動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)

1、細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)無菌操作技術(shù) 體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。即便使用設(shè)備完善的實(shí)驗(yàn)室，若實(shí)驗(yàn)者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范,也會(huì)導(dǎo)致污染。因而,為在一切操作中最大可能地保證無菌，每一項(xiàng)工作都必須做到有條不紊和完全可靠。 消毒消毒(disinfection)和消毒劑和消毒劑(disinfectant)滅菌滅菌(sterilization)防腐防腐(antisepsis)和防腐劑和防腐劑抑菌抑菌(bacteriostasis)和抑菌劑和抑菌劑(bacteriostatic)無菌無菌(asepsis)無菌技術(shù)無菌技術(shù)/無菌操作無菌操作(antis

2、eptic technique) :【培養(yǎng)前準(zhǔn)備】 在開始實(shí)驗(yàn)前要制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點(diǎn)無誤后將其放置操作場(chǎng)所(培養(yǎng)室、超凈臺(tái))內(nèi)，然后開始消毒。這可以避免開始實(shí)驗(yàn)后，因物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會(huì)?！静僮饕跋尽?無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用75酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。在工作臺(tái)面消毒時(shí)切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時(shí)照射紫外線，消毒時(shí)工作臺(tái)面上用品不要過多或重疊放置，否則會(huì)遮擋射線降低消毒效果。些操作用具如移液器、廢

3、液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺(tái)內(nèi)同時(shí)紫外線消毒?！鞠词趾椭b】 原則上和外科手術(shù)相同。平時(shí)僅做觀察不做培養(yǎng)操作時(shí)，可穿著細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)紫外線照射30min的清潔工作服。在利用超凈臺(tái)工作時(shí)，因整個(gè)前臂要伸入箱內(nèi)，應(yīng)著長(zhǎng)袖的清潔工作服，并于開始操作前要用75酒精消毒手。如果實(shí)驗(yàn)過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。 【火焰消毒】 在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌工作時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。 【操作】 進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以

4、防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。 培養(yǎng)細(xì)胞的觀察培養(yǎng)細(xì)胞的觀察肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及混濁度肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及混濁度倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長(zhǎng)良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同。血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞Coulter計(jì)數(shù)儀：人工計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)：1、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。3、靜置3分鐘。4、鏡下觀察，計(jì)算

5、計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算：細(xì)胞數(shù)/ml4大格細(xì)胞總數(shù)/ 410000注意：鏡下偶見由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的恃點(diǎn)，傳代方法有3種：1懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。 直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。2半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞） 此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。3貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 采

6、用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。細(xì)胞傳代方法細(xì)胞傳代方法貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法：1 吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液2 加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)）靜置2-10 min（顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)）。3 吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。4 用吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。5 離心，細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)液制成懸液。5 吸取1/101/40細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。6 加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。7 將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 任何培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從任何培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)

7、別死、活細(xì)胞是困難的。形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。 在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力細(xì)胞活力，由組織中分離，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對(duì)細(xì)胞是否細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。復(fù)蘇的效果。 培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定 1臺(tái)盼藍(lán)法活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色；用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力；方法： 1、將細(xì)胞懸液以0.5ml加入

8、試管中； 2、加入0.5ml 0.4%臺(tái)盼蘭染液，染色2一3分鐘； 3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片； 4、鏡下取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計(jì)細(xì)胞活力； 死細(xì)胞能被臺(tái)盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。 活力測(cè)定可以和細(xì)胞計(jì)數(shù)合起來進(jìn)行，但要考慮到染液對(duì)原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。 2四唑鹽（MTT）比色法四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)；MTT比色法的原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formaz

9、an量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值；MTT法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。操作步驟：（1）單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；103-104細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200微升（96孔培養(yǎng)板每孔容積370微升），37、5CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間（根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時(shí)間）；（2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)；（3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150微升孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解；（4）酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值（檢測(cè)波長(zhǎng)570納米）。記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞凍存和復(fù)蘇細(xì)胞凍存和復(fù)蘇 細(xì)胞低溫冷

10、凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費(fèi)，凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶很大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)

11、胞膜、細(xì)胞大的冰晶；相反，結(jié)晶很大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。慢凍程序慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序： 當(dāng)溫度在-25以上時(shí)， 12/min 當(dāng)溫度達(dá)-25以下時(shí)， 510/min 當(dāng)溫度達(dá)-100時(shí)，可迅速放入液氮中簡(jiǎn)易程序： 將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降12的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投入液氮中。低溫保護(hù)劑的應(yīng)用低溫保護(hù)劑的應(yīng)用 在細(xì)胞凍存時(shí)加入低溫保護(hù)劑，能

12、大大提高凍存效果。在細(xì)胞凍存時(shí)加入低溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。 常用的低溫保護(hù)劑是常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。細(xì)胞凍存方法細(xì)胞凍存方法 1預(yù)先配制凍存液：含預(yù)先配制凍存液：含20%血清培養(yǎng)基，血清培養(yǎng)基，10%DMSO，DMSO液用培養(yǎng)液配好，避

13、免因臨時(shí)配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞；液用培養(yǎng)液配好，避免因臨時(shí)配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞； 2取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嬉喝?duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嬉? ,用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1106 5 106細(xì)胞細(xì)胞/ /ml) )； 3 3加入加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。冷凍日期。細(xì)胞復(fù)蘇方法細(xì)胞復(fù)蘇方法 （1 1）從液氮中取出冷凍管，迅速投入）從液氮中取出冷凍管，迅速投入373738 38 水浴中，水浴中，使其融化（使其融化（1 1分鐘左右）；分鐘左右）； （2 2）5 5分鐘內(nèi)用培

14、養(yǎng)液稀釋至原體積的分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的1010倍以上；倍以上；（3 3）低速離心）低速離心1010分鐘；分鐘；（4 4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)的污染和檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)的污染和檢測(cè)細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌和病毒。無菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等是主要的污染源。嚴(yán)格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。 細(xì)菌和真菌的污染和檢測(cè)細(xì)菌和真菌的污染和檢測(cè) 肉眼直接觀察法肉眼直接觀察法 培養(yǎng)檢查法培養(yǎng)檢查法 顯微鏡觀察法顯微鏡觀察法支原體的污染和檢測(cè)支原體

15、的污染和檢測(cè)造成支原體高污染率的原因： 1.支原體大小0.10.8 um，無細(xì)胞壁，可透過一般過濾膜（0.22-0.45 um）；）； 2.支原體污染時(shí)，沒有明顯的肉眼或一般光學(xué)顯微鏡可觀察到的特征變化 ；3.過去缺乏簡(jiǎn)單、快速且可靠的檢測(cè)方式； 4.細(xì)胞流通間缺乏物品管理，造成實(shí)驗(yàn)室間的相互污染； 5.研究或操作人員忽略污染問題； 6.已受污染的細(xì)胞； 7.已受污染的培養(yǎng)基、血清。支原體之檢測(cè)：支原體之檢測(cè)：相差顯微鏡觀察法Hayflick培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法原理：直接培養(yǎng)支原體于培養(yǎng)基中，觀察其生長(zhǎng)及菌落生成。 特點(diǎn)：是目前最直接與靈敏之步驟，亦是用來評(píng)估其它偵測(cè)新步驟 之標(biāo)準(zhǔn)步驟。 缺點(diǎn)：培

16、養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，須35星期才能判斷。有些支原體不能在培養(yǎng)基培養(yǎng)出來 (例如M. hyorhinis)。需同時(shí)培養(yǎng)支原體株作為正反應(yīng)對(duì)照組，可能會(huì)造成污染。 DNA熒光染色法 原理利用熒光染劑（bisbenzimide, Hoechst 33258）檢測(cè)支原體污染。此染劑會(huì)結(jié)合到DNA之富含A-T區(qū)域，因?yàn)橹гw之DNA中A-T含量占多數(shù)（5580%），所以可將其染色而檢測(cè)。被支原體污染之細(xì)胞經(jīng)染色后，在細(xì)胞核外與細(xì)胞周圍可看到許多大小均一之熒光小點(diǎn)，即為支原體之DNA，證明有支原體之污染。 測(cè)試步驟用間接步驟，將待測(cè)細(xì)胞懸浮液或細(xì)胞培養(yǎng)液接種于指示細(xì)胞培養(yǎng)液中（indicator cell，例如Ve

17、ro cell or 3T3 cell），然后培養(yǎng)指示細(xì)胞再作螢光染色。正負(fù)反應(yīng)對(duì)照組亦可以接種于indicator cell內(nèi)作為對(duì)照。 待測(cè)細(xì)胞亦可作直接測(cè)試，但需為吸附型細(xì)胞，培養(yǎng)后直接作熒光染色。有些細(xì)胞易有熒光背景，而干擾結(jié)果判讀，則建議使用接種于指示細(xì)胞之步驟。 特點(diǎn)簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)與靈敏，廣泛使用，可作為例行之偵測(cè)步驟?？梢詡蓽y(cè)不易培養(yǎng)之支原體，例如M. hyorhinis，較直接培養(yǎng)法快，約一星期即可知道結(jié)果。 缺點(diǎn)：有時(shí)仍會(huì)有熒光背景，影響判讀。 PCR方法方法原理：利用具特殊專一性之primers，經(jīng)由PCR反應(yīng)來復(fù)制mycoplasma DNA。所用之primers來自myco

18、plasma之conserved 16S-23S rRNA序列，由于此段spacer之序列依m(xù)ycoplsma種類不同而不同，因此可依所復(fù)制之DNA大小及其restriction fragment大小差異來作偵測(cè)與鑒定。PCR方法方法特點(diǎn)：靈敏(e.g. 0.11.6 CFU / 5 ul sample) 與快速(一天)?？蓚蓽y(cè)不易培養(yǎng)之mycoplasma (e.g. M. hyorhinis)。不需培養(yǎng)mycoplasma作為正反應(yīng)對(duì)照組，避免可能之污染。缺點(diǎn)PCR反應(yīng)很靈敏，易有偽陽性結(jié)果。此方法尚在評(píng)估中，故結(jié)果僅作為參考和內(nèi)部品管之一部份。PCR方法方法支原體菌株來源：M.Argin

19、ini ATCC23838 精氨酸支原體,M.FermentaneATCC19989發(fā)酵支原體 ,M.SalivariumATCC23064唾液支原體 ,M.HominisATCC23114人型支原體 ,M.OraleATCC23714口腔支原體 ,M.HyorhinisATCC29052豬鼻支原體。 其共同引物序列來自16s和23s保守區(qū)域： 外部引物為： 1 5-3， 1 5-3； 內(nèi)部引物為： 2 5-3， 2 5-3。去除支原體污染：去除支原體污染： 1. 抗生素處理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），E