGGRYLKGDHAGVLKASAETVDPASLWEYFascin基因的編碼區(qū)序列基因的編碼區(qū)序列Fas

16、cin基因的蛋白序列基因的蛋白序列第11頁/共71頁Fascin蛋白的三級結(jié)構(gòu):由蛋白的三級結(jié)構(gòu):由4個個-三葉草結(jié)構(gòu)組成,含多個三葉草結(jié)構(gòu)組成,含多個折疊折疊第12頁/共71頁我們課題組發(fā)現(xiàn),在永生化食管上皮細胞我們課題組發(fā)現(xiàn),在永生化食管上皮細胞SHEE向食管癌細胞向食管癌細胞SHEEmt的惡性轉(zhuǎn)化中,的惡性轉(zhuǎn)化中,F(xiàn)ascin基因呈現(xiàn)上調(diào)表達,并且在食管癌組織中也檢測到基因呈現(xiàn)上調(diào)表達,并且在食管癌組織中也檢測到Fascin蛋白呈陽性表達。蛋白呈陽性表達。Fascin在食管癌中的具體功能以及過表達的機制至今仍沒有得到很好的闡明。為此我們在食管癌中的具體功能以及過表達的機制至今仍沒有得到很

17、好的闡明。為此我們設(shè)計并合成了靶向設(shè)計并合成了靶向Fascin基因的基因的siRNA,試圖通過,試圖通過RNA干擾的方法減少干擾的方法減少Fascin基因的表基因的表達,從而探討達,從而探討Fascin對腫瘤的分化、分裂增殖和浸潤等生物學行為的影響。對腫瘤的分化、分裂增殖和浸潤等生物學行為的影響。掃描電鏡結(jié)果顯示抑制掃描電鏡結(jié)果顯示抑制Fascin表達后,表達后,EC109細胞突觸形成明顯減少。細胞突觸形成明顯減少。第13頁/共71頁細胞免疫熒光結(jié)果顯示代表細胞免疫熒光結(jié)果顯示代表Fascin蛋白的綠色熒蛋白的綠色熒光在被干擾細胞(光在被干擾細胞(A)中要比對照細胞()中要比對照細胞(B)的弱

18、)的弱AB第14頁/共71頁第15頁/共71頁Ezrin基因基因Ezrin為為ERM(Ezrin,radixin,moesin )蛋白家族成員之一,)蛋白家族成員之一,ERM家族成員大多位于絲狀突家族成員大多位于絲狀突和膜伸展部位,基本功能就是將肌動蛋白栓系到細胞膜和將膜蛋白錨定在特定的部位,這和膜伸展部位,基本功能就是將肌動蛋白栓系到細胞膜和將膜蛋白錨定在特定的部位,這樣可維持細胞膜表面的一些特殊結(jié)構(gòu),如微絨毛和細胞膜突起等。樣可維持細胞膜表面的一些特殊結(jié)構(gòu),如微絨毛和細胞膜突起等。ERM家族蛋白還參與細胞表面粘附分子的定位,通過細胞與細胞、細胞與基質(zhì)之間的相互家族蛋白還參與細胞表面粘附分子

19、的定位,通過細胞與細胞、細胞與基質(zhì)之間的相互作用參與細胞粘附作用降。作用參與細胞粘附作用降。ERM家族蛋白還是酪氨酸激酶的受體,并通過家族蛋白還是酪氨酸激酶的受體,并通過Rho-GTP酶參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。酶參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Ezrin含有含有585個氨基酸,等電點為個氨基酸,等電點為6.15,理論分子量為,理論分子量為69kD。Ezrin分子帶有大量電荷(分子帶有大量電荷(38.5%的氨基酸殘基帶電荷),這可能是導(dǎo)致它的理論分子量與實際分子量不同的原因(的氨基酸殘基帶電荷),這可能是導(dǎo)致它的理論分子量與實際分子量不同的原因(Ezrin實際分子量為實際分子量為80kD)。)。第16頁/共71頁Ezrin

20、定位與染色體定位與染色體6q25.2-q26,DNA長度為長度為1761個堿基,含個堿基,含13個外顯子。個外顯子。ATGCCGAAACCAATCAATGTCCGAGTTACCACCATGGATGCAGAGCTGGAGTTTGCAATCCAGCCAAATACAACTGGAAAACAGCTTTTTGATCAGGTGGTAAAGACTATCGGCCTCCGGGAAGTGTGGTACTTTGGCCTCCACTATGTGGATAATAAAGGATTTCCTACCTGGCTGAAGCTGGATAAGAAGGTGTCTGCCCAGGAGGTCAGGAAGGAGAATCCCCTCCAGTTCAAGTTCCG

21、GGCCAAGTTCTACCCTGAAGATGTGGCTGAGGAGCTCATCCAGGACATCACCCAGAAACTTTTCTTCCTCCAAGTGAAGGAAGGAATCCTTAGCGATGAGATCTACTGCCCCCCTGAGACTGCCGTGCTCTTGGGGTCCTACGCTGTGCAGGCCAAGTTTGGGGACTACAACAAAGAAGTGCACAAGTCTGGGTACCTCAGCTCTGAGCGGCTGATCCCTCAAAGAGTGATGGACCAGCACAAACTTACCAGGGACCAGTGGGAGGACCGGATCCAGGTGTGGCATGCGGAACACCGTGG

22、GATGCTCAAAGATAATGCTATGTTGGAATACCTGAAGATTGCTCAGGACCTGGAAATGTATGGAATCAACTATTTCGAGATAAAAAACAAGAAAGGAACAGACCTTTGGCTTGGAGTTGATGCCCTTGGACTGAATATTTATGAGAAAGATGATAAGTTAACCCCAAAGATTGGCTTTCCTTGGAGTGAAATCAGGAACATCTCTTTCAATGACAAAAAGTTTGTCATTAAACCCATCGACAAGAAGGCACCTGACTTTGTGTTTTATGCCCCACGTCTGAGAATCAACAAGCGGATCCT

23、GCAGCTCTGCATGGGCAACCATGAGTTGTATATGCGCCGCAGGAAGCCTGACACCATCGAGGTGCAGCAGATGAAGGCCCAGGCCCGGGAGGAGAAGCATCAGAAGCAGCTGGAGCGGCAACAGCTGGAAACAGAGAAGAAAAGGAGAGAAACCGTGGAGAGAGAGAAAGAGCAGATGATGCGCGAGAAGGAGGAGTTGATGCTGCGGCTGCAGGACTATGAGGAGAAGACAAAGAAGGCAGAGAGAGAGCTCTCGGAGCAGATTCAGAGGGCCCTGCAGCTGGAGGAGGAGAGGAAGCG

24、GGCACAGGAGGAGGCCGAGCGCCTAGAGGCTGACCGTATGGCTGCACTGCGGGCTAAGGAGGAGCTGGAGAGACAGGCGGTGGATCAGATAAAGAGCCAGGAGCAGCTGGCTGCGGAGCTTGCAGAATACACTGCCAAGATTGCCCTCCTGGAAGAGGCGCGGAGGCGCAAGGAGGATGAAGTTGAAGAGTGGCAGCACAGGGCCAAAGAAGCCCAGGATGACCTGGTGAAGACCAAGGAGGAGCTGCACCTGGTGATGACAGCACCCCCGCCCCCACCACCCCCCGTGTACGAGCCGGT

25、GAGCTACCATGTCCAGGAGAGCTTGCAGGATGAGGGCGCAGAGCCCACGGGCTACAGCGCGGAGCTGTCTAGTGAGGGCATCCGGGATGACCGCAATGAGGAGAAGCGCATCACTGAGGCAGAGAAGAACGAGCGTGTGCAGCGGCAGCTGCTGACGCTGAGCAGCGAGCTGTCCCAGGCCCGAGATGAGAATAAGAGGACCCACAATGACATCATCCACAACGAGAACATGAGGCAAGGCCGGGACAAGTACAAGACGCTGCGGCAGATCCGGCAGGGCAACACCAAGCAGCGCATCGA

26、CGAGTTCGAGGCCCTGTAAEzrin的編碼區(qū)序列的編碼區(qū)序列第17頁/共71頁Ezrin蛋白含有四個功能域蛋白含有四個功能域名稱名稱起始起始終點終點功能功能FERM_N 986將胞漿蛋白連接到膜上將胞漿蛋白連接到膜上FERM_M 88206FERM_C 210299ERM 338586結(jié)合胞漿蛋白結(jié)合胞漿蛋白第18頁/共71頁第19頁/共71頁我們課題組發(fā)現(xiàn)我們課題組發(fā)現(xiàn)Ezrin在食管癌及切緣食管粘膜組織中的位置分布有胞膜分布、胞漿分在食管癌及切緣食管粘膜組織中的位置分布有胞膜分布、胞漿分布和胞膜胞漿混合分布等三種模式。惡性程度越高的癌細胞越易具有胞漿分布模式,說布和胞膜胞漿混合

27、分布等三種模式。惡性程度越高的癌細胞越易具有胞漿分布模式,說明明Ezrin細胞定位的變化可能在食管癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。細胞定位的變化可能在食管癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。第20頁/共71頁第二部分,第二部分,PCR引物設(shè)計引物設(shè)計引物決定了引物決定了PCR產(chǎn)物的長度和特異性。目前有多種引物設(shè)計軟件,如產(chǎn)物的長度和特異性。目前有多種引物設(shè)計軟件,如primer premier5、Oligo和北京軍事醫(yī)學科學院李伍舉教授開發(fā)的和北京軍事醫(yī)學科學院李伍舉教授開發(fā)的Biosun等,等,Internet免費引物設(shè)計網(wǎng)站有免費引物設(shè)計網(wǎng)站有primer 3,Primerfinder等。等。

28、引物設(shè)計有以下幾個原則:引物設(shè)計有以下幾個原則:(1 1)引物的特異性。引物應(yīng)根據(jù)目的序列進行設(shè)計,引物與非靶序列之間不要超過)引物的特異性。引物應(yīng)根據(jù)目的序列進行設(shè)計,引物與非靶序列之間不要超過 7070的同源性或連續(xù)的同源性或連續(xù)8 8個的堿基互補,減少非特異產(chǎn)物;個的堿基互補,減少非特異產(chǎn)物;(2 2)引物的長度。一般指引物中能與模板序列互補結(jié)合的部分,不包括在)引物的長度。一般指引物中能與模板序列互補結(jié)合的部分,不包括在5 5端額外端額外增加的酶切位點序列和其他序列。引物長度以增加的酶切位點序列和其他序列。引物長度以181824 bp24 bp為佳。為佳。第21頁/共71頁(3)引物)

29、引物3末端的堿基。引物末端的堿基。引物3末端是延伸的始端,堿基錯配會影響延伸效率。當最后一個末端是延伸的始端,堿基錯配會影響延伸效率。當最后一個堿基是堿基是A時,容易發(fā)生錯配,所以引物時,容易發(fā)生錯配,所以引物3末端最好不要為末端最好不要為A;(4)引物的)引物的G+C含量一般為含量一般為4060,過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng);,過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng);(5)兩條引物不能形成穩(wěn)定的二聚體,或引物自身不能形成穩(wěn)定的二級發(fā)夾結(jié)構(gòu),這些都)兩條引物不能形成穩(wěn)定的二聚體,或引物自身不能形成穩(wěn)定的二級發(fā)夾結(jié)構(gòu),這些都會影響引物與模板的結(jié)合。會影響引物與模板的結(jié)合。(6)兩條引物的融解溫度)兩條引物的融

30、解溫度Tm值盡量不要相差太大,引物的值盡量不要相差太大,引物的Tm值粗略計算公式為值粗略計算公式為Tm = 4 (G+C)+2(A+T););(7)引物的)引物的5端對擴增特異性沒有影響,因此可以被修飾而不影響擴增的特異性,引物端對擴增特異性沒有影響,因此可以被修飾而不影響擴增的特異性,引物5端端修飾包括加酶切位點、標記生物素和熒光等,引物修飾包括加酶切位點、標記生物素和熒光等,引物3端是延伸的開始,不能進行任何修端是延伸的開始,不能進行任何修飾。飾。第22頁/共71頁引物設(shè)計軟件引物設(shè)計軟件primer premier 5.0的使用的使用第23頁/共71頁可通過兩個方法將序列輸入軟件中可通過

31、兩個方法將序列輸入軟件中在表中粘貼序列在表中粘貼序列打開原有的序列文件打開原有的序列文件第24頁/共71頁選擇序列文選擇序列文件所在位置件所在位置第25頁/共71頁 在對話框中輸入待擴增序列在對話框中輸入待擴增序列 點擊左上角的點擊左上角的“Primer”按鈕按鈕第26頁/共71頁Hairpin: 引物自身是否會形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物自身是否會形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)Dimer: 同一種引物是否會形成二聚體同一種引物是否會形成二聚體False primiring: 引物在待擴增序列中其他位置是否有配對引物在待擴增序列中其他位置是否有配對Cross Dimer: 正向與反向引物間是否會形成二聚體正向與反向引物間是

32、否會形成二聚體引物設(shè)計界面引物設(shè)計界面正向和正向和反向引反向引物的互物的互換換正向和反向正向和反向引物的評價引物的評價正向和反向正向和反向引物的信息引物的信息每點擊左每點擊左邊紅色的邊紅色的按鈕,就按鈕,就出現(xiàn)相應(yīng)出現(xiàn)相應(yīng)的內(nèi)容的內(nèi)容對正向和反向引物進行編輯對正向和反向引物進行編輯第27頁/共71頁可對引物進行增加或減少堿基可對引物進行增加或減少堿基用鍵盤輸入了用鍵盤輸入了5 5個堿基個堿基第28頁/共71頁引物的信息引物的信息改動后引物的信息改動后引物的信息第29頁/共71頁重新回到雙引物的界面重新回到雙引物的界面第30頁/共71頁“Edit”“Copy”“Sense Primer”5 CG

33、CCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA 3輸出引物序列輸出引物序列第31頁/共71頁了解并掌握了解并掌握PCR基因擴增的基本原理基因擴增的基本原理熟悉熟悉PCR基因擴增技術(shù)的具體操作過程基因擴增技術(shù)的具體操作過程 實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康牡谌糠?,第三部分,PCR實驗操作實驗操作第32頁/共71頁一、概述一、概述 PCR:使用一對寡核苷酸引物,以目的序列為模板,利用:使用一對寡核苷酸引物,以目的序列為模板,利用DNA合成合成 酶和四種脫氧核糖酶和四種脫氧核糖核酸進行核酸進行DNA的體外合成反應(yīng)。的體外合成反應(yīng)。 PCR技術(shù)具有靈敏度高,特異性高、操作方便和重復(fù)性好等特點,能夠在幾個小

34、時內(nèi)獲技術(shù)具有靈敏度高,特異性高、操作方便和重復(fù)性好等特點,能夠在幾個小時內(nèi)獲得多達幾百萬拷貝的目的基因。得多達幾百萬拷貝的目的基因。 該技術(shù)在上個世紀該技術(shù)在上個世紀80年代中期由美國年代中期由美國K.Mullis發(fā)明建立,經(jīng)過近二十年已發(fā)展成包括多發(fā)明建立,經(jīng)過近二十年已發(fā)展成包括多種衍生技術(shù),在很多領(lǐng)域中廣泛使用,種衍生技術(shù),在很多領(lǐng)域中廣泛使用,K.Mullis也因此獲得也因此獲得1993年度的諾貝爾化學獎。年度的諾貝爾化學獎。第33頁/共71頁二、二、PCR基本原理基本原理 DNA在細胞中的復(fù)制是一個復(fù)雜的酶促脫氧核糖核酸聚合過程,是在細胞中的復(fù)制是一個復(fù)雜的酶促脫氧核糖核酸聚合過程

35、,是 DNA聚合酶、聚合酶、DNA連接酶、引發(fā)酶、連接酶、引發(fā)酶、RNA引物、四種脫氧核糖核酸、引物、四種脫氧核糖核酸、DNA超螺旋酶、離子環(huán)境等超螺旋酶、離子環(huán)境等多成份參與的過程。多成份參與的過程。 PCR是在試管內(nèi)使用最基本的成份模擬了細胞內(nèi)的是在試管內(nèi)使用最基本的成份模擬了細胞內(nèi)的DNA復(fù)制,所以在一個復(fù)制,所以在一個PCR中中必需成分是必需成分是 1. 模板模板DNA 2. DNA聚合酶聚合酶 3. 四種脫氧核糖核酸四種脫氧核糖核酸 4. 正向和反向兩條引物正向和反向兩條引物 5. 適當?shù)木彌_體系。適當?shù)木彌_體系。第34頁/共71頁模板序列:待擴增的模板序列:待擴增的DNA序列,一般

36、為雙鏈的序列,一般為雙鏈的DNA可包括線形雙螺旋可包括線形雙螺旋DNA,如基,如基因組因組DNA,及閉環(huán)雙鏈,及閉環(huán)雙鏈DNA,如質(zhì)粒;,如質(zhì)粒;模板的來源很廣,如從細胞模板的來源很廣,如從細胞/細菌中提取基因組細菌中提取基因組DNA、提取、提取mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA、質(zhì)粒、病毒等;、質(zhì)粒、病毒等;每個反應(yīng)中模板的量為每個反應(yīng)中模板的量為1 ng1 g。質(zhì)粒。質(zhì)粒DNA和純化的和純化的DNA的量可少一些,而基因的量可少一些,而基因組組DNA的量應(yīng)多一些。的量應(yīng)多一些。PCR靈敏度很高,所以在操作中注意避免非目的基因序列的污染,否則會導(dǎo)致靈敏度很高,所以在操作中注意避免非目的基

37、因序列的污染,否則會導(dǎo)致PCR的非特異性擴增。的非特異性擴增。1、模板、模板DNA第35頁/共71頁引物(引物(primer)也稱為寡核苷酸引物,常規(guī)的)也稱為寡核苷酸引物,常規(guī)的PCR反應(yīng)需要兩種引物,分別成為反應(yīng)需要兩種引物,分別成為5端引端引物和物和3端引物,或稱為正向引物和反向引物。端引物,或稱為正向引物和反向引物。通常通常DNA及及mRNA序列的寫法為序列的寫法為53,所以,所以5端引物與目的序列的端引物與目的序列的5末端序列相同,而末端序列相同,而3端引物與目的序列的端引物與目的序列的3末端序列反向互補。末端序列反向互補。2 2、引物、引物它們作為它們作為DNADNA擴增的起始部分

38、,能限定待擴增擴增的起始部分,能限定待擴增DNADNA序列的長度。序列的長度。為了保證擴增的特異性和有效性,引物與模板相匹配部分應(yīng)至少有為了保證擴增的特異性和有效性,引物與模板相匹配部分應(yīng)至少有151518 bp18 bp。5 55 53 33 35 55 53 33 3上游引物上游引物下游引物下游引物第36頁/共71頁DNA聚合酶:以聚合酶:以DNA為模板,以脫氧核糖核酸為底物催化合成新的為模板,以脫氧核糖核酸為底物催化合成新的DNA的一種酶。的一種酶。早期的早期的PCR反應(yīng)使用的反應(yīng)使用的DNA聚合酶為大腸桿菌聚合酶為大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I的的Klenow片段。但該酶在高溫片段。但該

39、酶在高溫下容易失活,需要在每次合成反應(yīng)進行時候再加入一份酶。下容易失活,需要在每次合成反應(yīng)進行時候再加入一份酶。隨著新的耐熱隨著新的耐熱DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)及在聚合酶的發(fā)現(xiàn)及在PCR反應(yīng)中的應(yīng)用,使反應(yīng)中的應(yīng)用,使PCR操作更方便,產(chǎn)量更穩(wěn)定操作更方便,產(chǎn)量更穩(wěn)定。目前商品化的目前商品化的DNA聚合酶有聚合酶有Taq DNA聚合酶和聚合酶和Pfu DNA聚合酶。聚合酶。Taq DNA聚合酶最適工作溫度為聚合酶最適工作溫度為75-80。該酶具有。該酶具有53聚合酶活性,在鎂離子存在情況聚合酶活性,在鎂離子存在情況下可催化核苷酸沿下可催化核苷酸沿53方向發(fā)生聚合反應(yīng)。方向發(fā)生聚合反應(yīng)。3、DNA聚合

40、酶聚合酶第37頁/共71頁4 4、脫氧核糖核酸、脫氧核糖核酸四種脫氧核苷三磷酸即四種脫氧核苷三磷酸即dATP、dTTP、dCTP和和dGTP,為,為PCR反應(yīng)中反應(yīng)中DNA合成原料。合成原料。在新的一個反應(yīng)體系中,這四種脫氧核糖核酸的起始濃度應(yīng)該都相等,如果其中一種在新的一個反應(yīng)體系中,這四種脫氧核糖核酸的起始濃度應(yīng)該都相等,如果其中一種的濃度明顯不同于其他的就會誘發(fā)錯配,并降低新鏈合成速度。的濃度明顯不同于其他的就會誘發(fā)錯配,并降低新鏈合成速度。第38頁/共71頁緩沖液提供緩沖液提供PCR反應(yīng)所必需的合適酸堿度與離子環(huán)境。主要成分有反應(yīng)所必需的合適酸堿度與離子環(huán)境。主要成分有KCl、Tris

41、-Cl和和MgCl2。其中其中Mg2的濃度最重要,它能影響的濃度最重要,它能影響DNA聚合酶的活性,以及模板與聚合酶的活性,以及模板與PCR產(chǎn)物的產(chǎn)物的解鏈溫度。解鏈溫度。5 5、緩沖液、緩沖液第39頁/共71頁1.變性:是指模板的熱變性,雙螺旋模版變性:是指模板的熱變性,雙螺旋模版DNA成為單鏈的成為單鏈的DNA分子;在應(yīng)用分子;在應(yīng)用Taq DNA聚聚合酶進行合酶進行PCR反應(yīng)時,變性往往在反應(yīng)時,變性往往在9495條件下進行。這也是條件下進行。這也是Taq DNA聚合酶進行聚合酶進行30個左右的個左右的PCR循環(huán)而活力不致受到過多損失時所能耐受的最適溫度。循環(huán)而活力不致受到過多損失時所能

42、耐受的最適溫度。2.退火:是指引物和模板在局部形成互補的雜交鏈的過程。退火溫度比兩條寡核苷酸引物退火:是指引物和模板在局部形成互補的雜交鏈的過程。退火溫度比兩條寡核苷酸引物的熔解溫度低的熔解溫度低510,PCR實驗要對退火溫度進行優(yōu)化。實驗要對退火溫度進行優(yōu)化。二、二、PCR基本步驟基本步驟第40頁/共71頁3.延伸:在鎂離子存在條件下,延伸:在鎂離子存在條件下,DNA聚合酶按堿基互補原則,催化四種脫氧核糖核酸加聚合酶按堿基互補原則,催化四種脫氧核糖核酸加在引物的在引物的3端,使引物沿端,使引物沿53方向生成與模版方向生成與模版DNA互補的新互補的新DNA鏈。鏈。雙鏈模版雙鏈模版DNADNA變

43、性變性退火退火5 53 35 53 35 55 53 33 35 55 53 33 35 55 53 33 3上游引物上游引物下游引物下游引物延伸延伸3 35 55 53 33 35 55 53 3多次循環(huán)多次循環(huán)(2 2n n 拷貝)拷貝)第41頁/共71頁下面為一個典型的下面為一個典型的PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)置:循環(huán)參數(shù)設(shè)置:備注:備注:* 比兩條引物的比兩條引物的Tm值值低低510。94 5 min 94 30 s X * 30 s 72 1 kb/min 72 5 min25-3525-35個循環(huán)個循環(huán)第42頁/共71頁三、影響三、影響PCR因素因素 雖然雖然PCRPCR操作很方便,但影響因

44、素也很多,從而影響操作很方便,但影響因素也很多,從而影響PCRPCR的特異性和高效性。的特異性和高效性。1.1. 引物引物2.2. 變性溫度和時間變性溫度和時間3.3. 退火溫度和時間退火溫度和時間4.4. 延伸溫度和時間延伸溫度和時間5.5. 循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)第43頁/共71頁引物決定了引物決定了PCR產(chǎn)物的長度和特異性。產(chǎn)物的長度和特異性。引物的設(shè)計要求請看本實驗講義引物的設(shè)計要求請看本實驗講義“引物設(shè)計引物設(shè)計”部分。部分。1 1、引物、引物第44頁/共71頁在在PCR反應(yīng)剛開始時,為保證作為模板的雙鏈反應(yīng)剛開始時,為保證作為模板的雙鏈DNA完全變性成單鏈完全變性成單鏈DNA,一般設(shè)為,

45、一般設(shè)為95、5 min;在隨后的循環(huán)中,可設(shè)為;在隨后的循環(huán)中,可設(shè)為95、30s。有些模板有些模板DNA的的G+C含量較高,變性溫度就越高。太高的變性溫度和太長的變性時間含量較高,變性溫度就越高。太高的變性溫度和太長的變性時間會影響會影響DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。 2 2、變性溫度和時間、變性溫度和時間第45頁/共71頁退火溫度與引物的退火溫度與引物的Tm值相關(guān),一般比值相關(guān),一般比Tm值低值低510。退火溫度設(shè)置過低,會導(dǎo)致非特異性擴增;退火溫度過高,則影響引物與模板的結(jié)合退火溫度設(shè)置過低,會導(dǎo)致非特異性擴增;退火溫度過高,則影響引物與模板的結(jié)合而降低而降低PCR效率。效率。在退

46、火時間里,引物與模板相結(jié)合,時間太短會使引物與模板未完全結(jié)合而導(dǎo)致無法在退火時間里,引物與模板相結(jié)合,時間太短會使引物與模板未完全結(jié)合而導(dǎo)致無法延伸;時間過長容易產(chǎn)生引物在模板上的非特異性結(jié)合或形成引物二聚體。退火時間延伸;時間過長容易產(chǎn)生引物在模板上的非特異性結(jié)合或形成引物二聚體。退火時間設(shè)置為設(shè)置為30s基本上就足夠了?;旧暇妥銐蛄恕? 3、退火溫度和時間、退火溫度和時間第46頁/共71頁所用所用DNA聚合酶的最佳活性溫度決定了延伸溫度,如聚合酶的最佳活性溫度決定了延伸溫度,如Taq聚合酶的最佳溫度為聚合酶的最佳溫度為7080度,所以延伸溫度設(shè)為度,所以延伸溫度設(shè)為72即可。即可。在實踐

47、中在實踐中Taq DNA聚合酶的延伸效率約為聚合酶的延伸效率約為500 bp/30 s,若待擴增的片段較長,可適,若待擴增的片段較長,可適當延長時間,但時間過長又會致非特異性擴增。當延長時間,但時間過長又會致非特異性擴增。4 4、延伸溫度和時間、延伸溫度和時間第47頁/共71頁在經(jīng)過一定的循環(huán)次數(shù)后,隨著聚合酶活性的降低,引物濃度降低等因素,在經(jīng)過一定的循環(huán)次數(shù)后,隨著聚合酶活性的降低,引物濃度降低等因素,PCR產(chǎn)產(chǎn)物不再呈指數(shù)增加,此時稱為平臺效應(yīng)。物不再呈指數(shù)增加,此時稱為平臺效應(yīng)。循環(huán)次數(shù)設(shè)為循環(huán)次數(shù)設(shè)為2530次,即可滿足一般的分子生物學實驗要求。過多的循環(huán)次數(shù)會導(dǎo)次,即可滿足一般的分

48、子生物學實驗要求。過多的循環(huán)次數(shù)會導(dǎo)致堿基錯配增加和非特異性擴增的出現(xiàn)。致堿基錯配增加和非特異性擴增的出現(xiàn)。5 5、循環(huán)次數(shù)、循環(huán)次數(shù)第48頁/共71頁1.DNA模板:以模板:以pPIC9-NGAL為模板,來擴增不包含信號肽序列的為模板,來擴增不包含信號肽序列的NGAL編碼區(qū)編碼區(qū)2.引物:引物: PCR上游引物(上游引物(P1):):5-CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA -3 PCR下游引物(下游引物(P2):):5-CGGAATTCTCAGCCGTCGATACACTGGTC -3 底下有橫線的堿基為酶切位點:底下有橫線的堿基為酶切位點:XholI (P1),Ec

49、oRI(P2)3.2Taq PCR Master Mix (廣州佰路生物科技有限公司生產(chǎn),產(chǎn)品成份為:(廣州佰路生物科技有限公司生產(chǎn),產(chǎn)品成份為: 0.1 U Taq DNA Polymerase/ml 500 mM dNTP each 50 mM Tris-HCl (pH8.7) 20 mM KCl 4 mM MgCl2 4.無菌水無菌水5.100bp plus ladder DNA marker本實驗所用試劑本實驗所用試劑第49頁/共71頁實驗操作實驗操作95 2min95 2min94 30s94 30s60 30s 60 30s 72 30s72 30s72 5min72 5min30

50、個循環(huán)個循環(huán)1.按以下次序?qū)⒏鞒煞旨影匆韵麓涡驅(qū)⒏鞒煞旨覲CR管中。管中。 2Taq PCR MasterMix 5 l P1 (12.5 M ) 1 l P2 (12.5 M) 1 l 無菌水無菌水 2 l pPIC9-NGAL 1 l 反應(yīng)體系:反應(yīng)體系:10 l混勻,稍加離心并標記?;靹?,稍加離心并標記。2.PCR反應(yīng)于反應(yīng)于ABI 2720 Thermer cycler進行,進行,PCR反應(yīng)條件:反應(yīng)條件: 第50頁/共71頁 凝膠準備凝膠準備 稱稱1g瓊脂糖置三角瓶中,加瓊脂糖置三角瓶中,加100ml 1TAE; 微波爐加熱大約微波爐加熱大約2分鐘,熔化瓊脂糖;分鐘,熔化瓊脂糖; 熔

51、化的瓊脂糖自然冷卻到熔化的瓊脂糖自然冷卻到6070時,加入時,加入EB 5l,并輕輕混勻。,并輕輕混勻。 膠床準備膠床準備 將梳子垂直插入到膠床的小凹槽內(nèi),梳齒底端和床面有將梳子垂直插入到膠床的小凹槽內(nèi),梳齒底端和床面有1mm的間隙;的間隙; 將膠床放在調(diào)整好的水平臺上;將膠床放在調(diào)整好的水平臺上; 鋪膠:將冷卻致鋪膠:將冷卻致60的凝膠倒入準備好的膠床內(nèi),凝膠厚度約的凝膠倒入準備好的膠床內(nèi),凝膠厚度約5 mm;室溫下靜置室溫下靜置30分鐘左右,凝膠固化。將帶凝膠分鐘左右,凝膠固化。將帶凝膠 的膠床置于電泳槽中,并使樣品的膠床置于電泳槽中,并使樣品孔位于電場負極;孔位于電場負極;第四部分,第四

52、部分,PCR產(chǎn)物電泳鑒定產(chǎn)物電泳鑒定第51頁/共71頁向電泳槽中加入向電泳槽中加入1TAE電泳緩沖液,越過凝膠表面即可;電泳緩沖液,越過凝膠表面即可;輕輕拔出固定在凝膠中的梳子;輕輕拔出固定在凝膠中的梳子; 樣品準備:向核酸樣品中加入約為樣品體積樣品準備:向核酸樣品中加入約為樣品體積1/6的上樣緩沖液,用加樣器輕輕混勻的上樣緩沖液,用加樣器輕輕混勻上樣:用加樣器吸取樣品,輕輕的加入到凝膠的樣品孔中,加樣量為上樣:用加樣器吸取樣品,輕輕的加入到凝膠的樣品孔中,加樣量為10l蓋上電泳槽,接通電源,開始電泳;蓋上電泳槽,接通電源,開始電泳;電泳條件:電壓電泳條件:電壓80v;時間;時間2025分鐘;

53、分鐘;電泳結(jié)束后,切斷電源,取出凝膠;電泳結(jié)束后,切斷電源,取出凝膠;電泳結(jié)果分析:電泳結(jié)果分析: 紫外檢測儀直接觀察電泳條帶紫外檢測儀直接觀察電泳條帶 攝影記錄攝影記錄 第52頁/共71頁瓊脂糖凝膠電泳預(yù)期結(jié)果:瓊脂糖凝膠電泳預(yù)期結(jié)果:500 bp560 bp第53頁/共71頁PCR產(chǎn)物的直接測序:從瓊脂糖凝膠中回收產(chǎn)物的直接測序:從瓊脂糖凝膠中回收PCR產(chǎn)物后測序。產(chǎn)物后測序。 PCR產(chǎn)物連接到載體后測序:從瓊脂糖凝膠中回收產(chǎn)物連接到載體后測序:從瓊脂糖凝膠中回收PCR產(chǎn)物,利用連接酶將產(chǎn)物,利用連接酶將PCR產(chǎn)物連接到載體如產(chǎn)物連接到載體如pGEM-T后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌提取質(zhì)粒后測序。后,

54、轉(zhuǎn)化大腸桿菌提取質(zhì)粒后測序。美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 3130 基因分析儀基因分析儀 24 小時無人監(jiān)控操作小時無人監(jiān)控操作 儀器設(shè)置更方便更簡單儀器設(shè)置更方便更簡單 新型自動灌膠系統(tǒng)進行灌膠新型自動灌膠系統(tǒng)進行灌膠 檢測池加熱器改進了溫度控制檢測池加熱器改進了溫度控制 通過通過 96 孔和孔和 384 孔板自動進樣孔板自動進樣 多色熒光檢測多色熒光檢測 第五部分,第五部分,PCR產(chǎn)物測序鑒定產(chǎn)物測序鑒定第54頁/共71頁觀看測序結(jié)果的軟件觀看測序結(jié)果的軟件Chromas軟件運行界面軟件運行界面打開一個測序結(jié)打開一個測序結(jié)果果峰型排列良好,無高大雜峰,說明測序結(jié)果可靠峰型排列良

55、好,無高大雜峰,說明測序結(jié)果可靠第55頁/共71頁將測序結(jié)果輸出為文本文件將測序結(jié)果輸出為文本文件第56頁/共71頁雖然現(xiàn)在的雖然現(xiàn)在的PCR技術(shù)使技術(shù)使PCR擴增有很高的真實性,即擴增有很高的真實性,即PCR產(chǎn)物與模板產(chǎn)物與模板DNA的一致性的一致性很高,但由于很高,但由于PCR擴增畢竟是在試管內(nèi)進行的擴增畢竟是在試管內(nèi)進行的DNA復(fù)制,沒有類似細胞內(nèi)復(fù)制,沒有類似細胞內(nèi)DNA錯配錯配修復(fù)機制,所以,在修復(fù)機制,所以,在PCR產(chǎn)物擴增以后,仍要分析其與模板產(chǎn)物擴增以后,仍要分析其與模板DNA的是否完全一致。的是否完全一致。最好的方法是將最好的方法是將PCR產(chǎn)物測序,將測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫作序列比

56、對分析。產(chǎn)物測序,將測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫作序列比對分析。第六部分,目的基因序列變異分析第六部分,目的基因序列變異分析第57頁/共71頁/ 第58頁/共71頁第59頁/共71頁第60頁/共71頁核酸序列比對核酸序列比對/Blast.cgi 第61頁/共71頁BLAST分析界面分析界面輸入測序結(jié)果輸入測序結(jié)果第62頁/共71頁結(jié)果界面之一結(jié)果界面之一第63頁/共71頁結(jié)果界面之二結(jié)果界面之二第64頁/共71頁此實驗共包括如下六個部分此實驗共包括如下六個部分1.1. 第一部分,目的基因選擇第一部分

57、,目的基因選擇2.2. 第二部分,第二部分,PCRPCR引物設(shè)計引物設(shè)計3.3. 第三部分,第三部分,PCRPCR實驗操作實驗操作4.4. 第四部分,第四部分,PCRPCR產(chǎn)物電泳鑒定產(chǎn)物電泳鑒定5.5. 第五部分,第五部分,PCRPCR產(chǎn)物測序鑒定產(chǎn)物測序鑒定6.6. 第六部分,目的基因序列變異分析第六部分,目的基因序列變異分析 第65頁/共71頁2001年汕頭大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室李恩民課題組以永生化食管上皮細胞年汕頭大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室李恩民課題組以永生化食管上皮細胞系系SHEE 和食管癌細胞系和食管癌細胞系SHEEC 互為對照,用互為對照,用cDNA 微列陣進行篩選,用微列陣進行篩選,用RNA 印跡和印跡和RT-PCR 進行鑒定,進行鑒定,cDNA 克隆測序后與克隆測序后與GenBank 進行進行BLAST 分析比較。結(jié)果表明分析比較。結(jié)果表明NGAL 基基因在因在SHEEC中出現(xiàn)顯著差異過表達,其中出現(xiàn)顯著差異過表達,其cDNA 序列與小鼠序列與小鼠24p3、大鼠、大鼠NRL (neu-rela

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論