流式細(xì)胞檢測(cè)課件

1、王麗2015-07-07流式細(xì)胞技術(shù)流式細(xì)胞技術(shù)FLOW CYTOMETRYWhat does it mean?CYTOCellMeasure(ment)METRY2FLOW CYTOMETRY ：在液流系統(tǒng)中，快速測(cè)定單個(gè)細(xì)胞或微粒的物理特性和生化特性的方法。Flow Cytometer (FCM) 流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀Flow Sorter 流式細(xì)胞分選儀流式細(xì)胞分選儀BD FACSVantageBD Calibur 流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀3BECKMAN CytoFLEXMiltenyi MACSQuantGuava 5HT 微毛細(xì)管細(xì)胞分析儀微毛細(xì)管細(xì)胞分析儀流式細(xì)胞儀的組成流式細(xì)胞儀的

2、組成OpticsElectronicsSoftwareFluidicsWaste4樣樣品品規(guī)規(guī)格格： ： 96孔板孔板 或或 1.5 mL 小管小管5進(jìn)進(jìn)樣準(zhǔn)備樣準(zhǔn)備工作工作流程流程v樣本制備樣本制備v熒光染色熒光染色v上樣檢測(cè)上樣檢測(cè)v數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析FluorescenceDetectorHistogramSingle Cell SuspensionCellSuspensionFluorescentlyLabelledAntibodyFluorescenceY+Blue Laser (488 nm)6 液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)功能：功能：傳送待測(cè)樣本中的細(xì)胞到激光照射區(qū)。傳送待測(cè)樣本中的細(xì)胞到激光

3、照射區(qū)。樣本：樣本：0.2-1500.2-150微米的粒子，最快可在微米的粒子，最快可在1 1秒種內(nèi)計(jì)測(cè)數(shù)萬個(gè)細(xì)胞。秒種內(nèi)計(jì)測(cè)數(shù)萬個(gè)細(xì)胞。Sheath Fluid: 10 mL/TestWaste： ：1L / hr run10萬萬100萬萬cells/TestNo Sheath FluidWaste： ： 500 nmSP 500 = PE APC PE PerCP FITCPerCP FITC PE較強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原較強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原 FITC最便宜，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原最便宜，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原21常見熒光物質(zhì)的應(yīng)用常見熒光物質(zhì)的應(yīng)用PM1 (Orange)Add nmPM2 (Red

4、)PM3 (Green)Fluorophores Conjugated to an AbPEPE-Cy5FITCDead Cell Dyes (DNA staining)PI7-AADLive Cell Dye(DNA Staining)LDS751Fluorescent ProteinsGFPCell Tracking DyesCFSE直方圖和點(diǎn)陣圖直方圖和點(diǎn)陣圖直方圖(Histogram Plot(Histogram Plot) )單參數(shù)分析.X-Axis:熒光信號(hào)強(qiáng)度.Y-Axis:細(xì)胞數(shù)目.點(diǎn)陣圖(Dot Plot(Dot Plot) )雙參數(shù)分析.XandYaxis：兩種熒光信號(hào)強(qiáng)度

5、.每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞.Log & Lin:熒光強(qiáng)度的坐標(biāo)熒光強(qiáng)度的坐標(biāo)可以是線性的，也可以是對(duì)數(shù)可以是線性的，也可以是對(duì)數(shù)的的. .直方圖：可直方圖：可根據(jù)單一因素區(qū)分細(xì)胞亞群根據(jù)單一因素區(qū)分細(xì)胞亞群10e010e110e210e310e4CD20-FITC (GRN-HLog) 70 53 35 18 0CountM2M110e010e110e210e310e4CD20-FITC (GRN-HLog) 70 53 35 18 0Count70 cells each have a green fluorescence intensity of about 400Notice the s

6、ubpopulation?25血細(xì)胞分群血細(xì)胞分群（紅細(xì)胞溶解后）紅細(xì)胞溶解后）點(diǎn)陣圖：根據(jù)多因素區(qū)分細(xì)胞亞群點(diǎn)陣圖：根據(jù)多因素區(qū)分細(xì)胞亞群熒光補(bǔ)償熒光補(bǔ)償光譜重疊的校正光譜重疊的校正：目前使用的熒光染料都是寬波譜，兩兩之間的發(fā)射譜范圍有一定的重疊。為了克服這種誤差，可使用熒光補(bǔ)償電路，設(shè)置合理的熒光信號(hào)補(bǔ)償。我需要準(zhǔn)備什么？我需要準(zhǔn)備什么？1.Why：為什么進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)？流式細(xì)胞技術(shù)是否是最佳的檢測(cè)方法？檢測(cè)的原理是什么？要檢測(cè)的物質(zhì)是什么？2.Where：熒光標(biāo)記的物質(zhì)在哪里？是否需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定？打孔？3.Which：選擇什么熒光標(biāo)記物？4.How:樣品制備流程，多少個(gè)標(biāo)本？（空白

7、對(duì)照、陰性對(duì)照）5.When:預(yù)約（175874947群共享下載申請(qǐng)表）Doit?。ê线m的細(xì)胞密度并避免細(xì)胞結(jié)團(tuán)）2728應(yīng)用應(yīng)用范圍范圍實(shí)驗(yàn)對(duì)照的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)照的設(shè)計(jì) 空白空白對(duì)照對(duì)照 ALLALL ：采用不標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行平行測(cè)定，用于確定待測(cè)標(biāo)本的基礎(chǔ)熒光域值或檢測(cè)染色方法是否成功。 陰性對(duì)照：陰性對(duì)照：調(diào)節(jié)各熒光探測(cè)器合適的放大倍數(shù)，即確定待測(cè)標(biāo)本的基礎(chǔ)熒光域值。常用同型對(duì)照（與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同亞型的免疫球蛋白），用于消除抗體與細(xì)胞非特異性結(jié)合產(chǎn)生的背景。 陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照：用已知表達(dá)某種抗原的細(xì)胞（陽(yáng)性細(xì)胞）進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，通常用于檢測(cè)抗體是否正?；虼_定實(shí)驗(yàn)方法

8、的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。 補(bǔ)償補(bǔ)償對(duì)照：對(duì)照：多色分析時(shí)，將用于多色標(biāo)記的各種熒光抗體分別與樣本進(jìn)行單色標(biāo)記，以測(cè)定熒光信號(hào)的光譜重疊情況以進(jìn)行調(diào)節(jié)。 單色單色分析：分析：設(shè)同型抗體對(duì)照 多色分析：多色分析：同型對(duì)照，補(bǔ)償對(duì)照29細(xì)胞周期：細(xì)胞周期：從一次分裂完成時(shí)開始，到下一次分裂完成時(shí)為止，為一個(gè)細(xì)胞周期。（細(xì)胞內(nèi)的DNA含量隨細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生周期性變化。）DNA 含量：含量： G1（DNA合成前期，2C）、分裂間期S（DNA合成期，2C-4C）、G2（DNA合成后期，4C）分裂期M期（DNA為4C）。利用核酸標(biāo)記的方法，通過流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA的相對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定，可分析細(xì)胞周期各時(shí)相的百分

9、比。但是分裂期（M期）的前期、中期、后期、末期四個(gè)時(shí)期，普通流式無法進(jìn)行定量檢測(cè)。301. DNA細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期分析應(yīng)用實(shí)例應(yīng)用實(shí)例1. DNA細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期分析31實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)：實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)：1、細(xì)胞周期固定：加200ul細(xì)胞（貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞需要先用胰酶消化）到1.5ml離心管中300g轉(zhuǎn)速離心5min，并用1PBS清洗一次離心去上清添加300ulPBS溶解沉淀細(xì)胞緩慢加入緩慢加入20預(yù)冷的預(yù)冷的100%乙醇乙醇700ul固定細(xì)胞（固定過程中需要邊滴加乙醇，邊震蕩，不要產(chǎn)生細(xì)胞聚團(tuán)，否則會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果）最后乙醇終濃度為70%20孵育至少3小時(shí)（建議4孵育過夜，效果

10、會(huì)更好）。2、將固定好的細(xì)胞300g轉(zhuǎn)速離心5min，并用1PBS清洗一次。將細(xì)胞用200ul的Guava細(xì)胞周期試劑重新懸浮，室溫孵育30min，注意避光。3、用200目細(xì)胞篩過濾細(xì)胞（如果使用PI染色必須過濾），顯微鏡下細(xì)胞無結(jié)團(tuán)，Guava流式細(xì)胞儀檢測(cè)。321. DNA細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期分析2.2.早期早期細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡檢測(cè)檢測(cè)332.2.早期早期細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)結(jié)果34正常細(xì)胞： Annexin V(-) / 7-AAD (-) 早期凋亡細(xì)胞：Annexin V (+) / 7-AAD (-) 晚期凋亡細(xì)胞：Annexin V (+) / 7-AAD (+) CD95

11、/FASL CD95/FASL 刺激誘導(dǎo)凋亡刺激誘導(dǎo)凋亡實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 1. 樣本準(zhǔn)備(貼壁細(xì)胞)：棄去培養(yǎng)細(xì)胞(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期) 中的舊培養(yǎng)液，加入胰酶消化細(xì)胞，。收集舊培養(yǎng)基，通過離心獲得凋亡或死亡收集舊培養(yǎng)基，通過離心獲得凋亡或死亡細(xì)胞細(xì)胞，與之后消化后的細(xì)胞混合，再檢測(cè)，與之后消化后的細(xì)胞混合，再檢測(cè)。 2. 細(xì)胞染色：在 96-well 微孔板相應(yīng)的孔中加入 100ulGuava Nexin（貨號(hào)：4500-0450）和100ul 準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液，室溫避光孵育 20min；盡快用流式細(xì)胞儀獲取結(jié)果（1h 內(nèi)）。 3. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)獲取數(shù)據(jù)。注意：實(shí)驗(yàn)最好包括實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)

12、照（凋亡誘導(dǎo)組）。352.2.早期早期細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)結(jié)果細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡是動(dòng)態(tài)事件，在不同時(shí)期展現(xiàn)不同的凋亡信號(hào)。早期早期磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）暴露在細(xì)胞膜上，與PS結(jié)合的AnnexinV成為檢測(cè)凋亡早期的最常用指標(biāo)。除此之外，線粒體膜電位變化和細(xì)胞色素C的釋放，也被認(rèn)為是凋亡的早期信號(hào)。中期中期Caspase家族蛋白分布于各條凋亡通路上，是中期凋亡的指標(biāo)?；罨疌aspase蛋白檢測(cè)可以使用FLICA底物。晚期晚期DNA片段化是凋亡晚期的顯著特征。通過TUNEL法對(duì)斷裂的DNA片段進(jìn)行標(biāo)記。36凋亡的途徑凋亡的途徑Caspase-8 外源性外源性TNF-alpha/FAS 受體Response to environmental cuesCaspase-9 內(nèi)源性內(nèi)源性細(xì)胞色素C的釋放DNA損傷或細(xì)胞周期阻滯Caspase-3/7 關(guān)鍵的執(zhí)行蛋白MultiCaspasecaspases 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8 & 9 的檢測(cè)Caspase家族蛋白家族蛋白酶酶是是細(xì)細(xì)胞程序性死亡胞程序性死亡過過程中心點(diǎn)。程中心點(diǎn)。Guava