WesternBlot詳解及問(wèn)題分析學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1WesternBlot詳解及問(wèn)題詳解及問(wèn)題(wnt)分析分析第一頁(yè)，共43頁(yè)。第1頁(yè)/共42頁(yè)第二頁(yè)，共43頁(yè)。第2頁(yè)/共42頁(yè)第三頁(yè)，共43頁(yè)。第3頁(yè)/共42頁(yè)第四頁(yè)，共43頁(yè)。p 高分辨率的電泳技術(shù)p 特異敏感的抗原-抗體反應(yīng)p 1-5ng中等大小(dxio)的靶蛋白第4頁(yè)/共42頁(yè)第五頁(yè)，共43頁(yè)。第5頁(yè)/共42頁(yè)第六頁(yè)，共43頁(yè)。l蛋白樣品的制備lSDS-PAGEl轉(zhuǎn)膜l封閉l一抗雜交l二抗雜交l底物(d w)顯色第6頁(yè)/共42頁(yè)第七頁(yè)，共43頁(yè)。第7頁(yè)/共42頁(yè)第八頁(yè)，共43頁(yè)。第8頁(yè)/共42頁(yè)第九頁(yè)，共43頁(yè)。1M Tris-HCl(pH6.8)10 ml1M DTT20

2、mlSDS4 g甘油甘油20 ml溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)0.2 g總體積總體積100ml100mM Tris-HCl(pH6.8)200mM DTT4%SDS0.2%溴酚蘭20%甘油ddH2O第9頁(yè)/共42頁(yè)第十頁(yè)，共43頁(yè)。第10頁(yè)/共42頁(yè)第十一頁(yè)，共43頁(yè)。（1）具有相同的形狀，形狀像一個(gè)長(zhǎng)橢圓棒（2）平均1g 蛋白質(zhì)結(jié)合(jih)1.4g SDS（3）短軸對(duì)不同的蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束基本上是相同的（4）長(zhǎng)軸的長(zhǎng)度則與亞基分子量的大小成正比第11頁(yè)/共42頁(yè)第十二頁(yè)，共43頁(yè)。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳第12頁(yè)/共42頁(yè)第十三頁(yè)，共43頁(yè)。第13頁(yè)/共42頁(yè)第十四頁(yè)，共43頁(yè)。第14頁(yè)/共42頁(yè)第

3、十五頁(yè)，共43頁(yè)。 聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel)是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡(jiǎn)稱Acr)和交聯(lián)劑(crosslinker)N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(N,N-methylenebisacylamide，簡(jiǎn)稱Bis)在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠?；瘜W(xué)惰性強(qiáng)，具有一定(ydng)的機(jī)械強(qiáng)度和透明度。是良好的電泳介質(zhì)。第15頁(yè)/共42頁(yè)第十六頁(yè)，共43頁(yè)。單體：丙烯酰胺（Acr）；交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（Bis）； 催化劑：過(guò)硫酸胺或核黃素（AP）；加速(ji s)劑：四甲基乙二胺（TEMED）；產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠聚丙烯酰胺凝膠聚合機(jī)

4、理是通過(guò)提供氧游離基(free radicals)的催化，使體系發(fā)生氧化(ynghu)還原作用(catalyst-redox systems)來(lái)完成的。催化體系主要有化學(xué)催化（APTEMED）和光化學(xué)催化（核黃素TMTED）體系。第16頁(yè)/共42頁(yè)第十七頁(yè)，共43頁(yè)。凝膠濃度（）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212SDS-PAGE濃縮膠(5% Acrylamide)及分離(fnl)膠配方表： 第17頁(yè)/共42頁(yè)第十八頁(yè)，共43頁(yè)。 作用作用緩沖液緩沖液PHPH凝膠濃度凝膠濃度濃縮膠濃縮膠使蛋白樣品濃縮pH6.8Tris-Cl低，2-5%分離膠分離膠

5、使蛋白樣品分離pH8.8Tris-Cl高，根據(jù)蛋白大小電泳(din yn)緩沖液：pH8.3 Tris-甘氨酸系統(tǒng)。第18頁(yè)/共42頁(yè)第十九頁(yè)，共43頁(yè)。ddH2O0.1%SDS:8%第19頁(yè)/共42頁(yè)第二十頁(yè)，共43頁(yè)。灌制積層膠 插入(ch r)梳子 第20頁(yè)/共42頁(yè)第二十一頁(yè)，共43頁(yè)。Staking gelSeparating gel第21頁(yè)/共42頁(yè)第二十二頁(yè)，共43頁(yè)。第22頁(yè)/共42頁(yè)第二十三頁(yè)，共43頁(yè)。n第23頁(yè)/共42頁(yè)第二十四頁(yè)，共43頁(yè)。第24頁(yè)/共42頁(yè)第二十五頁(yè)，共43頁(yè)。第25頁(yè)/共42頁(yè)第二十六頁(yè)，共43頁(yè)。第26頁(yè)/共42頁(yè)第二十七頁(yè)，共43頁(yè)。第27頁(yè)/共

6、42頁(yè)第二十八頁(yè)，共43頁(yè)。一抗、二抗孵育(f y)第28頁(yè)/共42頁(yè)第二十九頁(yè)，共43頁(yè)。辣根過(guò)氧化物酶法（HRP）堿性(jin xn)磷酸酶法（AP）化學(xué)發(fā)光顯色法(HRP)第29頁(yè)/共42頁(yè)第三十頁(yè)，共43頁(yè)。體與抗原分離，適用于任何化學(xué)體與抗原分離，適用于任何化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)。發(fā)光底物系統(tǒng)。第30頁(yè)/共42頁(yè)第三十一頁(yè)，共43頁(yè)。第31頁(yè)/共42頁(yè)第三十二頁(yè)，共43頁(yè)。第32頁(yè)/共42頁(yè)第三十三頁(yè)，共43頁(yè)。第33頁(yè)/共42頁(yè)第三十四頁(yè)，共43頁(yè)。第34頁(yè)/共42頁(yè)第三十五頁(yè)，共43頁(yè)。第35頁(yè)/共42頁(yè)第三十六頁(yè)，共43頁(yè)。轉(zhuǎn)移(zhuny)到膜上的蛋白很少蛋白分子量 10KD蛋白的

7、等電點(diǎn) 9SDS濃度不合適凝膠太厚 原因?qū)Σ叩鞍追肿恿?0KD時(shí)，減少轉(zhuǎn)膜時(shí)間；使用小孔徑的膜更換高pH值Buffer在陰極buffer中加入0.005 - 0.01% SDS 可提高轉(zhuǎn)膜效率延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間第36頁(yè)/共42頁(yè)第三十七頁(yè)，共43頁(yè)。膜沒(méi)有均勻浸濕膜或者緩沖液污染封閉不充分抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)抗體濃度過(guò)高 原因?qū)Σ咿D(zhuǎn)膜前用100%甲醇將膜完全浸濕拿取膜與吸水紙時(shí)要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液檢測(cè)一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)雜交前檢測(cè)一抗、二抗的工作濃度背景(bijng)太高第37頁(yè)/共42頁(yè)第三十八頁(yè)，共43頁(yè)。雜交(zjio)信號(hào)很弱抗體保存不當(dāng)抗原不充足膜的漂洗過(guò)度 原因?qū)?/p>

8、策抗體長(zhǎng)期保存應(yīng)在70，使用前做效價(jià)檢測(cè)增加蛋白上樣量，做已知標(biāo)準(zhǔn)量蛋白的對(duì)照減少漂洗的時(shí)間和次數(shù)第38頁(yè)/共42頁(yè)第三十九頁(yè)，共43頁(yè)。一抗不是唯一特異的二抗出現(xiàn)非特異結(jié)合 原因?qū)Σ咧苽鋯慰寺】贵w或者重新選取合成抗原多肽的位點(diǎn)設(shè)立不加一抗，只加二抗的平行對(duì)照來(lái)檢測(cè)二抗是否有非特異結(jié)合出現(xiàn)(chxin)非特異帶第39頁(yè)/共42頁(yè)第四十頁(yè)，共43頁(yè)。第40頁(yè)/共42頁(yè)第四十一頁(yè)，共43頁(yè)。第41頁(yè)/共42頁(yè)第四十二頁(yè)，共43頁(yè)。NoImage內(nèi)容(nirng)總結(jié)會(huì)計(jì)學(xué)。第1頁(yè)/共42頁(yè)。針對(duì)(zhndu)水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。胺(acrylamide，簡(jiǎn)稱Acr)和交聯(lián)劑(crosslinker)。SDS-PAGE濃縮膠(5% Acrylami