第十六章重組DNA技術(shù)

1、重組重組DNA技術(shù)技術(shù)劉新文北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)系劉新文，重組DNA技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 DNA克隆克隆(DNA cloning)：應(yīng)用酶學(xué)的方法，在：應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將目的基因與載體體外將目的基因與載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的制能力的DNA分子分子復(fù)制子，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)復(fù)制子，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，染宿主細胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，再進行擴增、提取獲得大量同一再進行擴增、提取獲得大量同一DNA分子的過程。分子的過程。DNA克隆又稱基因克?。寺∮址Q基因克隆（gene cloning）。）。

2、基因工程（基因工程（genetic engineering）：實現(xiàn)基因克）：實現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關(guān)的工作。又稱重組隆所采用的方法及相關(guān)的工作。又稱重組DNA技技術(shù)（術(shù)（recombinant DNA technology）劉新文，重組DNA技術(shù)一、一、克隆體系：目的基因、載體克隆體系：目的基因、載體DNA、工具酶、宿工具酶、宿主細胞等主細胞等 1、目的基因目的基因（target gene）：cDNA或基因組或基因組DNA 2、載體載體(vector)：質(zhì)粒質(zhì)粒、噬菌體、柯斯質(zhì)粒載體、噬菌體、柯斯質(zhì)粒載體、病毒和人工染色體等病毒和人工染色體等 cDNA （complementary DN

3、A）：指體外經(jīng)反轉(zhuǎn)錄：指體外經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的，與合成的，與RNA （常指（常指mRNA）互補的單鏈）互補的單鏈DNA,單鏈單鏈cDNA進而合成雙鏈進而合成雙鏈cDNA?；蚪M基因組DNA（genomic DNA）：代表一個細胞或生：代表一個細胞或生物體整套遺傳信息的所有物體整套遺傳信息的所有DNA序列，稱為基因組序列，稱為基因組DNA。劉新文，重組DNA技術(shù)質(zhì)粒質(zhì)粒（plasmid）：存在于細菌染色體外的小型環(huán)：存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈狀雙鏈DNA分子，在細胞中可以獨立進行復(fù)制并在分子，在細胞中可以獨立進行復(fù)制并在細胞分裂時恒定地傳給子代細胞。細胞分裂時恒定地傳給子代細胞。 3.1 限制

4、性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease): 存在存在于細菌體內(nèi)，能夠識別和切割雙鏈于細菌體內(nèi)，能夠識別和切割雙鏈DNA內(nèi)部特定核內(nèi)部特定核苷酸序列的一類核酸酶。苷酸序列的一類核酸酶。 3、工具酶：限制性核酸內(nèi)切酶、連接酶、工具酶：限制性核酸內(nèi)切酶、連接酶、DNA聚聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、堿性磷酸酶、末端聚合酶、合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、堿性磷酸酶、末端聚合酶、RNA酶、酶、DNA酶，等酶，等 常用的是常用的是IIII類限制性內(nèi)切酶類限制性內(nèi)切酶 許多限制性核酸內(nèi)切酶許多限制性核酸內(nèi)切酶IIII的識別序列屬于回文結(jié)構(gòu)的識別序列屬于回文結(jié)構(gòu)劉新文，重組DNA技術(shù)配伍末端（配

5、伍末端（compatible end）：不同限制性內(nèi)切酶產(chǎn)）：不同限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的相同粘性末端生的相同粘性末端 3.2 DNA聚合酶：大腸桿菌聚合酶：大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I（全酶）、（全酶）、Klenow片段片段 (Klenow 酶酶)、T4 DNA聚合酶以及聚合酶以及Taq酶等酶等 3.3 DNA連接酶連接酶T4 連接酶：可用于粘端與平端的連接連接酶：可用于粘端與平端的連接 4、宿主細胞：大腸桿菌、酵母、動物細胞、宿主細胞：大腸桿菌、酵母、動物細胞 劉新文，重組DNA技術(shù)第二節(jié)第二節(jié) DNA克隆的基本過程克隆的基本過程 分、切、接、轉(zhuǎn)、篩、表達分、切、接、轉(zhuǎn)、篩、表達一、一、“分分”

6、：目的基因及載體的制備：目的基因及載體的制備 1、分離基因的方法：化學(xué)合成、分離基因的方法：化學(xué)合成、PCR、基因組文庫、基因組文庫、cDNA文庫文庫 聚合酶鏈反應(yīng)（聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）：）：在反應(yīng)體系中加入模板在反應(yīng)體系中加入模板DNA、dNTP、特別設(shè)計的特、特別設(shè)計的特異引物及耐熱的異引物及耐熱的DNA聚合酶（常用聚合酶（常用Taq酶），經(jīng)多次酶），經(jīng)多次變性、退火、延伸循環(huán)反應(yīng)，使目的變性、退火、延伸循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA呈指數(shù)合呈指數(shù)合成的過程成的過程 劉新文，重組DNA技術(shù)cDNA文庫文庫(cDNA library)：以：以mR

7、NA為模板，利用為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶合成與反轉(zhuǎn)錄酶合成與mRNA互補的互補的DNA，再復(fù)制成雙鏈，再復(fù)制成雙鏈cDNA片段，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，這些受片段，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，這些受體菌包含了所有體菌包含了所有cDNA信息，總稱信息，總稱cDNA文庫文庫 。常用常用于篩選編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。于篩選編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因?；蚪M基因組DNA文庫文庫(genomic DNA library)：利用限制：利用限制性核酸內(nèi)切酶將組織或細胞染色體性核酸內(nèi)切酶將組織或細胞染色體DNA切割后，與切割后，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，這些受體菌包含了所適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，這些受體菌包含了所

8、有基因組有基因組DNA信息，總稱基因組信息，總稱基因組DNA文庫文庫 劉新文，重組DNA技術(shù) 2、常用載體：質(zhì)粒、噬菌體、病毒、常用載體：質(zhì)粒、噬菌體、病毒DNA 克隆載體（克隆載體（cloning vector）：用于目的基因的克隆、）：用于目的基因的克隆、擴增、序列分析和體外定點突變等擴增、序列分析和體外定點突變等 表達載體表達載體(expression vector)：用于在宿主細胞中表達：用于在宿主細胞中表達外源目的基因，獲得大量表達產(chǎn)物外源目的基因，獲得大量表達產(chǎn)物 二、二、“切切”：限制性內(nèi)切酶切割目的基因和載體：限制性內(nèi)切酶切割目的基因和載體DNA 三、三、“接接”：重組體的構(gòu)建

9、：重組體的構(gòu)建 四、四、“轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)”：重組：重組DNA分子導(dǎo)入受體細胞分子導(dǎo)入受體細胞 1、轉(zhuǎn)化（、轉(zhuǎn)化（transformation）：將質(zhì)粒或其它外源）：將質(zhì)?；蚱渌庠碊NA導(dǎo)入宿主細胞導(dǎo)入宿主細胞(常用大腸桿菌常用大腸桿菌)，并使其獲得新的，并使其獲得新的表型的過程表型的過程 劉新文，重組DNA技術(shù) 2、轉(zhuǎn)染（、轉(zhuǎn)染（transfection）：將外源）：將外源DNA導(dǎo)入真核細胞導(dǎo)入真核細胞的過程的過程 3、感染（、感染（transfection）：以）：以l l噬菌體、柯斯質(zhì)粒和噬菌體、柯斯質(zhì)粒和病毒為載體的重組病毒為載體的重組DNA分子，在體外經(jīng)過包裝成具分子，在體外經(jīng)過包裝成具有感染

10、能力的病毒或噬菌體顆粒，才能感染適當(dāng)?shù)挠懈腥灸芰Φ牟《净蚴删w顆粒，才能感染適當(dāng)?shù)募毎⒃诩毎麅?nèi)擴增。也稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)（細胞，并在細胞內(nèi)擴增。也稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction） 五、五、“篩篩”：篩選出含重組：篩選出含重組DNA的受體細胞的受體細胞 1、直接選擇法：遺傳標記【抗藥性標志選擇、營、直接選擇法：遺傳標記【抗藥性標志選擇、營養(yǎng)缺陷型的互補篩選法及分子標記（養(yǎng)缺陷型的互補篩選法及分子標記（PCR、分子雜、分子雜交）交）】 2、非直接選擇法：免疫化學(xué)法、酶聯(lián)免疫檢測法、非直接選擇法：免疫化學(xué)法、酶聯(lián)免疫檢測法 劉新文，重組DNA技術(shù)六、六、“表達表達”：使克隆基因在宿主細胞中復(fù)制、表：使

11、克隆基因在宿主細胞中復(fù)制、表達達 1、外源基因在原核細胞的表達、外源基因在原核細胞的表達 大腸桿菌是最常用的原核表達體系大腸桿菌是最常用的原核表達體系 真核基因在原核細胞中表達的蛋白質(zhì)常常形成不溶真核基因在原核細胞中表達的蛋白質(zhì)常常形成不溶性的包涵體性的包涵體 2、真核表達體系：酵母、昆蟲及哺乳動物細胞等、真核表達體系：酵母、昆蟲及哺乳動物細胞等 劉新文，重組DNA技術(shù)第三節(jié)第三節(jié) 重組重組DNA技術(shù)與分子醫(yī)學(xué)的關(guān)系技術(shù)與分子醫(yī)學(xué)的關(guān)系 疾病基因的發(fā)現(xiàn)、發(fā)展新藥物、疾病基因的發(fā)現(xiàn)、發(fā)展新藥物、DNA診斷、基因診斷、基因治療及遺傳病的防治治療及遺傳病的防治 一、疾病相關(guān)基因分析一、疾病相關(guān)基因分

12、析 1、功能克?。?、功能克隆（functional cloning）：根據(jù)基因的功能）：根據(jù)基因的功能（通常是根據(jù)其蛋白質(zhì)）產(chǎn)物來尋找、克隆與疾病相（通常是根據(jù)其蛋白質(zhì)）產(chǎn)物來尋找、克隆與疾病相關(guān)的基因關(guān)的基因 2、定位克?。ā⒍ㄎ豢寺。╬ositional cloning）：從一種致病基因）：從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍，最后克隆該基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍，最后克隆該基因 二、制造生物活性蛋白二、制造生物活性蛋白 劉新文，重組DNA技術(shù) 三、基因診斷三、基因診斷基因診斷：利用分子生物學(xué)的基本原理和技術(shù)，在基因診斷：利用分子生物學(xué)的基本原理和技術(shù)，在DNA或或RNA水平上

13、分析、鑒定與某些疾病有關(guān)基因水平上分析、鑒定與某些疾病有關(guān)基因的改變（基因結(jié)構(gòu)及其表達水平的異常）的改變（基因結(jié)構(gòu)及其表達水平的異常） 遺傳病的產(chǎn)前診斷、感染性疾病的快速診斷、某些遺傳病的產(chǎn)前診斷、感染性疾病的快速診斷、某些腫瘤的早期診斷以及器官移植供體的選擇和法醫(yī)學(xué)鑒腫瘤的早期診斷以及器官移植供體的選擇和法醫(yī)學(xué)鑒定等定等 四、四、基因治療基因治療 基因治療（基因治療（gene therapy）：）：將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，從而達到治療到患者細胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，從而達到治療疾病目的的方法疾病目的的方法 劉新文，重組DNA技術(shù) 1、基因治療的

14、方法、基因治療的方法 （分類）（分類）（1）基因矯正（）基因矯正（gene correction）：）：將致病基因的異將致病基因的異常堿基進行糾正，而保留正常部分常堿基進行糾正，而保留正常部分 （2）基因置換（）基因置換（gene replacement）：）：正?；蛲ㄟ^同正?；蛲ㄟ^同源重組，原位置換疾病基因源重組，原位置換疾病基因 （3）基因增補（）基因增補（gene augmentation）：）：正常基因非定正?；蚍嵌c整合，補償疾病基因的功能或使原有功能加強點整合，補償疾病基因的功能或使原有功能加強 （4）基因失活（）基因失活（gene inactivation）：）：采用各種方

15、式抑采用各種方式抑制或破壞某種基因的表達，如反義制或破壞某種基因的表達，如反義RNA和和RNA干擾干擾(RNAi)技術(shù)、核酶與三鏈技術(shù)、核酶與三鏈DNA、基因敲除（基因敲除（gene knock-out）等等 劉新文，重組DNA技術(shù)概述概述劉新文，重組DNA技術(shù)質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 劉新文，重組DNA技術(shù)質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體劉新文，重組DNA技術(shù)質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體理想載體的條件：理想載體的條件： 1、具有自主復(fù)制能力；、具有自主復(fù)制能力； 2、具有較多的拷貝數(shù)，易與宿主細胞的染、具有較多的拷貝數(shù)，易與宿主細胞的染色體色體DNA分開；分開； 3、分子量相對較小，能夠容納目的基因；、分子量相對較小，能夠容納

16、目的基因； 4、具有較多單一限制性內(nèi)切酶位點；、具有較多單一限制性內(nèi)切酶位點； 5、有一個或多個篩選標記；、有一個或多個篩選標記； 6、具有較高的遺傳穩(wěn)定性。、具有較高的遺傳穩(wěn)定性。 劉新文，重組DNA技術(shù) 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體1977年由Boliver等人自E.coli的天然質(zhì)粒建成。1、克隆載體、克隆載體劉新文，重組DNA技術(shù)An example of an E. coli expression vector. 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體2、表達載體、表達載體劉新文，重組DNA技術(shù)噬菌體載體噬菌體載體劉新文，重組DNA技術(shù)其它類型載體其它類型載體一、一、質(zhì)粒（質(zhì)粒（cosmid）二、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體二、逆

17、轉(zhuǎn)錄病毒載體三、三、Ti質(zhì)粒質(zhì)粒劉新文，重組DNA技術(shù)其它類型載體其它類型載體四、酵母人工染色體（四、酵母人工染色體（YAC）劉新文，重組DNA技術(shù)限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶劉新文，重組DNA技術(shù)限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶劉新文，重組DNA技術(shù)限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶劉新文，重組DNA技術(shù)限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶劉新文，重組DNA技術(shù)The interaction of EcoRI endo-nuclease with its target sequence. The dimeric enzyme (with its two subunits in gray and

18、 light blue) is shown bound to DNA. In the top view the DNA binding site is facing the viewer. In the bottom view the bound DNA is facing away from the viewer and is not visible. 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶劉新文，重組DNA技術(shù)限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 劉新文，重組DNA技術(shù)限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 劉新文，重組DNA技術(shù)工具酶工具酶 功功 能能 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 識別特異序列、切割識別特

19、異序列、切割DNADNA DNADNA連接酶連接酶 連接連接DNADNA片段片段 DNADNA聚合酶聚合酶I I 合成合成DNADNA 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶 合成合成cDNAcDNA 多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 5 末端磷酸化末端磷酸化 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶 在在3 3 羥基末端進行多聚物加尾羥基末端進行多聚物加尾 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 切除末端磷酸基切除末端磷酸基 劉新文，重組DNA技術(shù)基因工程的基本步驟基因工程的基本步驟1、分、分2、切、切3、接、接5、篩、篩4、轉(zhuǎn)、轉(zhuǎn)6、表達、表達劉新文，重組DNA技術(shù)基因工程的基本步驟基因工程的基本步驟劉新文，重組DNA技

20、術(shù)基因工程的基本步驟基因工程的基本步驟劉新文，重組DNA技術(shù)基因工程的基本步驟基因工程的基本步驟劉新文，重組DNA技術(shù)目的基因的獲得目的基因的獲得劉新文，重組DNA技術(shù)目的基因的獲得目的基因的獲得OH 3 OH 3 OH 3 Oligo dT primerDouble-strand cDNAOH 3 TTTnT 5 TTTnT 5 3 OHAAAnA5 Poly A tailmRNAReverse transcriptase dNTPsTTTnT 5 AAAnA5 OH 3 cDNAAlkali digestion of mRNA templatecDNADNA polymerase IdNT

21、PsAAAnATTTnT 5 OH 3 AAAnATTTnT 5 5 3 S1 nucleaseSingle-stranded hairpin susceptible to S1 nucleasemRNA三、三、cDNA文庫的建立文庫的建立劉新文，重組DNA技術(shù)目的基因的獲得目的基因的獲得四、DNA聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）劉新文，重組DNA技術(shù)重組體構(gòu)建重組體構(gòu)建一、一、劉新文，重組DNA技術(shù)DNA片段片段A DNA片段片段B 5 3 5 A G A T C T3 3 5 3 T C T A G A5 不同的限制性內(nèi)切酶水解不同的限制性內(nèi)切酶水解混合后經(jīng)混合后經(jīng)DNA連接酶連接連接酶連接BamH

22、I BglII G A T C T A G A T C TA 粘端粘端重組體構(gòu)建重組體構(gòu)建配伍末端連接配伍末端連接劉新文，重組DNA技術(shù)Complementary homopolymeric tails are added to the ends of the two fragments to be joined.重組體構(gòu)建重組體構(gòu)建 The optimal substrate for terminal transferase is the 3 OH at the end of a single strand of DNA at least three nucleotides long. 粘端

23、的生成粘端的生成劉新文，重組DNA技術(shù)重組體構(gòu)建重組體構(gòu)建劉新文，重組DNA技術(shù)重組體構(gòu)建重組體構(gòu)建劉新文，重組DNA技術(shù)重組體導(dǎo)入細胞重組體導(dǎo)入細胞劉新文，重組DNA技術(shù)重組子的篩選重組子的篩選劉新文，重組DNA技術(shù)重組子的篩選重組子的篩選劉新文，重組DNA技術(shù)重組子的篩選重組子的篩選劉新文，重組DNA技術(shù)重組子的篩選重組子的篩選劉新文，重組DNA技術(shù)重組子的篩選重組子的篩選Identifying a clone with the desired DNA segment 氨基酸序列氨基酸序列預(yù)測核苷酸序列預(yù)測核苷酸序列劉新文，重組DNA技術(shù)基因工程的應(yīng)用基因工程的應(yīng)用劉新文，重組DNA技術(shù)基因工程的應(yīng)用基因工程的應(yīng)用定點突變定點突變劉新文，重組DNA技術(shù)基因工程產(chǎn)品基因工程產(chǎn)品劉新文，重組DNA技術(shù)A tobacco plant in which the gene for firefly luciferase is expressed. Light was produced after the plant was w