環(huán)境化學(xué)物的一般毒性及其評價實用教案

1、一、實驗動物(dngw)的選擇 實驗動物(dngw)是指經(jīng)人工培育，對其攜帶微生物實行控制，遺傳背景明確，來源清楚，可用于科學(xué)研究的動物(dngw)。第一節(jié) 化學(xué)物毒性評價(pngji)的實驗基礎(chǔ)第1頁/共56頁第一頁，共57頁。 以選擇哺乳動物為主。可采用23種，嚙齒類和非嚙齒類。常用大鼠(rat）、小鼠（mouse）、豚鼠(tn sh)、家兔和狗，尤以大鼠使用很多。 Wistar 大鼠豚鼠(tn sh)第2頁/共56頁第二頁，共57頁。對化合物的毒性反應(yīng)及代謝(dixi)過程與人相似自然壽命不太長易于飼養(yǎng)和實驗操作經(jīng)濟并易于獲得（一）物種選擇(xunz) 種類選擇(xunz)的依據(jù)： 第3

2、頁/共56頁第三頁，共57頁。（二）品系選擇 品系指計劃交配的辦法獲得的起源于共同祖先(zxin)的一群動物。同一品系的動物具有共同的遺傳來源、相似的外貌特征、獨特的生物學(xué)特性及穩(wěn)定的遺傳性能。1、近交系動物(dngw) 指采用連續(xù)20代以上兄妹交配或親子交配而培育的純品系動物(dngw)。遺傳上高度一致，基因純合度可達98.6-99.8%。 第4頁/共56頁第四頁，共57頁。 對放射線耐受性強，淋巴細胞白血病發(fā)病率6，化學(xué)致癌物質(zhì)不能誘發(fā)(yuf)乳腺癌和卵巢囊腫，對結(jié)核桿菌有感受性。 可用于營養(yǎng)與肝癌發(fā)生率關(guān)系(gun x)的研究，對鼠傷寒沙門氏菌C5有抵抗力，對酒精過敏。也可作為許多瘤株

3、的宿主。 乳腺癌自發(fā)率低，肺癌發(fā)病率為26，網(wǎng)狀細胞(xbo)瘤8，血管瘤6，淋巴肉瘤45，乳腺癌3，對放射線極為敏感。 第5頁/共56頁第五頁，共57頁。特點：a.實驗結(jié)果比較準確，可以避免遺傳組成不同或個體差異太大等所引起的誤差。b.實驗結(jié)果的平均性較一致。每組僅用較少數(shù)的動物(dngw)，即能看出顯著性來。c.實驗結(jié)果的重復(fù)性較大。e.易于獲得預(yù)期結(jié)果。f.近交衰退。 第6頁/共56頁第六頁，共57頁。2、突變系動物 在生長繁殖過程中，通過自然突變或人工定向突變的方法，使其某基因發(fā)生突變并喪失(sngsh)原有的正常功能。這種突變的基因可以世代相傳并保持遺傳基因特性的品系動物，稱為突變系

4、動物。無胸腺裸鼠第7頁/共56頁第七頁，共57頁。3、雜交群動物(dngw) 指兩個不同近交系之間有目的地進行交配所產(chǎn)生的第一代動物(dngw)。 特點：a.具有純系動物基本相似的遺傳(ychun)均質(zhì)性。個體間遺傳(ychun)變異很小。b.表現(xiàn)雙親的顯性性狀 c.對各種實驗結(jié)果重復(fù)性好d.具有雜種優(yōu)勢 e.國際上分布廣第8頁/共56頁第八頁，共57頁。4、封閉群動物 指在5年以上不從外部引進新血緣(xuyun)，僅由同一品系的動物在固定場所保存繁殖的動物群。個體間具有一定程度的遺傳學(xué)差異。封閉群動物個體間差異的大小，取決于祖代的來源 。第9頁/共56頁第九頁，共57頁。（三）微生物控制的選

5、擇1、無菌動物 germ free animal, GF 指體內(nèi)(t ni)外均無任何微生物和寄生蟲的動物。經(jīng)人工剖腹產(chǎn)凈化培育而來。2、悉生動物 gnotobiotic animal, GN 指體內(nèi)帶有已知微生物的動物。是經(jīng)人工有計劃(jhu)地將已知菌投入動物體內(nèi)。第10頁/共56頁第十頁，共57頁。第11頁/共56頁第十一頁，共57頁。3、無特定(tdng)病原體動物 specific pathogen animal, SPF 指體內(nèi)無特定(tdng)的微生物和寄生蟲的動物。即無傳染病的動物，容許攜帶非特定(tdng)微生物。 SPF動物群的建立，其原種必須來源于無菌動物或悉生動物才能保

6、證。4、清潔動物 Clean animal,CL 也稱最低限度疾病(jbng)動物，動物體內(nèi)外不攜帶人畜共患疾病(jbng)的病原體或動物傳染病病原體。第12頁/共56頁第十二頁，共57頁。（四）個體選擇1、年齡 取決于實驗類型。急性實驗成年動物亞慢性、慢性實驗較年幼或初斷乳動物。 在實際工作中常以動物體重粗略(cl)判斷動物的年齡。各組動物的年齡應(yīng)盡可能保持一致。第13頁/共56頁第十三頁，共57頁。2、性別 不同性別的實驗動物對化學(xué)物毒性的敏感程度有時會不同。一般選用雌雄兩性。3、生理狀態(tài) 一般選用未產(chǎn)未孕的雌性動物。雌雄分養(yǎng)。4、健康狀況 應(yīng)選用健康動物。一般試驗(shyn)前檢疫觀察5

7、7天第14頁/共56頁第十四頁，共57頁。二、常用染毒方法（一）經(jīng)口染毒1、灌胃 是將液態(tài)受試化合物或固態(tài)、氣態(tài)化合物溶于某種溶劑中，配制(pizh)成一定濃度，裝入注射器等定量容器，經(jīng)過導(dǎo)管注入胃內(nèi)。優(yōu)點：劑量準確缺點：工作量大；可能損傷食道(shdo)或誤入氣管；與人的接觸方式差異很大。 第15頁/共56頁第十五頁，共57頁。2、吞咽(tn yn)膠囊 將一定劑量受試化合物裝入藥用膠囊內(nèi)，強制放到動物的后咽部迫使動物咽下。家兔及貓、狗等大動物可用此法。 優(yōu)點：劑量準確，尤其適用于易揮發(fā)、易水解和有異味的化合物。第16頁/共56頁第十六頁，共57頁。3、喂飼 將化合物拌入飼料和水中，需計算每

8、日進食量和飲水量，折算攝入劑量。 優(yōu)點：符合人接觸化合物的方式 缺點：可能(knng)拒食；揮發(fā)性化合物可使攝入量下降，且有經(jīng)過呼吸道吸入的可能(knng)；化合物易水解或與食物中的化學(xué)成分起反應(yīng)。第17頁/共56頁第十七頁，共57頁。（二）經(jīng)呼吸道染毒1、靜式吸入 在固定體積的密閉容器中，加入定量的易揮發(fā)液態(tài)化合物或氣態(tài)(qti)化合物。將動物置于其中，一般2h。尤其是適用于小動物接觸易揮發(fā)液態(tài)化合物的急性毒性研究。優(yōu)點：設(shè)備簡單；操作方便；消耗化合物少缺點：柜內(nèi)空氣組成、環(huán)境條件不穩(wěn)定；化合物濃度(nngd)難以恒定。第18頁/共56頁第十八頁，共57頁。表5-1 實驗動物最低需氣量(ql

9、ing)及不同體積染毒柜應(yīng)放置動物數(shù)關(guān)系 動物種屬呼吸通氣量(L/小時)最低需氣量(L/小時)不同容積染毒柜放置動物數(shù)(只)25L50L100L300L小 鼠大 鼠1.4510.182.4530.535610121512364056濃度(nngd)計算：C=a.d/L10001000（mg/m3） a加入化合物量（ml），d比重，L容積（L）第19頁/共56頁第十九頁，共57頁。2、動式吸入 染 毒 柜 空 氣 流 動(lidng) 面罩吸入避免化合物經(jīng)皮吸入 優(yōu)點：劑量準確 缺點：裝置復(fù)雜；消耗大；可能造成污染（三）經(jīng)皮膚染毒 用于研究化合物經(jīng)皮膚吸收的毒性作用及化合物對接觸皮膚的局部(jb

10、)作用（皮膚刺激和致敏）第20頁/共56頁第二十頁，共57頁。第二節(jié) 急性毒性及其評價(pngji)方法 第21頁/共56頁第二十一頁，共57頁。一、急性毒性的概念 急性毒性（acute toxicity）是指機體(人或?qū)嶒瀯游?一次(或24小時內(nèi)多次)接觸外來化合物之后所引起的中毒效應(yīng)。觀察期可在17天。 實驗動物接觸化合物的方式或途徑不同，“一次”的含義也有所不同。凡經(jīng)口接觸和各種方式的注射接觸，“一次”是指在瞬間將受試化合物輸入(shr)實驗動物的體內(nèi)。而經(jīng)呼吸道吸入與經(jīng)皮膚接觸，“一次”是指在一個特定的期間內(nèi)實驗動物持續(xù)地接觸受試化合物的過程 第22頁/共56頁第二十二頁，共57頁。實

11、驗?zāi)康?.求出受試化合物對一種或幾種實驗動物的致死劑量(通常以LD50為主要參數(shù))，以初步估計該化合物對人類毒害的危險性。2.闡明受試化合物急性毒性的劑量反應(yīng)關(guān)系與中毒特征。3.研究化合物在機體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)運和生物轉(zhuǎn)化過程及其動力學(xué)變化。也可用于研究急救治療措施4.為亞急性、慢性實驗設(shè)計提供(tgng)依據(jù)第23頁/共56頁第二十三頁，共57頁。二、急性(jxng)毒性評價方法（一）經(jīng)典的急性(jxng)致死性毒性試驗1、實驗動物 選用成年健康動物，常用大鼠和小鼠。各劑量組雌：雄1：1，出生23個月。數(shù)量1020只最佳。大動物每組6只。實驗前至少觀察一周，選取其中健康動物，隨機分組。第24頁/共

12、56頁第二十四頁，共57頁。2、染毒劑量設(shè)計（1）查閱文獻：分析受試化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和其理化性質(zhì)(xngzh)，依此查閱文獻，找出與受試化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)(xngzh)近似化合物的毒性資料，并以其LD50(LC50)值作為受試化合物的預(yù)期毒性中值。（2）試驗：以文獻LD50為中值，取倍差，設(shè)34個梯度，找出大致的LD10-90的范圍。第25頁/共56頁第二十五頁，共57頁。（3）正式試驗(shyn)： I（logLD90logLD10）/（n-1）組距，即相鄰兩個劑量組對數(shù)差或相鄰組比值的對數(shù)值。一般設(shè)57個劑量組。 限量實驗(shyn)：毒性較小的化學(xué)物若無法求得LD50，則進行限量實

13、驗(shyn)，單次染毒劑量5g/kg（體重），食品毒理學(xué)實驗(shyn)15g/kg（體重）。 第26頁/共56頁第二十六頁，共57頁。3、觀察 一般要求計算兩周內(nèi)的總死亡數(shù)。對于一些速死性化合物求其LD50(LC50)也可僅計算24小時的死亡率。應(yīng)注明是多少時間的LD50值，以便于在進行毒性比較時有共同的基礎(chǔ)(jch)。 觀察內(nèi)容：（1）死亡情況（2）動物體重（3）中毒反應(yīng)癥狀（4）病理學(xué)檢查第27頁/共56頁第二十七頁，共57頁。4、LD50 計算(j sun) LD50是經(jīng)統(tǒng)計學(xué)計算得到的毒性參數(shù)，并可報告其95可信限。LD50(LC50)值是一個(y )統(tǒng)計量，較少受實驗動物個體易感

14、性差異的影響，較為準確，因此是最重要的急性毒性參數(shù)，也用來進行急性毒性分級。 第28頁/共56頁第二十八頁，共57頁。 直接(zhji)回歸法 將劑量對數(shù)值與死亡率(概率單位)的關(guān)系，進行直線回歸，用最小二乘法(chngf)求出a、b值。代入直線方程：ya十bX。式中，X為劑量對數(shù)值，y為死亡率的概率單位。利用此式即可求得受試化學(xué)物的LD50及其95可信區(qū)間。 第29頁/共56頁第二十九頁，共57頁。 % 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 . 2.67 2.95 3.12 3.25 3.36 3.45 3.52 3.59 3.66 10 3.72 3.77 3.82 3.87 3.9

15、2 3.96 4.01 4.05 4.08 4.12 20 4.16 4.19 4.23 4.26 4.29 4.33 4.36 4.39 4.42 4.45 30 4.48 4.50 4.53 4.56 4.59 4.61 4.64 4.67 4.69 4.72 40 4.75 4.77 4.80 4.82 4.85 4.87 4.90 4.92 4.95 4.97 50 5.00 5.03 5.05 5.08 5.10 5.13 5.15 5.18 5.20 5.23 60 5.25 2.28 5.31 5.33 5.36 5.39 5.41 5.44 5.47 5.50 70 5.52

16、5.55 5.58 5.61 5.64 5.67 5.71 5.74 5.77 5.81 80 5.84 5.88 5.92 5.95 5.99 6.04 6.08 6.13 6.18 6.23 90 6.28 6.34 6.41 6.48 6.55 6.64 6.75 6.88 7.05 7.33 百分率-概率(gil)單位換算表第30頁/共56頁第三十頁，共57頁。（二）急性毒性實驗的其他(qt)方法 經(jīng)典的急性毒性試驗(shyn)和LD50的缺點：消耗的動物量大獲得的信息有限測得的LD50值實際上僅是近似值 五種(w zhn)化合物的LD50值的實驗室間變異化合物 范圍(mg/kg) 比

17、值(最大值最小值)五氯酚 74620 8.38 水楊酸鈉 9302328 2.50苯胺 4791169 2.44乙酰苯胺 7233060 4.23氯化鎘 105482 4.59第31頁/共56頁第三十一頁，共57頁。單次口服固定劑量試驗法結(jié)果的評價劑量(mg/kg) 試 驗 結(jié) 果 存活數(shù)2000mg/kg 用2000mg/kg試驗 2000.0 用500mg/kg試驗 該化合物無嚴重急性中毒的危險性 1、固定(gdng)劑量法 第32頁/共56頁第三十二頁，共57頁。2、急性毒性分級(fn j)法第33頁/共56頁第三十三頁，共57頁。 3. 上、下移動(ydng)法(updown meth

18、od)或階梯法 第二個動物接受化學(xué)物的劑量由第一只動物染毒后的反應(yīng)決定，如果動物死亡，則下一個劑量降低；如果動物存活則下一個劑量增高，但是實驗需要選擇一個比較(bjio)合適的劑量范圍，使得大部分的動物所接受的化學(xué)物劑量都會在真正的平均致死劑量左右。 第34頁/共56頁第三十四頁，共57頁。三、急性毒性分級 目前國際上對外源化學(xué)物急性毒性分級的標準(biozhn)不統(tǒng)一。 外源化學(xué)(huxu)物急性毒性分級(WHO)毒性分級大鼠一次經(jīng)口LD50(mg/kg)6只大鼠吸入4小時死亡24只的濃度(ppm)兔經(jīng)皮LD50(mg/kg)對人可能致死劑量單位體重（g/kg ）總重(g/60kg)劇毒高毒

19、中等毒低毒微毒1150500500001010100100010000554435021800.050.050.55150.1330251000第35頁/共56頁第三十五頁，共57頁。我國食品(shpn)毒理急性毒性分級法1994急性毒性分級 大鼠經(jīng)口LD50(mg/kg) 大致相當于體重為 70kg人的致死劑量6級(極毒) 1 稍嘗，7滴5級(劇毒) 150 7滴1茶匙4級(中等毒) 51500 1茶匙35克3級(低毒) 5015000 35350克2級(實際無毒) 500115000 3501050克1級(無毒) 15000 1050克第36頁/共56頁第三十六頁，共57頁。 課后作業(yè)(z

20、uy) 為什么用為什么用LD50LD50作為作為(zuwi)(zuwi)比較化合物急性毒性的指標？有何優(yōu)缺點？比較化合物急性毒性的指標？有何優(yōu)缺點？如何克服？如何克服？第37頁/共56頁第三十七頁，共57頁。第三節(jié) 亞慢性(mn xng)、慢性(mn xng)毒性及其評價方法第38頁/共56頁第三十八頁，共57頁。一、亞慢性和慢性毒性試驗的概念 亞慢性毒性(subchronic toxicity)是指實驗動物連續(xù)(通常13個月)重復(fù)染毒外源化學(xué)物所引起(ynq)的毒性效應(yīng)； 慢性毒性(chronic toxiciy)是指實驗動物長期染毒外源化學(xué)物所引起(ynq)的毒性效應(yīng)。一般是連續(xù)染毒6個月

21、至兩年，甚至終生染毒。第39頁/共56頁第三十九頁，共57頁。二、亞慢性和慢性毒性試驗的目的 1. 確定受試物亞慢性和慢性毒性的效應(yīng)譜,并發(fā)現(xiàn)在急性及亞急性毒性試驗中未發(fā)現(xiàn)的毒作用； 2. 研究受試物亞慢性和慢性毒作用的靶器官； 3. 研究受試物亞慢性和慢性毒性劑量-反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系(gun x)，確定其觀察到有害作用的最低劑量(LOAEL)和未觀察到有害作用的劑量(NOAEL)，提出此受試物的安全限量參考值； 4. 研究受試物亞慢性和慢性毒性損害的可逆性； 5. 亞慢性毒性試驗為慢性毒性試驗的劑量設(shè)計及觀察指標選擇提供依據(jù)； 6. 確定不同動物物種對受試物亞慢性和慢性毒效應(yīng)的差異，為將毒性研

22、究結(jié)果外推到人提供依據(jù)。第40頁/共56頁第四十頁，共57頁。三、亞慢性毒性和慢性毒性的評價方法（一）實驗動物 一般要求兩種實驗動物，一種為嚙齒類，另一種為非嚙齒類。實驗動物最好為純系甚至同窩動物均勻分布于各劑量組。雌雄各半。亞慢性實驗每組20只以上大鼠，慢性實驗每組40100只。亞慢性毒性試驗動物的體重(年齡(ninlng)應(yīng)較小，如小鼠應(yīng)為15g左右，大鼠100g左右。慢性毒性實驗動物年齡(ninlng)應(yīng)更小，大鼠和小鼠應(yīng)為初斷奶者。第41頁/共56頁第四十一頁，共57頁。（二）染毒途徑 盡量模擬人類的接觸方式；應(yīng)與預(yù)期進行慢性(mn xng)毒理試驗的接觸途徑相一致。 染毒時間每日應(yīng)定

23、時，以維持動物血液中濃度穩(wěn)定。 常用的染毒途徑是經(jīng)胃腸道、經(jīng)呼吸道和皮膚染毒。第42頁/共56頁第四十二頁，共57頁。（三）染毒期限 工業(yè)接觸毒物：亞慢性毒性13個月，慢性毒性6個月 環(huán)境毒物：亞慢性毒性36個月，慢性毒性12個月以上 如果慢性毒性實驗與致癌實驗結(jié)合(jih)，染毒期限最好是接近或等于終生染毒。第43頁/共56頁第四十三頁，共57頁。動物研究期限(qxin)相當于壽命期()和人染毒的時間物種研究期限(月)相當于壽命期() 研究期限(月)相當于人(月)13612241361224大鼠4.112.025.04999 34 101202 404 808兔1.44.59.018.36

24、12 36 72 145 289狗0 . 822.54.99.8206.5 20 40 81162豬0 . 822.54.99.8206.5 20 40 81162猴0 . 551.6 3.36.6134.5 13 27 61107第44頁/共56頁第四十四頁，共57頁。（四）劑量分組 至少(zhsho)3個劑量組和1個對照組。 高劑量組：出現(xiàn)較明顯的毒性效應(yīng)，死亡率小于10或無死亡 中劑量組：輕微毒性，即觀察到最低有害作用劑量（LOAEL） 低劑量組：不出現(xiàn)中毒反應(yīng)，即未觀察到有害作用劑量（NOAEL）第45頁/共56頁第四十五頁，共57頁。 亞慢性毒性實驗：可參考兩個(lin )數(shù)值，一是

25、以急性毒性的閾劑量為亞慢性試驗的最高劑量；一是以此化合物LD50的1/201/5為最高劑量。 慢性毒性實驗：劑量的選擇可參考(cnko)三組數(shù)據(jù)。1、亞慢性NOAEL或其1/5 1/2劑量為慢性毒性試驗的最高劑量，以這一閾劑量的1/501/10為慢性毒性試驗的預(yù)計閾劑量組，并以其1/100為預(yù)計的慢性無作用劑量組2、亞慢性試驗的LOAEL的1/2、1/4、1/8分三組3、急性毒性的LD50劑量為出發(fā)點，即以LD50 的1/10劑量為慢性試驗的最高劑量。以LD50的1/100為預(yù)計慢性閾劑量，以LD50 的1/1000為預(yù)計的無作用劑量組。第46頁/共56頁第四十六頁，共57頁。（五）觀察指標1

26、、中毒癥狀：每日觀察動物有無中毒癥狀和程度，外觀和行為有無異常2、體重：每周稱重一次3、食物利用率：記錄每日飼料消耗量，計算食物利用率（每攝入100g飼料所增長(zngzhng)的體重克數(shù)）。4、實驗室檢查（1）血液學(xué)檢查（2）尿液檢查（3）血液生化檢查第47頁/共56頁第四十七頁，共57頁。5、病理及病理組織學(xué)檢查 凡是在實驗過程(guchng)中死亡的動物均應(yīng)及時解剖檢查，實驗結(jié)束后所有動物都要殺死檢查。慢性毒性實驗在實驗中期進行一次檢查。（1）系統(tǒng)解剖：包括肉眼觀察 動物固定在解剖板上，解剖頸部(頜下腺、腮腺、局部(jb)淋巴結(jié)等) 取一側(cè)乳腺及腹部皮膚；開腹并擴展切口(胰、脾、生殖器官

27、、腎、腎上腺、直腸、胃、十二指腸、空腸、回腸、腸系膜淋巴結(jié)、肝臟等) 開胸(舌、喉、氣管、甲狀腺、甲狀旁腺、食管、心、肺、胸腺) 剝離左后肢(肌肉、坐骨神經(jīng)、股骨)；頭皮、耳； 開顱(顱神經(jīng)、腦組織、垂體)；暴露脊髓(取出脊髓)第48頁/共56頁第四十八頁，共57頁。（2）臟器系數(shù)：也稱臟體比值，是指某個臟器的濕重與單位體重的比值，通常以100g或1g體重計。此指標的意義是實驗動物在不同年齡期，其各臟器與體重之間重量比值有一定規(guī)律；若受試化合物使某個臟器受到損害，則此比值就會發(fā)生改變。臟體比值是一個靈敏、有效和經(jīng)濟的指標。（3）組織病理學(xué)檢查(jinch)：系統(tǒng)解剖時發(fā)現(xiàn)的異常組織要進行詳細的組織病理學(xué)檢查(jinch)，必要時還需進行組織化學(xué)或電鏡檢查(jinch)。第49頁/共56頁第四十九頁，共57頁。6、特異性指標(zhbio)（六）結(jié)果分析 對污染組和對照組數(shù)據(jù)根據(jù)統(tǒng)計學(xué)方法處理，看是否有顯著差異、劑量(jling)效應(yīng)關(guān)系和時間效應(yīng)關(guān)系。以及各項指標之間的相關(guān)性。第50頁/共56頁第五十頁，共57頁。第四節(jié) 皮膚局部(jb)毒作用及其評價方