志賀氏菌檢測技術(shù)

1、志賀氏菌檢測技術(shù)志賀氏菌檢測技術(shù) 利川市疾病預(yù)防控制中心 王治元 志賀氏菌是引起人類細(xì)菌性痢疾的病原菌，僅引起人類的腸道內(nèi)感染，對其他動物均無致病力，可隨患者的糞便污染外環(huán)境。 細(xì)菌性痢疾至今仍然是我國城鄉(xiāng)最為常見的腸道傳染病,病人和帶菌者是本病的傳染源，尤以非典型病例、慢性患者和帶菌者在流行病學(xué)上的意義更為重要。主要內(nèi)容v生物學(xué)性狀v標(biāo)本采集和運送v分離培養(yǎng)v初步鑒定v血清凝集v系統(tǒng)生化鑒定生物學(xué)性狀 v形態(tài)與染色 為革蘭氏陰性桿菌，長約2-3 m ,寬0.5-0.7 m 。不形成芽胞，無莢膜，無鞭毛，有菌毛。 培養(yǎng)特性v需氧或兼性厭氧。營養(yǎng)要求不高，能在普通培養(yǎng)基上生長，最適溫度為37，最

2、適pH為6.4-7.8。37培養(yǎng)18-24小時后菌落呈圓形、微凸、光滑濕潤、無色、半透明、邊緣整齊，直徑約2nm，宋內(nèi)氏菌菌落一般較大，較不透明，并常出現(xiàn)扁平的粗糙型菌落。在液體培養(yǎng)基中呈均勻渾濁生長，無菌膜形成。 生化特性v能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣（福氏6型和鮑氏13、14型的部分菌株會產(chǎn)生少量氣體）。大多不發(fā)酵乳糖，僅宋內(nèi)氏菌遲緩發(fā)酵乳糖。靛基質(zhì)產(chǎn)生不定，甲基紅陽性，氧化酶、VP試驗均陰性，不產(chǎn)生H2S和尿素酶。根據(jù)生化反應(yīng)可進(jìn)行初步分類。 常以甘露醇和乳糖發(fā)酵特性來區(qū)分志賀菌的生化群常以甘露醇和乳糖發(fā)酵特性來區(qū)分志賀菌的生化群常以甘露醇和乳糖發(fā)酵特性來區(qū)分志賀菌的生化群常以甘露醇和乳糖發(fā)

3、酵特性來區(qū)分志賀菌的生化群 A群：痢疾志賀菌，甘露醇、乳糖、棉子糖及鳥氨 酸脫羧酶均陰性。B群：福氏志賀菌，棉子糖和甘露醇陽性（其 中4、 6型常見甘露醇陰性的變種），乳糖及鳥氨酸 脫羧酶陰性。C群：鮑氏志賀菌，甘露醇陽性，乳糖、棉子糖及 鳥氨酸脫羧酶（除13型）均陰性。D群：宋內(nèi)氏菌，甘露醇和乳糖（遲緩）陽性，鳥 氨酸脫羧酶陽性。志賀菌屬抗原分類菌名血清分類生化特性群型亞型甘露醇鳥氨酸脫羧酶志賀菌A112福氏菌B 16,X、y變種1a,1b,1c,2a,2b,3a,3b,3c,4,4a,4b,4c,5a,5b+鮑氏菌C118+宋內(nèi)菌D1+標(biāo)本采集v糞便標(biāo)本 應(yīng)盡量在抗生素應(yīng)用前采集，采集新鮮

4、糞便標(biāo)本中的膿血、黏液部分1g5g（水樣便1ml5ml）。肛拭子或采便管將標(biāo)本立即保存于Cary-Blair運送培養(yǎng)基內(nèi)送檢 v水標(biāo)本水標(biāo)本直接增菌法:直接采集可疑水樣450ml，加入50ml 10倍濃縮的GN增菌肉湯，37增菌68h。過濾集菌法：采集水樣5001000ml用無菌濾膜（ 0.450.65m）過濾，取下菌膜直接貼種于選擇性平板培養(yǎng)過夜或無菌條件下剪碎后放入9mlGN增菌肉湯，37增菌68h后轉(zhuǎn)種平板 。吸附沉淀法v食品食品固體：于廣口瓶或無菌塑料袋中，實驗室無菌稱取25g樣品，剪碎后加入225ml GN增菌肉湯中， 37增菌68h。液體：采取食品50100ml，實驗室無菌稱（量）

5、取25g（ml）樣品加入225ml GN增菌肉湯中， 37增菌68h。乳粉類應(yīng)以無菌操作取25g放入裝有225ml滅菌鹽水的三角瓶中，搖勻，37增菌68h。v血液: 當(dāng)懷疑為菌血癥時，靜脈采集510ml血液，按1:10比例加入血增菌培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。v其他標(biāo)本: 疑似痢疾爆發(fā)疫情病原學(xué)檢測時外環(huán)境樣本可采集患者的污染衣物、剩飯菜、可疑食品、抹布、污水、井水等，采集的標(biāo)本應(yīng)立即按1：10的比例接種GN增菌肉湯，置37增菌68h。媒介昆蟲如蒼蠅類，用消毒蠅拍拍打1015只/份,裝入9mlGN增菌肉湯中，盡快送實驗室，置37增菌46h。標(biāo)本運送v現(xiàn)場采集的糞便標(biāo)本若在2小時內(nèi)不能送達(dá)實驗室，應(yīng)置冷藏

6、包中送檢（內(nèi)置冰排，可保存13天）。v水、食品等外環(huán)境標(biāo)本若在2小時內(nèi)不能送達(dá)實驗室，應(yīng)保存于帶有冰排的采樣箱內(nèi)送檢。分離培養(yǎng)v直接分離直接分離 采用接種環(huán)多點蘸取糞便標(biāo)本中可疑部分或用采樣拭子直接涂種，接種于麥康凱（MAC）及海克頓（HE）腸道瓊脂平板各一塊。也可選XLD、SS、DHL或DCA，但應(yīng)慎用SS瓊脂，其可抑制型志賀菌生長。分離平板置37培養(yǎng)1824h。 v增菌分離增菌分離 水、食品及其他標(biāo)本于GN增菌肉湯中37增菌68h后，直接劃線分離MAC及HE瓊脂平板各一塊，37培養(yǎng)1824h。 v在HE上為透明、白色或淺綠色菌落 。v在MAC上為無色（乳糖陰性） ，圓形，半透明，濕潤、光滑、突起，大小為12mm的菌落。志賀氏菌在不同平板上的菌落形態(tài)志賀氏菌在不同平板上的菌落形態(tài)初步生化反應(yīng) v從37培養(yǎng)1624h的分離培養(yǎng)基上，觀察挑選可疑菌落，接種TSI或KAI培養(yǎng)基，先穿刺后劃線，做好標(biāo)記，取出后直接接種動力-靛基質(zhì)-尿素（MIU）培養(yǎng)基，放37培養(yǎng)16h以上，觀察結(jié)果。 v志賀菌屬在TSI上的生化反應(yīng)為：斜面紅色，底層產(chǎn)酸黃色，不產(chǎn)氣。v在KAI上斜面紅色，底層產(chǎn)酸黃色，不產(chǎn)氣或有少量氣體，不產(chǎn)生H2S。vMIU：無動力、尿素酶陰性、靛基質(zhì)陰性或陽性。 v下列培養(yǎng)物