組織DNA的提取與純化

1、組織組織DNADNA的提取與純化的提取與純化檢驗系生化教研室 陳寧 講課內容概述概述1 試驗原則試驗原則2 實驗操作及相關試劑介紹實驗操作及相關試劑介紹3注意事項注意事項4一、概述 DNA在生物組織中以核蛋白的形式存在于細胞核中。 單倍體人類DNA平均相對分子量為61010 道爾頓，相當于1.3105kb。DNA的分類有：的分類有：真核真核DNA細菌細菌DNA病毒病毒DNA質粒質粒DNADNA樣品的來源：樣品的來源： 組織組織 肝臟、贅生物、肌肉、培養(yǎng)細胞肝臟、贅生物、肌肉、培養(yǎng)細胞 血液血液 細菌細菌 培養(yǎng)細菌、質粒培養(yǎng)細菌、質粒二、實驗原則 保證保證DNA一級結構的完整性一級結構的完整性

2、排出其他干擾性分子的污染排出其他干擾性分子的污染干擾分子干擾分子l 對酶有抑制作用的物質對酶有抑制作用的物質l 樣品中存在的其他生物大分子樣品中存在的其他生物大分子有機溶劑、高濃度的金屬離子等有機溶劑、高濃度的金屬離子等蛋白質、多糖和脂類蛋白質、多糖和脂類應盡量將此類物質的濃度降低到最小程度應盡量將此類物質的濃度降低到最小程度l 相應抽提對象之外的核酸污染相應抽提對象之外的核酸污染DNA抽提時，應避免抽提時，應避免RNA干擾干擾相關因素對于核酸的影響：相關因素對于核酸的影響：機械剪切力、高溫劇熱環(huán)境機械剪切力、高溫劇熱環(huán)境過酸、過堿的反應體系過酸、過堿的反應體系各種核酸酶降解效應各種核酸酶降解

3、效應物理因素物理因素化學因素化學因素生物因素生物因素操作輕柔，切忌劇操作輕柔，切忌劇烈混勻、震蕩；控烈混勻、震蕩；控制實驗溫度制實驗溫度pH 410EDTA緩沖液緩沖液避免干擾因素的解決方法避免干擾因素的解決方法 簡化操作步驟，縮短提取過程，減少各類因素對核酸的降解。三、實驗操作及相關試劑介紹【實驗方法】 物理方式：玻璃珠法 超聲波法 研磨法 凍融法 化學方式：異硫氰酸胍法 酚-氯仿抽提法 堿裂解法 生物方式：酶法酚酚-氯仿抽提法氯仿抽提法提取組織提取組織組織勻漿組織勻漿水相水相(DNA,RNA)絮狀沉淀絮狀沉淀(DNA,少量蛋白質少量蛋白質,RNA)DNA裂解液裂解液苯酚苯酚-氯仿氯仿離心離

4、心離心離心離心離心氯仿氯仿-異戊醇異戊醇5mol/L NaCl冰無水乙醇冰無水乙醇75%乙醇乙醇TE1. 裂解液裂解液0.1mol/L NaCl1% SDS （十二烷基磺酸鈉）（十二烷基磺酸鈉）10mmol/L Tris-HCl pH8.01mmol/L EDTA pH8.0陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子它能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結構。去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結構。 抑制抑制DNA酶活性酶活性pH值適宜值適宜DNA游離游離至水相，避免降解。至水相，避免降解。2. 苯酚苯酚

5、-氯仿氯仿（3:1，V:V） Tris-HCl 飽和飽和 操作時，應將移液管伸至試劑瓶底部，吸取下操作時，應將移液管伸至試劑瓶底部，吸取下層試劑。層試劑。 苯酚與氯仿均為表面變性劑，能夠有效地去除苯酚與氯仿均為表面變性劑，能夠有效地去除水溶液中的蛋白質，使其變性后沉淀。水溶液中的蛋白質，使其變性后沉淀。3. 氯仿氯仿-異戊醇異戊醇（24:1，V:V） 經(jīng)酚氯仿試劑第一次抽提后的水相中有殘留經(jīng)酚氯仿試劑第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性殘余的蛋白質，同時一起將酚帶走。變性殘余的蛋白質，同時一起將酚帶走。 加入異戊醇能

6、降低分子表面張力，所以能減加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產生。同時異戊醇有助于分少抽提過程中的泡沫產生。同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。 4. 5mol/L NaCl 使水溶液中的使水溶液中的DNA易于聚合，從而形成鈉鹽易于聚合，從而形成鈉鹽沉淀。沉淀。 反應體系為反應體系為pH 8.0時，時，DNA分子所帶的電荷分子所帶的電荷為負電荷。加入為負電荷。加入NaCl溶液后，溶液后，Na+能夠中和能夠中和DNA外周的負電荷，減少外周的負電荷，減少DNA分子

7、之間因同種電荷產分子之間因同種電荷產生的排斥力，使得生的排斥力，使得DNA分子相互靠攏。分子相互靠攏。5. 冰無水乙醇冰無水乙醇冰：冰：低溫條件能降低分子運動，避免低溫條件能降低分子運動，避免DNA破壞，破壞，而易于沉淀出而易于沉淀出DNA。 DNA不溶于乙醇不溶于乙醇 。 乙醇可以吸附水分子（極性相同），使得溶液中乙醇可以吸附水分子（極性相同），使得溶液中相對的水分子減少，增大了相對的水分子減少，增大了DNA在水中的相對濃度。在水中的相對濃度。 乙醇沉淀乙醇沉淀DNA需要鹽離子，用金屬離子屏蔽需要鹽離子，用金屬離子屏蔽DNA上磷酸的負電荷，降低上磷酸的負電荷，降低DNA分子間的斥力，才能沉淀

8、分子間的斥力，才能沉淀完全。完全。 所以，之前須加入所以，之前須加入5M NaCl。6. 75%乙醇乙醇 洗滌作用，去除殘余的金屬離子。同時，洗滌作用，去除殘余的金屬離子。同時，保護保護DNA完整性，避免降解；抑制核酸酶活完整性，避免降解；抑制核酸酶活性。性。7. TE緩沖液緩沖液 TE緩沖液是緩沖液是Tris + EDTA緩沖液，一般用作緩沖液，一般用作溶解劑或保持劑，主要是調控溶解劑或保持劑，主要是調控pH。 TE緩沖液是弱堿性緩沖液是弱堿性,對對DNA的堿基有保護性。的堿基有保護性。 DNA在在TE提供的環(huán)境中穩(wěn)定性較好提供的環(huán)境中穩(wěn)定性較好,不易破壞其不易破壞其完整性或產生開環(huán)及斷裂。

9、包括提取好的完整性或產生開環(huán)及斷裂。包括提取好的DNA也也要放在要放在TE緩沖液中保存。緩沖液中保存。【操作】抽提組織加入裂解緩沖液制成勻漿抽提組織加入裂解緩沖液制成勻漿加入等體積的苯酚加入等體積的苯酚-氯仿試劑，緩慢顛倒氯仿試劑，緩慢顛倒5min后，后，2500rpm離心離心10min吸取上清液至干凈離心管吸取上清液至干凈離心管加入等體積氯仿加入等體積氯仿-異戊醇，搖勻異戊醇，搖勻5min，2500rpm離心離心10min記錄上清液體積，記錄上清液體積，吸取上清液至玻璃管吸取上清液至玻璃管，加入，加入5mol/LNaCl,并稀釋至并稀釋至0.3mol/L,再加入再加入2.5倍體積冰無水乙醇，

10、緩慢搖勻，出現(xiàn)絮狀沉淀倍體積冰無水乙醇，緩慢搖勻，出現(xiàn)絮狀沉淀2500rpm離心離心10min，棄去上清液，棄去上清液加入加入1ml 75%乙醇混勻，乙醇混勻，2500rpm離心離心5min。棄去上清液后再重復一次。棄去上清液后再重復一次沉淀沉淀DNA去除多余乙醇后，在快干時（半透明狀）加入去除多余乙醇后，在快干時（半透明狀）加入2ml TE緩沖液緩沖液檢測檢測DNA濃度、純度濃度、純度START加入等體積的苯酚加入等體積的苯酚-氯仿試劑，緩慢顛倒氯仿試劑，緩慢顛倒5min后，后，2500rpm離心離心10min 苯酚苯酚-氯仿試劑具有揮發(fā)性，對人體有毒。氯仿試劑具有揮發(fā)性，對人體有毒。故，使

11、用完畢后及時蓋上試劑瓶蓋，保持實驗室故，使用完畢后及時蓋上試劑瓶蓋，保持實驗室良好的通風。良好的通風。 如果發(fā)生試劑濺滴至皮膚、粘膜，務必及時如果發(fā)生試劑濺滴至皮膚、粘膜，務必及時用流動水沖洗。用流動水沖洗。記錄上清液體積，吸取上清液至玻璃管，加入記錄上清液體積，吸取上清液至玻璃管，加入5mol/LNaCl,并稀釋至并稀釋至0.3mol/L,再加入再加入2.5倍體積冰無水乙醇，緩慢搖勻，出現(xiàn)絮狀沉淀倍體積冰無水乙醇，緩慢搖勻，出現(xiàn)絮狀沉淀5mol/LVNaCl=0.3mol/L(V上清液上清液+VNaCl)VNaCl= （3V上清液上清液 ） / 47檢測檢測DNA濃度、純度濃度、純度 取完全

12、溶解后的取完全溶解后的DNA原液進行原液進行1:100稀釋，稀釋，即即1l原液原液 + 99l水，混勻。水，混勻。紫外分光光度計檢測：紫外分光光度計檢測： A260 = ? A280 = ? DNA純度鑒定純度鑒定A260 / A280 1.6 1.8 2.0酚、蛋白質污染酚、蛋白質污染視為純度較視為純度較高的高的DNARNA污染污染DNA濃度鑒定濃度鑒定DNA (g/ml) = A260 稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù) 50 1/光徑光徑DNA在在260nm處存在吸收峰處存在吸收峰檢測時對于原檢測時對于原液的稀釋程度液的稀釋程度1OD相當于：相當于：50 g/ml DNA40 g/ml RNA20 g/ml 寡核苷酸寡核苷酸四、注意事項l 組織抽提前應保存于液氮中，以免組織抽提前應保存于液氮中，以免DNA受到破壞；純受到破壞；純化時應時刻注意抑制核酸酶的污染，使用化時應時刻注意抑制核酸酶的污染，使用EDTA等防止等防止DNA降解。降解。l 劇烈振蕩可使劇烈振蕩可使DNA斷裂，故操作時應盡量輕柔、緩慢斷裂，故操作時應盡量輕柔、緩慢地顛倒混勻。地顛倒混勻。l 要獲得高純度要獲得高純度DNA，可加入蛋白酶，可加入蛋白酶K降解蛋白質。降解蛋白質。l DNA在在260nm處有一吸收峰，而蛋白質在處有一吸收峰，而蛋白質在280nm