基因工程(跨課程)綜合性實(shí)驗(yàn)

1、基因工程（跨課程）綜合性實(shí)驗(yàn)基因工程（跨課程）綜合性實(shí)驗(yàn)基因工程發(fā)酵工藝原理生物技術(shù)藥物藥劑與藥動(dòng)學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院基因工程（跨課程）綜合性實(shí)驗(yàn)教學(xué)小組2007年5月（非正式出版物，請莫外傳）目 錄前言3一、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目4二、實(shí)驗(yàn)日程7三、實(shí)驗(yàn)分組9四、實(shí)驗(yàn)要求與質(zhì)量控制10五、重組蛋白質(zhì)藥物12（一）重組蛋白藥物背景知識12（二）重組蛋白藥物實(shí)驗(yàn)流程161、工程菌構(gòu)建.192、工程菌表達(dá)篩選.213、甘油種制備.254、生長曲線分析.275、表達(dá)影響因素實(shí)驗(yàn).306、表達(dá)進(jìn)程分析.327、工程菌發(fā)酵工藝.348、表達(dá)產(chǎn)物分離純化.37附錄一：SDS-PAGE.42六、重組DNA藥物.44（

2、一）重組DNA藥物背景知識.45（二）重組DNA藥物實(shí)驗(yàn)1、 質(zhì)粒DNA大規(guī)模制備.482、 質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物制備523、 TCR體外基因轉(zhuǎn)染、表達(dá)檢測和活性檢測.534、 TCR體內(nèi)給藥試驗(yàn).60附錄二1、 紫外吸收測定.612、 可見光吸收測定.63前 言生命科學(xué)與生物技術(shù)的最主要任務(wù)之一是利用其理論與技術(shù)研究成果為人類的健康服務(wù)，生物技術(shù)制藥則是其最主要的應(yīng)用領(lǐng)域，且在重大傳染性疾病、惡性腫瘤及其它疑難雜癥防治方面具有巨大的潛力。藥品的研究開發(fā)是一項(xiàng)龐大的系統(tǒng)工程，實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)的任何候選藥物要開發(fā)成新藥都需要經(jīng)過生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制研究、有效性評價(jià)和安全性評價(jià)等過程。需要特別指出的是，

3、生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制研究的內(nèi)容和任務(wù)還會(huì)始終貫穿于產(chǎn)品投產(chǎn)上市的過程中，相應(yīng)的技術(shù)手段也是作為企業(yè)生產(chǎn)或質(zhì)量控制人員必備的技能。因此，作為生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院的本科生，了解生物技術(shù)藥物研究、開發(fā)和生產(chǎn)的過程、掌握與生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制研究密切相關(guān)的技術(shù)手段是非常必要的。以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的基因工程藥物和基因工程抗體是當(dāng)今最主要的生物技術(shù)藥物形式，以DNA為基礎(chǔ)的基因治療制劑和DNA疫苗是未來生物制藥的主要發(fā)展方向之一?；蚬こ獭l(fā)酵工藝原理和生物技術(shù)藥物藥劑與藥動(dòng)學(xué)是與重組蛋白質(zhì)和重組DNA類藥物的生產(chǎn)工藝與質(zhì)量控制研究、以及安全性與有效性評價(jià)方面關(guān)系最為密切的專業(yè)課程，且相互構(gòu)成了基因工程制藥的上

4、、下游關(guān)系。本綜合性實(shí)驗(yàn)即為上述三門課程的跨課程綜合性實(shí)驗(yàn)，其目的在于培養(yǎng)學(xué)生理論聯(lián)系實(shí)際的能力，對重組蛋白質(zhì)和重組DNA等當(dāng)今和未來最主要的二大類生物技術(shù)藥物的研究、開發(fā)和生產(chǎn)有一個(gè)系統(tǒng)的了解，使所學(xué)課程的理論知識和實(shí)踐技能系統(tǒng)化，為以后從事生物技術(shù)藥物方面的工作打下較好的基礎(chǔ)。本綜合性實(shí)驗(yàn)分為“重組蛋白質(zhì)類藥物”和“重組DNA類藥物”二個(gè)單元。“重組蛋白質(zhì)藥物”單元設(shè)置了包括工程菌構(gòu)建、發(fā)酵和分離純化工藝等基因工程藥物主要工藝研究內(nèi)容在內(nèi)的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目；“重組DNA藥物”單元設(shè)置了包括質(zhì)粒DNA大規(guī)模制備、質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物制備、體外基因轉(zhuǎn)染和體內(nèi)給藥試驗(yàn)等DNA藥物主要研究內(nèi)容在內(nèi)的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目

5、。在具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容設(shè)置時(shí)，綜合考慮了前修課程分子生物學(xué)和生物工程下游技術(shù)的實(shí)驗(yàn)課已學(xué)內(nèi)容、本綜合實(shí)驗(yàn)總學(xué)時(shí)數(shù)（108學(xué)時(shí)）和實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件等因素。II 重組DNA類藥物1、TCR工程菌構(gòu)建3、TCR質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物制備4、TCR體外基因轉(zhuǎn)染I 重組蛋白質(zhì)類藥物1、工程菌構(gòu)建5、表達(dá)進(jìn)程與影響因素分析4、工程菌生長曲線分析綜合實(shí)驗(yàn)2、工程菌表達(dá)篩選6、工程菌發(fā)酵7、表達(dá)產(chǎn)物分離純化2、TCR質(zhì)粒DNA大規(guī)模制備5、TCR轉(zhuǎn)染基因表達(dá)檢測6、TCR轉(zhuǎn)染體外活性檢測7、TCR轉(zhuǎn)染體內(nèi)試驗(yàn)（藥代、藥效）一、 綜合實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（見圖1和表1）圖1 綜合實(shí)驗(yàn)單元與項(xiàng)目3、工程菌甘油種制備表1 基因工程（跨課程

6、）綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目說明序號實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目學(xué)時(shí)說 明公開課4介紹綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路、內(nèi)容、流程、實(shí)施計(jì)劃、要求等。I重組蛋白質(zhì)藥物501工程菌構(gòu)建2已完成。回顧工程菌hIL-18（PR/PL控制下的hIL-18，42誘導(dǎo)）和GST（Ptac控制下的GST，IPTG誘導(dǎo)）的構(gòu)建。2工程菌表達(dá)篩選10從pVB220-hIL-18轉(zhuǎn)化子中隨機(jī)選取8株，溫控表達(dá)，SDS-PAGE分析表達(dá)結(jié)果，選取一高表達(dá)菌株作為hIL-18的工程菌。3工程菌甘油種制備2將選定的hIL-18工程菌制成甘油種保存于-70。4工程菌生長分析6利用工程菌生長過程中的菌體密度測定繪制生長曲線、了解生長特性。5誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對工程菌生長與表達(dá)的影

7、響10觀察生長曲線中的早、中、晚期對菌體生長與目的基因表達(dá)水平的影響，以決定表達(dá)誘導(dǎo)最佳時(shí)機(jī)。6工程菌表達(dá)進(jìn)程分析10觀察工程菌表達(dá)誘導(dǎo)過程中目的產(chǎn)物積累進(jìn)程。以GST菌株進(jìn)行。7工程菌發(fā)酵2菌種活化起始的發(fā)酵工藝全過程及全自控發(fā)酵設(shè)備與單元操作演示8表達(dá)產(chǎn)物分離純化6超聲波法破碎菌體，包涵體分離、純化，變性與復(fù)性、柱層析純化（示教)。II 重組DNA藥物501工程菌構(gòu)建2已完成，回顧目的基因克隆、表達(dá)載體（pDNA3.1-TCR V7.1）構(gòu)建。2質(zhì)粒DNA大規(guī)模制備10工程菌培養(yǎng)、堿法裂解、陰離子交換柱層析純化、瓊脂糖電泳鑒定、DNA純度測定。3質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物制備6以脂質(zhì)體包被純化所獲

8、重組質(zhì)粒，以紫外吸收法測定包封率。4T淋巴細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染8以質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)染T細(xì)胞5轉(zhuǎn)染T細(xì)胞目的基因表達(dá)檢測4以流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染T細(xì)胞中目的基因的表達(dá)情況（學(xué)生制備樣品、老師操作流式細(xì)胞儀）。6轉(zhuǎn)染T細(xì)胞體外活性檢測10以轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞攻擊肝癌細(xì)胞，以流式細(xì)胞儀分析殺瘤活性（學(xué)生制備樣品、老師操作流式細(xì)胞儀）。7轉(zhuǎn)染T細(xì)胞體內(nèi)給藥試驗(yàn)10荷瘤鼠建模、目的基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染與表達(dá)分析（部分內(nèi)容示教）。實(shí)驗(yàn)總結(jié)暨試驗(yàn)技能知識競賽4對綜合實(shí)驗(yàn)性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行總結(jié)，講解實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求，并據(jù)情況組織相關(guān)知識競賽。二、實(shí)驗(yàn)日程（日期：07/6/407/6/22；作息時(shí)間：9:00-21:30）班級日程04（1）班

9、（先做重組蛋白質(zhì)藥物單元）04（2）班（先做重組DNA藥物單元）第1天4日/6月星期一Am：綜合實(shí)驗(yàn)公開課（課室：B2-314，8:30準(zhǔn)時(shí)開始）Pm：單元討論、IL-18工程菌構(gòu)建、IL-18菌種活化接種和平板劃線接種Pm：單元討論、TCR工程菌構(gòu)建、TCR菌種活化接種第2天5日/6月星期二工程菌表達(dá)篩選（溫控表達(dá)誘導(dǎo)）工程菌生長曲線分析 質(zhì)粒DNA大規(guī)模制備：堿法裂解、中和、異丙醇沉淀、洗鹽第3天6日/6月星期三工程菌表達(dá)篩選SDSPAGE（凝膠保存?zhèn)溆茫x定菌株，接種 質(zhì)粒DNA大規(guī)模制備：層析純化、電泳鑒定、紫外吸收法測定質(zhì)粒純品純度和濃度第4天7日/6月星期四工程菌甘油種制備表達(dá)影

10、響因素試驗(yàn)（誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響）表達(dá)進(jìn)程試驗(yàn)接種（GST菌種）質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物制備、包封率測定、T細(xì)胞體外基因轉(zhuǎn)染第5天8日/6月星期五表達(dá)影響因素試驗(yàn)SDS-PAGE（膠保存?zhèn)溆茫┍磉_(dá)進(jìn)程試驗(yàn)（IPTG誘導(dǎo)、不同時(shí)間點(diǎn)取樣）轉(zhuǎn)染T細(xì)胞體外活性檢測之一：腫瘤細(xì)胞接種，培養(yǎng)第6天9日/6月星期六準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染T細(xì)胞目的基因表達(dá)檢測：T細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)、流式樣品制備和檢測第7天10日/6月星期日準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染T細(xì)胞體外活性檢測之二：流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡第8天11日/6月星期一表達(dá)進(jìn)程分析SDS-PAGE（膠保存?zhèn)溆茫┺D(zhuǎn)染T細(xì)胞體內(nèi)給藥實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果討論與分析、看病理與免疫組化照片第9天12日/6月星期二SD

11、S-PAGE凝膠掃描分析（三次電泳膠）發(fā)酵罐觀摩（418室）準(zhǔn)備第10天13日/6月星期三表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)物的分離純化（示教）試驗(yàn)結(jié)果分析與討論重組DNA藥物單元開始，TCR菌種接種準(zhǔn)備第11天14日/6月星期四質(zhì)粒DNA大規(guī)模制備：堿法裂解、中和、異丙醇沉淀、洗鹽工程菌表達(dá)篩選（溫控表達(dá)誘導(dǎo)）（前一天下午IL-18接試管與平板劃線）工程菌生長曲線分析第12天15日/6月星期五 質(zhì)粒DNA大規(guī)模制備：離子交換層析純化、電泳鑒定、紫外吸收法測定質(zhì)粒純品純度和濃度工程菌表達(dá)篩選SDSPAGE（凝膠保存?zhèn)溆茫?，選定菌株。第13天16日/6月星期六準(zhǔn)備準(zhǔn)備第14天17日/6月星期日下午接種（每組派1個(gè)代表）

12、下午接種（每組派1個(gè)代表）第15天18日/6月星期一質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物制備、包封率測定、T細(xì)胞體外基因轉(zhuǎn)染工程菌甘油種制備表達(dá)影響因素試驗(yàn)（誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響）表達(dá)進(jìn)程試驗(yàn)接種（GST菌種）第16天19日/6月星期二轉(zhuǎn)染T細(xì)胞體外活性檢測：腫瘤細(xì)胞接種，培養(yǎng)表達(dá)影響因素試驗(yàn)SDS-PAGE（膠保存?zhèn)溆茫┍磉_(dá)進(jìn)程試驗(yàn)（IPTG誘導(dǎo)、不同時(shí)間點(diǎn)取樣）第17天20日/6月星期三轉(zhuǎn)染T細(xì)胞體外活性檢測：T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)表達(dá)進(jìn)程分析SDS-PAGE（膠保存?zhèn)溆茫┑?8天21日/6月星期四轉(zhuǎn)染T細(xì)胞體外活性檢測與目的基因表達(dá)檢測：流式細(xì)胞儀分析SDS-PAGE凝膠掃描分析（三次電泳膠）發(fā)酵罐觀摩（418

13、室）第19天22日/6月星期五轉(zhuǎn)染T細(xì)胞體內(nèi)給藥實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果討論與分析表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)物的分離純化（示教）試驗(yàn)結(jié)果分析與討論備注：1）帶有陰影字體所述實(shí)驗(yàn)的菌株為GST菌株（Tac啟動(dòng)子，IPTG誘導(dǎo)）。2）綜合實(shí)驗(yàn)公開課安排（第一天，6月4，星期一）8：309：00 黃院長講話（開設(shè)實(shí)驗(yàn)的背景、對學(xué)生的要求）9：0010：30 全體實(shí)驗(yàn)教師亮相，然后由李黃金做綜合實(shí)驗(yàn)整體介紹10：3010：40 休息十分鐘10：5012：00 就實(shí)驗(yàn)安排和內(nèi)容等提問和答疑（雙向） （請安排有經(jīng)驗(yàn)學(xué)生攝影)13：30 分班按所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)單元進(jìn)行工程菌構(gòu)建回顧與討論（以實(shí)驗(yàn)室分班和小組為單位）三、實(shí)驗(yàn)分組1 、分組

14、每個(gè)班按學(xué)號順序分為8組，組號按序依次為18組，每組人數(shù)分別為9、9、9、8、8、8、8、8。涉及到排序的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，如在超凈工作臺(tái)上的接種步驟，一律按1到8組順序進(jìn)行。2 、編號實(shí)驗(yàn)過程中必需對試管、搖瓶等進(jìn)行標(biāo)記，故統(tǒng)一進(jìn)行編號。編號規(guī)則為：班代表字母+組號-成員號，A代表1班，B代表2班。舉例：04（1）班1組1號同學(xué)挑取的轉(zhuǎn)化子標(biāo)記為A1-1； 04（1）班8組8號同學(xué)挑取的轉(zhuǎn)化子標(biāo)記為A8-8；04（2）班1組1號同學(xué)挑取的轉(zhuǎn)化子標(biāo)記為B1-1；04（2）班8組8號同學(xué)挑取的轉(zhuǎn)化子標(biāo)記為B8-8； 其余以此類推。3 、實(shí)驗(yàn)安排 生物制藥04（1）班先進(jìn)行“重組蛋白質(zhì)藥物”單元的實(shí)驗(yàn)，然

15、后進(jìn)行“重組DNA藥物”單元的實(shí)驗(yàn)。生物制藥04（2）班先進(jìn)行“重組DNA藥物”單元的實(shí)驗(yàn)，然后進(jìn)行“重組蛋白質(zhì)藥物”單元的實(shí)驗(yàn)。具體教室見實(shí)驗(yàn)中心的通知。 4、 注意事項(xiàng)由于綜合實(shí)驗(yàn)內(nèi)容比較多，希望各位同學(xué)精誠合作，特別是分光光度計(jì)、離心機(jī)等儀器的使用，由于數(shù)量有限，請發(fā)揚(yáng)團(tuán)隊(duì)精神，盡量按順序或同步進(jìn)行以節(jié)約時(shí)間。四、實(shí)驗(yàn)要求與質(zhì)量控制 綜合實(shí)驗(yàn)涉及的知識點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)技術(shù)眾多，為了培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)、科學(xué)求真之精神，并達(dá)到綜合實(shí)驗(yàn)之最大成效，以下對本綜合實(shí)驗(yàn)過程的要求進(jìn)行說明，且納入實(shí)驗(yàn)考核成績。1、預(yù)習(xí) 實(shí)驗(yàn)前須充分預(yù)習(xí)，要求隨機(jī)抽查時(shí)，每一位同學(xué)能夠清晰的闡述整體實(shí)驗(yàn)思路和具體的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目、原理

16、。2、實(shí)驗(yàn)過程除了遵守學(xué)校與學(xué)院一般實(shí)驗(yàn)紀(jì)律與要求外，還必須做到主動(dòng)性、能動(dòng)性與團(tuán)隊(duì)精神相接合，利用有限的資源與時(shí)間得到最好的培訓(xùn)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果。為此，本綜合實(shí)驗(yàn)將能否在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)內(nèi)容作為衡量學(xué)生動(dòng)手能力的關(guān)鍵指標(biāo)之一，并作為考核結(jié)果記入實(shí)驗(yàn)成績中。要達(dá)到此目的，同學(xué)們必須提前仔細(xì)閱讀實(shí)驗(yàn)講義，全面了解實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，透徹理解實(shí)驗(yàn)原理，熟悉各個(gè)操作步驟，并在實(shí)驗(yàn)過程中合理安排時(shí)間。3、實(shí)驗(yàn)原始記錄與結(jié)果整理 每天必須及時(shí)、真實(shí)、完整地記錄當(dāng)天所做實(shí)驗(yàn)情況，記錄實(shí)驗(yàn)過程中的異常情況，分析其原因，并將下述關(guān)鍵性實(shí)驗(yàn)結(jié)果整理于實(shí)驗(yàn)報(bào)告紙： I 重組蛋白質(zhì)藥物單元：1）表達(dá)篩選與甘油種制備：隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化

17、子表達(dá)誘導(dǎo)SDS-PAGE凝膠掃描照片、篩選確定的工程菌株株號及其表達(dá)水平（%）。2）生長曲線分析：選定工程菌培養(yǎng)過程中的OD600測定結(jié)果表及生長曲線圖。3）表達(dá)影響因素試驗(yàn)：不同誘導(dǎo)時(shí)機(jī)表達(dá)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)前、后樣品的SDS-PAGE凝膠掃描照片、表達(dá)水平、OD600值。4）表達(dá)進(jìn)程試驗(yàn)：工程菌（GST）表達(dá)誘導(dǎo)過程不同時(shí)間點(diǎn)樣品SDS-PAGE凝膠掃描照片、表達(dá)水平。5）表達(dá)產(chǎn)物分離純化：示教分析與討論II 重組DNA藥物單元：3） 質(zhì)粒DNA大規(guī)模制備：陰離子交換純化層析圖、提取和純化過程中樣品瓊脂糖電泳圖、質(zhì)粒純品純度和濃度測定結(jié)果。3） 質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物制備：包封率測定結(jié)果3） 基因

18、轉(zhuǎn)染、體外表達(dá)、體外活性、體內(nèi)給藥：示教分析與討論4、綜合實(shí)驗(yàn)報(bào)告 須按基因工程（跨課程）綜合實(shí)驗(yàn)論文撰寫規(guī)范撰寫、并提交綜合實(shí)驗(yàn)報(bào)告（電子打印版及電子版）。1）封面：標(biāo)題： 基因工程（跨課程）綜合性實(shí)驗(yàn)論文姓名： 班級： 學(xué)號： 指導(dǎo)教師：李黃金、周林、胡海梅、趙林、陳偉、段濤、張玲、袁茵薄華本、王金全、吳鳳麟廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院 生物制藥研究所2)知識產(chǎn)權(quán)申明本綜合性實(shí)驗(yàn)所采用的工程菌株與工藝技術(shù)參數(shù)主要來源于廣東藥學(xué)院生物制藥研究所的相關(guān)課題與研究成果，相關(guān)知識產(chǎn)權(quán)歸廣東藥學(xué)院生物制藥研究所所有，未經(jīng)許可不得擅自影印相關(guān)講義和使用相關(guān)工程菌株與工藝技術(shù)參數(shù)。3)論文內(nèi)容中英文

19、摘要英文摘要前言材料與方法結(jié)果與討論參考文獻(xiàn)致謝五、重組蛋白質(zhì)類藥物重組蛋白質(zhì)類藥物統(tǒng)稱基因工程藥物，該類藥物通用名常冠以“重組”前綴，因采用基因工程或重組DNA技術(shù)手段生產(chǎn)而得名。該類藥物在化學(xué)和生物學(xué)本質(zhì)上屬于人源或其它動(dòng)植物和微生物來源的、具有高度生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或多肽，它們在自然界的含量極微，傳統(tǒng)的天然提取工藝常難以達(dá)到工業(yè)規(guī)模和質(zhì)控要求，而基因工程則為此類活性物質(zhì)的工業(yè)規(guī)模高效生產(chǎn)提供了手段。利用基因工程手段生產(chǎn)的最終目的是在一個(gè)合適的系統(tǒng)中，使外源基因高效表達(dá)，從而生產(chǎn)有重要價(jià)值的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。廣義的基因工程包括外源基因的克隆、表達(dá)載體和表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建、表達(dá)生產(chǎn)（發(fā)酵）和分離純化等

20、過程。外源基因表達(dá)系統(tǒng)有原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)兩大類。目前用于基因工程藥物生產(chǎn)的原核表達(dá)系統(tǒng)主要是大腸桿菌系統(tǒng)，真核表達(dá)系統(tǒng)主要有畢赤酵母（Pichia pastoris）系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO系統(tǒng)。大腸桿菌系統(tǒng)因具有操作簡單、表達(dá)水平高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)而在基因工程制藥中具有不可替代的地位。本綜合實(shí)驗(yàn)以hIL-18的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)為例，全面介紹和學(xué)習(xí)工程菌構(gòu)建、表達(dá)篩選、甘油種制備、生長與表達(dá)分析、發(fā)酵工藝單元操作和表達(dá)產(chǎn)物分離純等基因工程藥物研發(fā)與生產(chǎn)實(shí)踐中最常用的技術(shù)與工藝過程。（一）、背景知識1、工程菌及工程菌構(gòu)建工程菌在基因工程產(chǎn)業(yè)中是特指經(jīng)基因工程手段構(gòu)建的、用于生產(chǎn)的菌種

21、。工程菌構(gòu)建包括目的基因的獲得、表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化子表達(dá)篩選、傳代穩(wěn)定性分析、鑒定和種子庫建立等內(nèi)容。2、 基因工程藥物工藝與質(zhì)控基因工程藥物工藝研究包括工程菌構(gòu)建與分析、發(fā)酵工藝（上游工藝）研究、分離純化工藝（下游工藝）研究和制劑工藝研究等內(nèi)容，質(zhì)控研究則貫穿于工程菌構(gòu)建和上、下游工藝研究的全過程，并以工程菌菌種庫、半成品原液和成品為主要質(zhì)控點(diǎn)。生產(chǎn)菌種菌種活化種子液制備發(fā)酵離心收菌粗提精純除菌原液稀釋、配制冷凍干燥成品圖2 基因工程制藥最常見工藝流程3、 目的基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物使用目的的不同和操作方法的差異，目的基因（外源基因）在大腸桿菌內(nèi)可以以不同形式進(jìn)行表達(dá)

22、。根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物定位可分為胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá)二種基本形式；根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物多肽鏈的N端或C端有無其它氨基酸序列可分為融合表達(dá)和非融合蛋白等二種基本類型；另外，在胞內(nèi)表達(dá)方式下，根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物的可溶與否，還可分為包涵體方式表達(dá)和可溶方式表達(dá)。在大多數(shù)情況下，非融合蛋白和融合蛋白的胞內(nèi)高效表達(dá)（非分泌表達(dá)）產(chǎn)物常以不溶的包涵體形式存在。非融合表達(dá)：指目的蛋白的N端和C端均不帶有目的蛋白以外的氨基酸殘基。為了表達(dá)非融合蛋白，使用的外源基因必須具有從起始密碼子到終止密碼子的完整讀碼框架。非融合蛋白的一級結(jié)構(gòu)和天然蛋白質(zhì)相同，是一些體內(nèi)應(yīng)用基因工程產(chǎn)品的必要條件，但是小分子非融合蛋白在原核細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定，易被降解

23、，而且不易純化。融合表達(dá)：即在目的蛋白的N端或C端帶有其它的氨基酸序列。為了表達(dá)N端融合蛋白，一般在表達(dá)載體的SD序列之后加上起始密碼子，其后為一段原核讀碼框架，接著是克隆位點(diǎn)。外源基因經(jīng)處理后克隆到該位點(diǎn)，其讀碼框架必須和上游的原核讀碼框架符合。表達(dá)C端融合蛋白的載體，在SD序列之后為克隆位點(diǎn)，其后是一段帶有終止密碼子的原核讀碼框架，將只有起始密碼子而沒有終止密碼子的外源基因插入到克隆位點(diǎn)，必須保持外源基因的讀碼框架和載體上原核讀碼框架相符合。融合蛋白在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)較穩(wěn)定，不易被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶降解。作為融合蛋白一部分的原核多肽往往可以利用來純化、檢測該融合蛋白，這種多肽又稱作“標(biāo)簽”（Ta

24、g）或受體蛋白，目前最常用的標(biāo)簽有His6和GST。分泌表達(dá)：所謂原核細(xì)胞的“分泌型表達(dá)”是指在細(xì)菌胞漿內(nèi)合成的多肽進(jìn)入內(nèi)膜和外膜的周間質(zhì)，而不是指合成的多肽分泌到細(xì)胞外。將一段原核或真核細(xì)胞的信號肽序列連接到欲表達(dá)基因的上游，在表達(dá)的蛋白進(jìn)入細(xì)胞周間質(zhì)時(shí)，信號肽被信號肽切割酶系統(tǒng)（各類蛋白酶）水解，產(chǎn)生游離的表達(dá)產(chǎn)物。分泌型表達(dá)可以保護(hù)外源蛋白不被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶降解，增加表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。由于表達(dá)的蛋白可以在周間隙進(jìn)行折疊，具有天然蛋白的構(gòu)象，所以分泌型表達(dá)的蛋白一般具有生物活性。分泌型表達(dá)的缺點(diǎn)是表達(dá)量較低，有時(shí)會(huì)產(chǎn)生信號肽不完全切割的融合蛋白，有時(shí)會(huì)發(fā)生非特異性切割，應(yīng)慎使用。4、原核表

25、達(dá)載體的基本組成元件啟動(dòng)子：啟動(dòng)子是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表達(dá)的“發(fā)動(dòng)機(jī)”，是基因表達(dá)最關(guān)鍵的調(diào)控元件。由于細(xì)菌RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動(dòng)子，因此原核表達(dá)載體所應(yīng)用的啟動(dòng)子必須是原核啟動(dòng)子。將外源基因克隆在其下游，原核RNA聚合酶識別該啟動(dòng)子后，帶動(dòng)真核基因在原核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。原核表達(dá)系統(tǒng)中常采用可調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子，基于乳糖操縱子調(diào)控模型的啟動(dòng)子是最常用的啟動(dòng)子，包括Lac(乳糖啟動(dòng)子)、LacUV5（突變型乳糖啟動(dòng)子，不受葡萄糖阻遏）、Tac（乳糖和色氨酸的雜合啟動(dòng)子）和T7啟動(dòng)子(來自T7噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子和RNA聚合酶組合)等，它們可由乳

26、糖誘導(dǎo)，在實(shí)踐中主要采用不易被降解的乳糖類似物IPTG作誘導(dǎo)劑。PL和PR（噬菌體的左右啟動(dòng)子）是另一類較常用的強(qiáng)啟動(dòng)子，其誘導(dǎo)模式主要基于其阻遏蛋白的溫敏型突變子，即高溫（42）失活，啟動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄。SD序列：在mRNA上有核糖體的結(jié)合位點(diǎn)，它們是起始密碼子AUG和一段位于AUG上游3-10bp處的由3-9bp組成的序列。這段序列富含嘌呤核苷酸，剛好與16S rRNA的3末端的富含嘧啶的序列互補(bǔ)，是核糖體RNA的識別與結(jié)合位點(diǎn)，即為SD序列。SD序列與AUG的距離將顯著地影響基因的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)錄終止子：構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，為了防止目的基因表達(dá)時(shí)轉(zhuǎn)錄過頭和干擾載體的穩(wěn)定性，一般都在多克隆位點(diǎn)的下

27、游插入一段很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄終止序列或采取雙終止子串聯(lián)。復(fù)制起點(diǎn)：載體自我增殖所必不可少的基本條件，并可協(xié)助維持使每個(gè)細(xì)胞含有一定拷貝數(shù)的質(zhì)粒。在一般情況下，一個(gè)質(zhì)粒只含有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。標(biāo)記基因：表達(dá)載體通常采用的標(biāo)記基因是抗生素抗性基因，有利于重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化子的篩選，常用的抗生素篩選標(biāo)記基因?yàn)榘逼S青霉素和卡那霉素抗性基因。5、人白介素18（hIL-18）hIL-18又稱IFN-誘生因子，由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，主要生物學(xué)活性是誘導(dǎo)Th1細(xì)胞產(chǎn)生IFN-，誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生GM-CSF，促進(jìn)T細(xì)胞和NK細(xì)胞增殖分化、促進(jìn)Fas配體表達(dá)，抑制新血管形成，因此，在感染性疾病、惡性腫瘤和免疫性疾病方面具有較大的

28、潛在應(yīng)用價(jià)值。成熟的hIL-18是由157個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，分子量約為18KD，不含信號肽和糖基化位點(diǎn)，內(nèi)含4個(gè)半胱氨酸殘基，但并不形成二硫鍵。 本實(shí)驗(yàn)單元即以hIL-18為重組蛋白質(zhì)藥物代表。（二） 重組蛋白藥物模塊實(shí)驗(yàn)流程1. 工程菌構(gòu)建8株菌體+非誘導(dǎo)菌體+Marker接LB+AP試管（8株，編號）37振蕩培養(yǎng)過夜轉(zhuǎn)接LB+AP試管shi37培養(yǎng)2.5-4hrSDS-PAGE42誘導(dǎo)培養(yǎng)4hr 2.3 表達(dá)篩選SDS-PAGE從劃線平板選擇對應(yīng)高表達(dá)菌株LB+AP平板劃線（編號）shi平板4保存2.表達(dá)篩選2.1 菌種活化2th3th綜合實(shí)驗(yàn)課公開課（上午）繪制生長曲線分析轉(zhuǎn)接LB

29、+AP搖瓶37靜置培養(yǎng)過夜37培養(yǎng)過夜37培養(yǎng)轉(zhuǎn)接LB+AP搖瓶shi不同時(shí)間點(diǎn)取樣shi測OD值shi1th 工程菌構(gòu)建回顧2.2 表達(dá)誘導(dǎo)4.生長曲線分析確定高表達(dá)菌株離心收菌，4保存 脫色凝膠置于10%甘油保存至第7天掃描，求表達(dá)水平3. 工程菌甘油種制備每人1支，-20保存5. 表達(dá)影響因素試驗(yàn)（誘導(dǎo)時(shí)機(jī)）脫色凝膠置于10%甘油保存至第7天掃描5th 4th早、中、晚期誘導(dǎo)4hr不同時(shí)間點(diǎn)取樣SDS-PAGE測OD值32菌體樣5.2 表達(dá)因素實(shí)驗(yàn)SDS-PAGESDS-PAGE 凝膠掃描分析6th 7發(fā)酵工藝（觀摩）6. 表達(dá)進(jìn)程分析轉(zhuǎn)接LB+AP搖瓶shiIPTG誘導(dǎo)5hr轉(zhuǎn)接3LB

30、+AP（20-50ml）誘導(dǎo)前后取樣取GST菌株接2 mlLB+AP37培養(yǎng)過夜5.2 表達(dá)誘導(dǎo)6.2 表達(dá)進(jìn)程分析SDS-PAGE誘導(dǎo)0、1、2、3、4、5hr菌體樣SDS-PAGE脫色凝膠置于10%甘油保存至第7天掃描7th 8、表達(dá)產(chǎn)物分離純化工程菌破菌、包涵體純化、變性、復(fù)性、純化（示教）重組蛋白藥物模塊試驗(yàn)結(jié)果分析與討論8th 實(shí)驗(yàn)一 工程菌構(gòu)建（工程菌構(gòu)建回顧）1. pBV220-hIL-18表達(dá)載體和工程菌構(gòu)建在本綜合性實(shí)驗(yàn)中目的基因的表達(dá)載體為pBV220，該載體的物理圖譜見圖2。該載體有一個(gè)氨芐青霉素抗性基因，在多克隆位點(diǎn)的上游為噬菌體的PL 和PR啟動(dòng)子，PL 和PR啟動(dòng)子

31、受噬菌體CI基因的負(fù)調(diào)控。CI阻遏蛋白是溫度敏感蛋白，在28-37培養(yǎng)時(shí)，CI產(chǎn)生抑制作用，在溫度升至42時(shí)，CI被破壞，這樣就解除了對啟動(dòng)子的封閉，使PL 和PR啟動(dòng)子開始下游基因轉(zhuǎn)錄。目的基因?yàn)閔IL-18的編碼序列（cDNA），采用RT-PCR技術(shù)從外周血細(xì)胞中獲得。首先據(jù)Genebank報(bào)道序列設(shè)計(jì)引物，并在引物的5端引入EcoR I位點(diǎn)和啟始密碼子ATG，在3端引入Hind 位點(diǎn)。IL-18基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoR I和Hind 雙酶切插入表達(dá)載體pBV220的相同位點(diǎn)即得hIL-18的表達(dá)載體pBV220-hIL-18。構(gòu)建的表達(dá)載體pBV220-hIL-18按常規(guī)方法

32、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5株后即得“重組hIL-18”的工程菌。圖3 pBV220的物理圖譜2. pGEX-GST表達(dá)載體和工程菌構(gòu)建pGEX-GST為商品化融合表達(dá)載體，主要用于外源基因的可溶性融合表達(dá)。GST（谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶）為大腸桿菌宿主細(xì)胞的天然高效、可溶性表達(dá)的蛋白。以其作為融合表達(dá)“標(biāo)簽”有二點(diǎn)優(yōu)勢：a) GST可以促進(jìn)二硫鍵的形成，使目的基因融合表達(dá)產(chǎn)物能正確折疊，因而常以可溶的表達(dá)產(chǎn)物存在；b)GST屬于大腸桿菌高效表達(dá)的天然產(chǎn)物，其mRNA的5端具有最適的結(jié)構(gòu)，有利于融合基因mRNA的翻譯，因此可大大提高融合基因表達(dá)水平。在pGEX-GST中，GST處于復(fù)合啟動(dòng)子Tac的控制之下，因

33、此可采用IPTG誘導(dǎo)。其載體如圖4所示，圖中所示載體中還有一個(gè)特殊設(shè)計(jì)，即GST與目的蛋白的融合位點(diǎn)位PreScission蛋白酶識別位點(diǎn)，融合蛋白可在4下進(jìn)行酶切反應(yīng)，可避免其它蛋白酶類37那樣的高溫條件對目的產(chǎn)物的破壞。本綜合實(shí)驗(yàn)中采取的是無外源基因的載體，即只表達(dá)GST，主要用于給同學(xué)們展示與pVB220-hIL-18不同的另一種啟動(dòng)子和表達(dá)誘導(dǎo)方式（PL/PR vs Tac；溫控vs IPTG誘導(dǎo)），并便于“表達(dá)進(jìn)程分析”。圖4 pGEX-GST的物理圖譜實(shí)驗(yàn)二 工程菌表達(dá)篩選一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)與掌握大腸桿菌系統(tǒng)工程菌表達(dá)篩選的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理含目的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，會(huì)得到

34、很多含有重組子的克隆，但這些含有重組子的不同克隆表達(dá)目的蛋白的能力是不相同的。首先誘導(dǎo)不同克隆進(jìn)行目的基因表達(dá)，然后利用SDSPAGE對菌體總蛋白進(jìn)行分離，再通過凝膠掃描分析各克隆的目的產(chǎn)物表達(dá)水平差異即可篩選到高表達(dá)菌株。三、實(shí)驗(yàn)試劑1、 pBV220-hIL-18轉(zhuǎn)化平板2、 LB培養(yǎng)基：胰化蛋白胨 10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g，定容至1L，用5M NaOH調(diào)PH值至7.0。15psi（1.05Kg/cm2）高壓蒸汽滅菌20min。3、 瓊脂粉4、 氨芐青霉素：儲(chǔ)存液濃度50mg/ml，用水溶，保存于20。工作濃度：松弛型質(zhì)粒50ug/ml，嚴(yán)緊型質(zhì)粒20ug/ml。5、 2

35、SDS上樣緩沖液：0.1mol/LTris（pH6.8）、4SDS、20甘油、0. 2溴酚籃、200mmol/L DTT（或10巰基乙醇），4保存。6、 10APS，TEMED和DTT存放在4冰箱。7、 10電泳緩沖液：Tris 6g、glycine 28.8g、SDS 10g，pH調(diào)至8.3，定容至1L。8、 30膠母液（AcrBis）：30acrylamide、0.8bis（即acrylamide 30g、bis 0.8g 定容至100ml），可在4存放數(shù)月。9、 分離膠緩沖液（pH8.8）：1.5M TrsiHCl。10、 濃縮膠緩沖液（pH6.8）：1.0M TrsiHCl。11、10

36、SDS12、考馬斯亮籃染色液：1.25g考馬斯亮籃R250、450ml甲醇、50ml冰醋酸、500ml水。13、脫色液：450ml甲醇、50ml冰醋酸、500ml水。14、10%（V/V）甘油四、實(shí)驗(yàn)用具無菌竹簽、微量移液器、平皿、10-15ml帶螺口或帶塞試管、恒溫?fù)u床、4冰箱、離心機(jī)、EP管、電爐、電泳儀、垂直電泳裝置、臺(tái)式脫色搖床、凝膠成像系統(tǒng)。五、實(shí)驗(yàn)方法（一）目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)1、轉(zhuǎn)化（已完成）：轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在含有50ug/ml氨芐青霉素的LB平板上，培養(yǎng)過夜后，在平板上會(huì)長出許多抗性菌落（轉(zhuǎn)化子）。2、菌種活化和平板劃線接種在無菌操作條件下，用無菌竹簽隨機(jī)挑取中等大小菌落的克隆，先

37、在含有50ug/ml氨芐青霉素的LB平板上輕輕劃線接種，線長約為1cm，隨后用帶有殘余菌體的牙簽接種含有2ml LB培養(yǎng)基（含50ug/ml氨芐青霉素）的帶蓋螺口試管，如此類推。每個(gè)學(xué)生接種1株，共接種8個(gè)轉(zhuǎn)化子單克隆，每個(gè)小組共用一個(gè)平板；及時(shí)、準(zhǔn)確做好劃線平板與試管的對應(yīng)編號和平板編號標(biāo)記。平板和試管種分別置于37培養(yǎng)箱和搖床培養(yǎng)過夜。3、把培養(yǎng)過夜的畫線平板保存于4冰箱。4、取2步驟所得支試管的菌液（20ul）按1：100的接種比例分別接種到8支含有2ml LB培養(yǎng)基（含50ug/ml氨芐青霉素）的試管中， 37培養(yǎng)2.5hr，42誘導(dǎo)培養(yǎng)4hr。每個(gè)小組設(shè)一非誘導(dǎo)對照，即以該組編號排首

38、位的過夜活化菌種接種一支試管，標(biāo)記為CK1，37培養(yǎng)2.5hr收菌，不做42表達(dá)誘導(dǎo)。5、離心收菌 表達(dá)誘導(dǎo)至4hr后，將試管收集、并置于4保存?zhèn)溆谩＃ǘ┕こ叹磉_(dá)篩選SDSPAGE1、樣品組成： 每小組共用一膠，每膠10孔，1號孔為非誘導(dǎo)菌體蛋白（對照CK1），2-9號孔為自小至大編號的菌株誘導(dǎo)菌體蛋白，10號孔為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（MM）。2、菌體樣品處理取培養(yǎng)物100ul于EP管，5000g5min離心，棄上清，菌體加入40ul上樣緩沖液，100水浴3min，待冷卻后10000g10min離心，小心吸取上清，轉(zhuǎn)入另一標(biāo)記好的EP管，室溫保存?zhèn)溆茫ㄈ玳L期放置，則置于4保存，電泳前再煮沸2分

39、鐘）。3、SDS-PAGE參照附件所述詳細(xì)方法進(jìn)行。膠濃度：分離膠濃度12%；濃縮膠5%；上樣量：15 ul恒流: 濃縮20mA，分離30mA；染色、脫色：甲醇/冰醋酸系統(tǒng)凝膠保存：10%甘油，室溫，至凝膠掃描分析。（三）凝膠掃描分析參照附件所述詳細(xì)方法進(jìn)行。六、注意事項(xiàng)1、轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌必須在含有適當(dāng)抗生素的LB平板上進(jìn)行培養(yǎng)，接種到試管中的菌落必需是單菌落，并且要同時(shí)進(jìn)行劃線培養(yǎng)。2、進(jìn)行劃線培養(yǎng)時(shí)各條線之間不能太密集，防止交叉污染。3、樣品加上上樣緩沖液煮沸后，一定要進(jìn)行離心，以除去顆粒物質(zhì)。4、電泳上樣時(shí)要小心，不要污染旁邊的泳道。七、評議1、過夜培養(yǎng)所得菌體按1：100接入到新的培

40、養(yǎng)基中后，37培養(yǎng)2.5hr一般能達(dá)到OD6000.6，此時(shí)即為對數(shù)中期。但是各菌株間生長速度常有較大差異，所以菌體密度常不相同，但以相同時(shí)間和條件培養(yǎng)、誘導(dǎo)能基本反映出菌株生長速度和表達(dá)水平差異，因此，各試管（菌株）之間的培養(yǎng)時(shí)間一定要相同。2、電泳中出現(xiàn)不規(guī)則的蛋白遷移帶是因?yàn)殡娪静环€(wěn)定，其它原因還包括樣品加量太多、樣品中的鹽濃度太高、邊緣效應(yīng)。如果在凝膠邊緣電泳條帶出現(xiàn)“微笑”狀的樣品（運(yùn)動(dòng)速度減慢），可能是因?yàn)槟z的中間比兩側(cè)更熱，應(yīng)降低電流。八、思考題1、單克隆接種到試管中培養(yǎng)時(shí)，為什么同時(shí)進(jìn)行劃線培養(yǎng)？2、SDSPAGE中蛋白質(zhì)樣品上樣前，加入上樣緩沖液的目的是什么？為什么還要在1

41、00沸水中，加熱3-5min？實(shí)驗(yàn)三 工程菌甘油種的制備一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?將高表達(dá)的工程菌制備成可中、長期保藏的菌種，掌握甘油種的制備方法。二、 實(shí)驗(yàn)原理菌種保存是工程菌研究和生產(chǎn)應(yīng)用的基礎(chǔ)，為了避免長期傳代可能引起的菌種變異，應(yīng)建立適合長期保藏的工程菌菌種并進(jìn)行保藏。菌種保藏的方法主要有固體斜面法、甘油凍存法、冷凍干燥法。本實(shí)驗(yàn)采用甘油種結(jié)合超低溫（-70）保存的方法，即用無菌甘油懸浮工程菌，并使甘油終濃度為30%（V/V），所獲物即為工程菌的甘油種。低溫可使工程菌的生命活動(dòng)處于非活躍狀態(tài)而能較長時(shí)間保存細(xì)胞活力、減少基因變異，而30%的甘油可保護(hù)菌種的細(xì)胞膜系統(tǒng)在冷凍與解凍循環(huán)中不被破壞而起

42、到保護(hù)作用。 三、 實(shí)驗(yàn)試劑和實(shí)驗(yàn)用具1. pBV220-hIL-18轉(zhuǎn)化子劃線平板2. 抗性LB液體培養(yǎng)基3. 抗性LB平皿4. 60甘油 121，30分鐘高溫滅菌5. 菌種保存管（EP管） 121，30分鐘高溫滅菌6. 10ml螺口試管 121，30分鐘高溫滅菌 7. 恒溫培養(yǎng)箱8. 恒溫振蕩器9. 無菌工作臺(tái)10. 滅菌牙簽與酒精燈四、 實(shí)驗(yàn)方法1. 在實(shí)驗(yàn)二中所獲平板上確定高效表達(dá)的轉(zhuǎn)化子所對應(yīng)的菌株，并用滅菌竹簽接種于一個(gè)含2ml抗性LB培養(yǎng)基的試管中。2. 37振蕩培養(yǎng)過夜（10-15小時(shí)）。3. 按1：1（V/V）的比例加入無菌的60甘油，混勻后分裝至事先滅菌的菌種保存管（1ml

43、/管），-70保存。五、 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 此過程全部在無菌工作臺(tái)中操作，注意操作保持始終無菌。實(shí)驗(yàn)四 工程菌生長曲線分析一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)用比濁法測定工程菌的生長曲線并了解其特點(diǎn)，掌握工程菌生長曲線的繪制方法及測定原理，理解生長曲線在研究和生產(chǎn)中的應(yīng)用。二、實(shí)驗(yàn)原理 將工程菌按一定比例接種到一定體積的、適合的新鮮培養(yǎng)基中，在適宜的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，定時(shí)測定培養(yǎng)液中的菌體量，以菌體量的對數(shù)作縱坐標(biāo)，生長時(shí)間作橫坐標(biāo)，繪制的曲線叫生長曲線。它反映了單細(xì)胞微生物在一定環(huán)境條件下于液體培養(yǎng)時(shí)所表現(xiàn)出的群體生長規(guī)律。依據(jù)其生長速率的不同，一般可把生長曲線分為延緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。這四個(gè)時(shí)期的長短因

44、菌種的遺傳性、接種量和培養(yǎng)條件的不同而有所改變。因此通過測定微生物的生長曲線，可了解各菌的生長規(guī)律，對于科研和生產(chǎn)都具有重要的指導(dǎo)意義。 測定微生物的數(shù)量有多種不同的方法，可根據(jù)要求和實(shí)驗(yàn)室條件選用。本實(shí)驗(yàn)采用比濁法測定，由于細(xì)菌懸液的濃度與光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度計(jì)測定菌懸液的光密度來推知菌液的濃度，并將所測的OD值與其對應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長曲線，此法快捷、簡便。 三、實(shí)驗(yàn)材料3.1菌種 IL-18工程菌3.2培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（Amp+）3.3試劑 去離子水四、實(shí)驗(yàn)儀器與器具可見光分光光度計(jì)（配1cm光程的比色杯），恒溫?fù)u床，超凈工作臺(tái)，移液器

45、，Tip頭，EP管，玻璃試管，500mL的三角瓶，擦鏡紙。五、實(shí)驗(yàn)步驟與方法實(shí)驗(yàn)流程為：種子液接種培養(yǎng)測定 5.1種子液制備 取IL-18工程菌的甘油菌種1管，按1%的接種量在超凈工作臺(tái)取20uL，接入2mL LB(Amp+)中，然后傾斜地置于搖床中，37，170rpm搖床培養(yǎng)過夜。5.2接種培養(yǎng)并取樣 按1%的接種量，在超凈工作臺(tái)將過夜培養(yǎng)的2mL IL-18工程菌種子液，接入到200mL LB(Amp+)中，搖勻后取出3mL置于EP管中，用于測0小時(shí)的OD值。將搖瓶放在搖床中，37，170rpm振搖培養(yǎng)。此時(shí)開始計(jì)時(shí)，然后每培養(yǎng)1小時(shí)將三角瓶取出置于超凈工作臺(tái)中，取樣測定其OD值，共測定8

46、小時(shí)。其中，前3小時(shí)每次取樣3mL，之后每次取樣1mL。5.3生物量測定 開啟可見光分光光度計(jì)電源，調(diào)節(jié)波長至600nm，將光標(biāo)移至T處，打開樣品室的蓋子，預(yù)熱30min。取3mL未接種的LB(Amp+)培養(yǎng)基裝入1cm光程的比色杯中，置于樣品室中第一個(gè)樣品槽中，使可見光射入此比色杯中，作為空白對照，儀器將自動(dòng)調(diào)零。將待測樣品加入比色杯中（前3個(gè)樣品由于OD值低可直接加入，后續(xù)的樣品由于OD值高需用2mL LB稀釋后再加入。），蓋上蓋子，將光標(biāo)調(diào)至A處，空白樣品的OD值自動(dòng)調(diào)整為0。拉動(dòng)拉桿，依次對樣品讀數(shù)，并記錄。5.4生長曲線繪制將測定的OD值填入下表： 時(shí)間0h1h2h3h4h5h6h7

47、h8hOD以上述表格中的時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制IL-18工程菌的生長曲線。 六、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)用可見光分光光度計(jì)測量菌液OD600值時(shí)，該值在0.300.80以內(nèi)時(shí)，OD600與菌液濃度成正比，超過此范圍，就不成正比了。對濃度大的菌懸液用未接種的LB液體培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后測定，經(jīng)稀釋后測得的OD值要乘以稀釋倍數(shù)，才是培養(yǎng)液實(shí)際的OD值。七、評議 在本實(shí)驗(yàn)中，通過從同一培養(yǎng)物中每隔一小時(shí)取相同量的樣來測其OD600，從而繪制生長曲線。也可用相同的菌種，同時(shí)培養(yǎng)若干瓶菌液，每一小時(shí)取出一瓶停止培養(yǎng)來測其OD600值，下一小時(shí)再取出一瓶，一直到培養(yǎng)的最后一小時(shí)只剩下一瓶，通過此方法可以

48、避免取樣對微生物生長培養(yǎng)造成的影響。八、思考題1用本實(shí)驗(yàn)方法測定微生物生長曲線，有何優(yōu)點(diǎn)？ 2若同時(shí)用平板計(jì)數(shù)法測定，所繪出的生長曲線與用比濁法測定繪出的生長曲線有何差異？為什么？ 實(shí)驗(yàn)五 工程菌表達(dá)影響因素實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解和掌握誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對工程菌表達(dá)的影響，進(jìn)一步理解工程菌生長和表達(dá)的矛盾關(guān)系，通過實(shí)驗(yàn)確定出IL-18工程菌最佳的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。二、實(shí)驗(yàn)原理基因工程菌的培養(yǎng)一般分兩段。前期是菌體生長，生長到某一階段，加入誘導(dǎo)因子，誘發(fā)產(chǎn)物表達(dá)。加入誘導(dǎo)因子的時(shí)間被稱為誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。對于基因工程菌一般選擇其對數(shù)生長期作為菌體的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。如果在對數(shù)生長早期進(jìn)行誘導(dǎo)，由于菌體量較少，蛋白的表達(dá)量不高。在

49、對數(shù)生長中期進(jìn)行誘導(dǎo)，工程菌的生長速度比較快，這時(shí)蛋白的積累加快，蛋白表達(dá)水平較高。而菌體進(jìn)入對數(shù)期后期，由于發(fā)酵液中營養(yǎng)的消耗，氧氣的缺乏及代謝產(chǎn)物的積累，使菌體的生長速度明顯受到抑制。在此狀態(tài)下誘導(dǎo)，表達(dá)顯然受到影響。三、實(shí)驗(yàn)試劑3.1菌種 IL-18工程菌3.2培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（Amp+）3.3試劑 去離子水四、實(shí)驗(yàn)儀器與器具恒溫?fù)u床，超凈工作臺(tái)，移液器，臺(tái)式高速離心機(jī)，Tip頭，EP管，玻璃試管，100mL的三角瓶，SDS-PAGE電泳設(shè)備。五、實(shí)驗(yàn)步驟與方法5.1種子液制備 取IL-18工程菌的甘油菌種1管，按1%的接種量分別接入3管2mL LB(Amp+)液體培養(yǎng)基中，然后傾斜地

50、置于搖床中，37，170rpm搖床培養(yǎng)過夜。5.2接種培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)按1%的接種量，將3管過夜培養(yǎng)的IL-18工程菌種子液，分別接入到30mL LB(Amp+)中，同時(shí)置于搖床中37，170rpm振搖培養(yǎng)。培養(yǎng)至2.5h時(shí)，取出一瓶，在超凈工作臺(tái)中取出3mL測其生物量，然后做好標(biāo)記，轉(zhuǎn)移至42進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。當(dāng)培養(yǎng)至4h時(shí)，再取出一瓶，同樣地取出3mL測生物量、標(biāo)記、轉(zhuǎn)移至42誘導(dǎo)表達(dá)。當(dāng)培養(yǎng)至6h時(shí)，取出最后一瓶，如前取樣、標(biāo)記、誘導(dǎo)表達(dá)。三瓶菌體均誘導(dǎo)表達(dá)4h。5.3誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束菌體處理三瓶菌體經(jīng)過4h誘導(dǎo)表達(dá)后，從搖床中取出，掏勻后吸取1mL用于測定生物量，另取1mL置于-20凍存。5.4

51、 SDS-PAGE檢測不同誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的表達(dá)量將-20凍存的菌體解凍后，取出100uL，10000rpm離心3min，棄掉上清，用40uL 2上樣緩沖液懸浮起來，按實(shí)驗(yàn)一和附錄一進(jìn)行SDS-PAGE電泳。六、思考題根據(jù)結(jié)果中的OD值和SDS-PAGE電泳的結(jié)果，分析工程菌生長和表達(dá)的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)六 工程菌表達(dá)進(jìn)程分析（GST）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過研究GST工程菌蛋白表達(dá)隨時(shí)間的變化關(guān)系，了解和掌握誘導(dǎo)時(shí)間對菌體表達(dá)量的影響，確定GST工程菌的最佳誘導(dǎo)時(shí)間。二、實(shí)驗(yàn)原理 誘導(dǎo)時(shí)間是指加入誘導(dǎo)劑后的培養(yǎng)時(shí)間。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，外源蛋白的表達(dá)量增加，但外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)的積累，對重組菌產(chǎn)生毒性，合成速率下降，甚至產(chǎn)物被分解。理論上足夠長時(shí)間里，菌體的表達(dá)隨時(shí)間呈“S”曲線型。三、實(shí)驗(yàn)試劑三、實(shí)驗(yàn)試劑3.1菌種 GST工程菌3.2培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（Amp+）3.3試劑 去離子水、0.2g/mL IPTG四、實(shí)驗(yàn)儀器與器具恒溫?fù)u床，超凈工作臺(tái)，移液器，臺(tái)式高速離心機(jī)，Tip頭，EP管，玻璃試管，100mL的三角瓶，SDS-PAGE電泳設(shè)備。五、實(shí)驗(yàn)步驟與方法5.1種子液制備 取GST工程菌的甘油菌種1管，按1%的接種量分別接入1管2mL LB(Amp+)液體培養(yǎng)基中，然后傾斜地置于搖