大腸桿菌分子克隆載體

1、 第三節(jié)第三節(jié) 大腸桿菌分子克隆載體大腸桿菌分子克隆載體一、一、E.coli克隆載體的種類克隆載體的種類 1. 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體復(fù)制起點來自一些天然質(zhì)粒。復(fù)制起點來自一些天然質(zhì)粒。 2. 噬菌體載體噬菌體載體，P1和和M13、fd載體，復(fù)制載體，復(fù)制起點來自噬菌體。起點來自噬菌體。 3. COS質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體中插入質(zhì)粒載體中插入cos片段，片段，以利于體外包裝以利于體外包裝 4.4.噬粒載體（噬粒載體（phagemidphagemid）有質(zhì)粒和有質(zhì)粒和M13、fdfd的復(fù)制起點，以質(zhì)的復(fù)制起點，以質(zhì)?；蚴删w方式復(fù)制。?；蚴删w方式復(fù)制。 二、質(zhì)粒與質(zhì)粒載體二、質(zhì)粒與質(zhì)粒載體 1.

2、Ecoli的質(zhì)粒種類的質(zhì)粒種類 1) colE1因子（大腸桿菌素因子）因子（大腸桿菌素因子）多數(shù)不能進(jìn)行接多數(shù)不能進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移合轉(zhuǎn)移DNA，屬高拷貝松弛型。，屬高拷貝松弛型。 2) R因子（抗藥性因子）因子（抗藥性因子） 可接合轉(zhuǎn)移可接合轉(zhuǎn)移DNA，屬低拷貝，屬低拷貝 嚴(yán)緊型，嚴(yán)緊型， 質(zhì)粒較大，操作不便質(zhì)粒較大，操作不便 3) F因子（性因子）因子（性因子）2.質(zhì)粒的特點質(zhì)粒的特點 1) 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA復(fù)制與染色體復(fù)制無關(guān)復(fù)制與染色體復(fù)制無關(guān) 2) 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA以超螺旋形式存在以超螺旋形式存在 3) 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA可以接合轉(zhuǎn)移可以接合轉(zhuǎn)移 4) 質(zhì)粒的不相容性和不相容群質(zhì)粒的不相容性和不相

3、容群 5) 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的消除的消除化學(xué)和物理法化學(xué)和物理法(吖啶染料，吖啶染料，EtBr，高溫等，高溫等) 6) 質(zhì)粒的整合質(zhì)粒的整合F因子又可整合到因子又可整合到E.coli染色體中染色體中 3.質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移 1）質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移過程的轉(zhuǎn)移過程 donor cellRecipient cellnick-ligation at oriTdonor cell3)分離2)tro基因表達(dá)1)重新環(huán)化DNA轉(zhuǎn)移供體接合 DNA合成traT穩(wěn)定化細(xì)胞 壁接觸不穩(wěn)定接合對性繖 毛收縮繖毛結(jié)合性繖 毛-細(xì)胞壁接觸+質(zhì)粒的自主轉(zhuǎn)移過程質(zhì)粒的自主轉(zhuǎn)移過程 5353質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移和復(fù)制

4、的轉(zhuǎn)移和復(fù)制 2）質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的必備條件質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的必備條件 .轉(zhuǎn)移起點轉(zhuǎn)移起點(oriT),它是質(zhì)粒它是質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移時的復(fù)制起點轉(zhuǎn)移時的復(fù)制起點順順式式 作用（作用（cis-action） ii. 細(xì)胞附屬物細(xì)胞附屬物性纖毛，由蛋白質(zhì)構(gòu)成性纖毛，由蛋白質(zhì)構(gòu)成反式作用反式作用 .轉(zhuǎn)移過程所需的全部酶類轉(zhuǎn)移過程所需的全部酶類反式作用反式作用 3）質(zhì)粒轉(zhuǎn)移類型質(zhì)粒轉(zhuǎn)移類型 .自我轉(zhuǎn)移（自我轉(zhuǎn)移（Self-transmissible） .輔助轉(zhuǎn)移（輔助轉(zhuǎn)移（Donation）可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒僅具備可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒僅具備oriT，若，若無輔助質(zhì)粒，前者不會發(fā)生接合轉(zhuǎn)移。若輔助質(zhì)粒可無輔助質(zhì)粒，前者不會發(fā)生接合轉(zhuǎn)移。若

5、輔助質(zhì)?？商峁┧蟹词阶饔玫牡鞍踪|(zhì)，前者便會發(fā)生接合轉(zhuǎn)移。提供所有反式作用的蛋白質(zhì)，前者便會發(fā)生接合轉(zhuǎn)移。 .重組轉(zhuǎn)移（重組轉(zhuǎn)移（conduction）若質(zhì)粒無若質(zhì)粒無oriT，該質(zhì)粒只，該質(zhì)粒只有整合到輔助質(zhì)粒有整合到輔助質(zhì)粒DNA中，重組質(zhì)粒便可轉(zhuǎn)移。中，重組質(zhì)粒便可轉(zhuǎn)移。 因此，用于克隆外源因此，用于克隆外源DNADNA的分子克隆載體，只要具的分子克隆載體，只要具備備oriToriT即可，另外兩類功能基因可置于輔助質(zhì)粒上，即可，另外兩類功能基因可置于輔助質(zhì)粒上，該質(zhì)粒一般沒有該質(zhì)粒一般沒有oriToriT，因而可以減少后者進(jìn)入另一種，因而可以減少后者進(jìn)入另一種細(xì)胞的頻率。細(xì)胞的頻率。 +

6、導(dǎo)入自主轉(zhuǎn)移H +H donor無DNA轉(zhuǎn)移H 輔助轉(zhuǎn)移H質(zhì)粒自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒自主轉(zhuǎn)移R+RRR R+Notransfer+H H 重組DNA 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的輔助轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的輔助轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的重組轉(zhuǎn)移 R-重組重組DNA分子分子 4.質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的復(fù)制和調(diào)節(jié)控制的復(fù)制和調(diào)節(jié)控制 1) 復(fù)制機(jī)制復(fù)制機(jī)制復(fù)制方向、終止和方式復(fù)制方向、終止和方式 2) 質(zhì)?？截悢?shù)的控制質(zhì)?？截悢?shù)的控制抑制劑模型：高拷貝質(zhì)粒需抑制劑模型：高拷貝質(zhì)粒需高濃度抑制劑，低拷貝質(zhì)粒需低濃度抑制劑，同高濃度抑制劑，低拷貝質(zhì)粒需低濃度抑制劑，同一不相容群質(zhì)粒產(chǎn)生的抑制劑可交叉相互作用。一不相容群質(zhì)粒產(chǎn)生的抑制劑可交叉相互作用。

7、 3) 質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)控機(jī)制質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)控機(jī)制 例子例子: ColE1質(zhì)粒的復(fù)制及復(fù)制起點結(jié)構(gòu)質(zhì)粒的復(fù)制及復(fù)制起點結(jié)構(gòu) Boros etal.(1984)分離到一個分離到一個pBR322突變體，突變體，其拷貝數(shù)可達(dá)其拷貝數(shù)可達(dá)1000/ cell或或65%總總DNA，原因是在，原因是在RNAI基因的基因的3端附近發(fā)生一次端附近發(fā)生一次GT顛換。顛換。-555bpRNA II(primase)oriRNaseHColE1質(zhì)粒質(zhì)粒復(fù)制起點結(jié)構(gòu)復(fù)制起點結(jié)構(gòu)質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的的復(fù)制過程復(fù)制過程 5.大腸桿菌質(zhì)粒載體大腸桿菌質(zhì)粒載體 1) 常用質(zhì)粒載體的復(fù)制子常用質(zhì)粒載體的復(fù)制子 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 復(fù)制子來

8、源復(fù)制子來源 拷貝數(shù)拷貝數(shù) pBR322系列系列 pMB1 15-20 pUC系列系列 pMB1 500-700 pACYC系列系列 p15A 10-12 pSC101系列系列 pSC101 25 colE1 colE1 15-20 2) 質(zhì)粒載體常用的遺傳標(biāo)記基因質(zhì)粒載體常用的遺傳標(biāo)記基因 Apr Cmr Kanr Neor Tcr Hygr LacZ LacZ 3) 多克隆位點區(qū)多克隆位點區(qū) 大多數(shù)從大多數(shù)從pUCpUC系列中的多克隆位點衍生出來的系列中的多克隆位點衍生出來的 6.實例實例pUC18和和pUC19 pUC系列質(zhì)粒載體由系列質(zhì)粒載體由Messing et al.構(gòu)建，具有三個

9、構(gòu)建，具有三個顯著特點：顯著特點： 1）分子量小，僅為）分子量小，僅為2.7KB，容納外源，容納外源DNA量增大量增大 2）易于檢測是否有外源）易于檢測是否有外源DNA插入的標(biāo)記基因插入的標(biāo)記基因LacZ 3）多克隆位點區(qū)）多克隆位點區(qū) .多克隆位點成對地存在于多克隆位點成對地存在于pUC18和和pUC19中，位點排列中，位點排列順序相同，但方向相反。順序相同，但方向相反。 這種排列方式有利于外源這種排列方式有利于外源DNA的克隆和定向插入的克隆和定向插入 .產(chǎn)生不同末端規(guī)律排列產(chǎn)生不同末端規(guī)律排列: 兩端限制酶位點產(chǎn)生兩端限制酶位點產(chǎn)生5突起突起端（端（EcoRI和和Hind），與之相鄰的兩

10、個限制酶位點產(chǎn)），與之相鄰的兩個限制酶位點產(chǎn)生生3突起端（突起端（SstI、KpnI、SphI、PstI），中央四個限），中央四個限制酶位點產(chǎn)生制酶位點產(chǎn)生5突起端或平端。這種排列方式十分有突起端或平端。這種排列方式十分有利于插入利于插入DNA片段的單向缺失和缺失片段的回收。片段的單向缺失和缺失片段的回收。EcoSacKpnSmaBamXbaSalPstSphHinRI I I I HI I I I I dIIIpUC18pUC19HinSphPst SalXbaBamSmaKpnSacEcodIII I I I I HI I I I RIApOriLacZ(2.68kb)rpUC18和和pU

11、C19載體載體 如插入片段的如插入片段的5段定向缺失段定向缺失: XbaISphIExoS1T4 DNA lingase; 插入片段的插入片段的3-端亦可采用類似的方法進(jìn)行缺端亦可采用類似的方法進(jìn)行缺失（失（SmaISstIExoS1T4 DNA lingase） 不同載體中的多克隆位點區(qū)可以供不同目的片段的重組。又不同載體中的多克隆位點區(qū)可以供不同目的片段的重組。又例如例如: pBS+多克隆位點區(qū)的排列順序是多克隆位點區(qū)的排列順序是(見圖見圖)： 假設(shè)有一假設(shè)有一EcoRIHind DNA片段，并要求在其片段，并要求在其3-末端或末端或5-端接上另外的端接上另外的DNA片段（如終止子、啟動子

12、），片段（如終止子、啟動子），顯然，顯然，pUC系列載體的多克隆位點區(qū)是不太適宜，但選用系列載體的多克隆位點區(qū)是不太適宜，但選用pBS+中的多克隆位點區(qū)就能滿足要求。中的多克隆位點區(qū)就能滿足要求。 . 多克隆位點集中排列多克隆位點集中排列，有利于克隆片段的物理圖譜的有利于克隆片段的物理圖譜的繪制。繪制。 除上述三個特點外，除上述三個特點外，pUC系列載體還可用于表達(dá)外源系列載體還可用于表達(dá)外源基因基因 （LacZ啟動子）。啟動子）。Plac Plac LacZorioriF1(-)Ampr T 3 T 7 pBS-SK(-)pBS-KS(-)pBS(3.0 kb)pBS載體的結(jié)構(gòu)載體的結(jié)構(gòu) 三

13、三. 噬菌體載體噬菌體載體 1. 噬菌體噬菌體載體載體 1）的結(jié)構(gòu)和特點的結(jié)構(gòu)和特點 i. 一般結(jié)構(gòu)：一般結(jié)構(gòu)：48,502bp，線狀，線狀ds-DNA，兩端具有，兩端具有12n.t 5-突起（突起（5-GGGCGGCGACCT-3）該末端稱為）該末端稱為cos位點，可被位點，可被編碼的末端酶所識別（該酶由編碼的末端酶所識別（該酶由末端的兩末端的兩個基因個基因Nul和和A編碼蛋白編碼蛋白gpNul和和gpA組成）組成） ii. 基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)46個基因，分為以下四類：個基因，分為以下四類： ) 調(diào)控基因：調(diào)控基因：C、N、CI、Cro、C決定進(jìn)入溶決定進(jìn)入溶源化還是裂解狀態(tài)源化還是裂解狀態(tài)

14、) DNA復(fù)制：復(fù)制：O、P、Q )重組：重組：int、xis、red和和gam )噬菌體顆粒形成與細(xì)胞裂解：頭噬菌體顆粒形成與細(xì)胞裂解：頭(A-F)、尾、尾(E-J)、S & R （細(xì)胞裂解）（細(xì)胞裂解）中部約中部約1/3的的DNA(b2)與與存活無關(guān)。存活無關(guān)。w G T A B C D E Z U V H K I J N O P Q S R 免疫和調(diào)控整合切除、重組DNA合成宿主裂解att PIkiltLOLPLNPMtMOriPRtR1ORTR2cIintexocIII relOPQSRPRCrotLOLORtR1PLtR2NPR后早期激活后期tMPMP ECI阻遏物溶源性建立

15、和保持M L頭 尾Pi大腸桿菌大腸桿菌噬菌體的基因和表達(dá)調(diào)控噬菌體的基因和表達(dá)調(diào)控 2) 噬菌體基因的表達(dá)噬菌體基因的表達(dá) i. 最早期轉(zhuǎn)錄：轉(zhuǎn)錄起始于最早期轉(zhuǎn)錄：轉(zhuǎn)錄起始于CI基因兩側(cè)的基因兩側(cè)的PL和和PR啟動子，啟動子，止于止于N和和Cro末端的末端的tL和和tR1，有的右向轉(zhuǎn)錄物可継續(xù)通，有的右向轉(zhuǎn)錄物可継續(xù)通過過O和和P止于止于tR2。 ii. 后早期轉(zhuǎn)錄：后早期轉(zhuǎn)錄：N蛋白可使宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄終止因子蛋白可使宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄終止因子失活，失活，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄通過導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄通過tR1、tR2和和tL進(jìn)入其余早期基因區(qū)域。進(jìn)入其余早期基因區(qū)域。 iii. 后期轉(zhuǎn)錄：后期轉(zhuǎn)錄：cro蛋白可與蛋白可與OL

16、和和OR結(jié)合，阻止結(jié)合，阻止RNA聚合聚合酶與酶與PL和和PR結(jié)合，轉(zhuǎn)錄終止，此時已合成了足夠多的結(jié)合，轉(zhuǎn)錄終止，此時已合成了足夠多的控制蛋白控制蛋白Q，它對，它對PR起激活作用，導(dǎo)致后期基因轉(zhuǎn)錄。起激活作用，導(dǎo)致后期基因轉(zhuǎn)錄。 iv. DNA復(fù)制：因早期轉(zhuǎn)錄獲復(fù)制：因早期轉(zhuǎn)錄獲DNA復(fù)制蛋白復(fù)制蛋白O和和P，雙向，雙向復(fù)制開始。復(fù)制開始。 v. 包裝：包裝：Nul和和A蛋白與蛋白與DNA的的cos位點的識別與切割，位點的識別與切割，F(xiàn)I蛋白促進(jìn)蛋白促進(jìn)DNA進(jìn)入頭部蛋白，進(jìn)入頭部蛋白，DNA充滿后，充滿后，gpw和和gpF將頭部封住，然后與尾部相連，形成噬菌體顆粒。將頭部封住，然后與尾部相連

17、，形成噬菌體顆粒。 vi. 裂解：基因裂解：基因R和和S產(chǎn)物形成，細(xì)菌細(xì)胞裂解，噬菌體顆產(chǎn)物形成，細(xì)菌細(xì)胞裂解，噬菌體顆粒釋放。粒釋放。 vii. 溶源反應(yīng)：溶源反應(yīng)：C和和C基因產(chǎn)物分別激活基因產(chǎn)物分別激活PE和和PI的左向的左向轉(zhuǎn)錄，致使轉(zhuǎn)錄，致使CI和和int基因表達(dá)，基因表達(dá)，CI 產(chǎn)物可阻止早期轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物可阻止早期轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致后期基因表達(dá)受阻。導(dǎo)致后期基因表達(dá)受阻。 對于裂解反應(yīng)和溶源反應(yīng)的選擇，取決于感染細(xì)胞中對于裂解反應(yīng)和溶源反應(yīng)的選擇，取決于感染細(xì)胞中一系列宿主和噬菌體因子間錯綜復(fù)雜的精細(xì)平衡關(guān)系。一系列宿主和噬菌體因子間錯綜復(fù)雜的精細(xì)平衡關(guān)系。* 當(dāng)當(dāng)DNA注入宿主細(xì)胞后，線狀

18、注入宿主細(xì)胞后，線狀DNA首先環(huán)化為環(huán)狀首先環(huán)化為環(huán)狀DNA，這種環(huán)化有以下幾點好處：，這種環(huán)化有以下幾點好處： a. 若為單向復(fù)制，不管從何處開始復(fù)制，全基因組均若為單向復(fù)制，不管從何處開始復(fù)制，全基因組均 可全部復(fù)制可全部復(fù)制 b. 噬菌體噬菌體DNA插入宿主染色體插入宿主染色體DNA，只需一次位點，只需一次位點特異性重組特異性重組 c. 拓?fù)洚悩?gòu)酶易于對其進(jìn)行不足和過度加旋拓?fù)洚悩?gòu)酶易于對其進(jìn)行不足和過度加旋 d. 受損的基因組增大了存活的可能性，因為雙向復(fù)受損的基因組增大了存活的可能性，因為雙向復(fù)制不會受阻于制不會受阻于 損傷的損傷的DNA鏈，而單向復(fù)制就不能通過鏈，而單向復(fù)制就不能通

19、過 3) DNA的復(fù)制的復(fù)制細(xì)胞外細(xì)胞內(nèi)4) DNA的包裝過程的包裝過程 l l 頭頭尾連接器由尾連接器由12分子分子gpB構(gòu)成中空結(jié)構(gòu)，構(gòu)成中空結(jié)構(gòu)，groE1和和groES負(fù)責(zé)裝配負(fù)責(zé)裝配 l l pX由由10個雜合的個雜合的gpC和和gpE構(gòu)成，使連接器定位構(gòu)成，使連接器定位 l l gpW和和gpF結(jié)合在連接器上，防止結(jié)合在連接器上，防止DNA外泄，提供尾部外泄，提供尾部粘著點粘著點末端酶末端酶由兩基因產(chǎn)物組成（由兩基因產(chǎn)物組成（Nul和和A），），gpNul2-gpA1 (20,444 x 2 + 72,280 = 113,168) 該酶具有以下多種酶活性該酶具有以下多種酶活性：1）

20、特異）特異DNA位點結(jié)合；位點結(jié)合；2）特異）特異位點切口形成；位點切口形成；3）頭前體結(jié)合；）頭前體結(jié)合；4）gpFI結(jié)合；結(jié)合；5）cos位點位點變性；變性；6）DNA轉(zhuǎn)位；轉(zhuǎn)位；7）DNA序列掃描；序列掃描；8）ATP結(jié)合；結(jié)合；9）ATP水解。水解。 因此，頭部蛋白因此，頭部蛋白gpEgpE和和gpDgpD以及包裝蛋白以及包裝蛋白gpAgpA是是DNADNA形成形成噬菌體顆粒必不可少的組分，體外包裝物的制備就是依據(jù)這噬菌體顆粒必不可少的組分，體外包裝物的制備就是依據(jù)這一結(jié)論一結(jié)論 頭-尾連接器gpB gp Nu3gp gro ELgp gro ESgpc.E gpNu3gpE px g

21、pc gpA gpNu1 E.coliE.coli INF Or THFgpFII gpw gpD末端酶復(fù)合物II (F1可促進(jìn)該復(fù)合物形成）擴(kuò)張復(fù)合物IDNANu1 左端 ABCNu3DEFIFIIWDNA的包裝的包裝 5）DNA作載體的缺點和解決辦法作載體的缺點和解決辦法 i.頭部只能容納自身頭部只能容納自身DNA的的78-105%，即，即39-52.5 Kb，天然天然僅可插入僅可插入3 Kb外源外源DNA片段片段除去所有與除去所有與裂解裂解無關(guān)的基因和空白區(qū)，最大可插入無關(guān)的基因和空白區(qū)，最大可插入22 Kb。 ii.同一種限制酶具有多個識別位點，不利于外源同一種限制酶具有多個識別位點，

22、不利于外源DNA插插入入體內(nèi)突變和建立新的克隆位點。體內(nèi)突變和建立新的克隆位點。 .重組的重組的DNA分子難于直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞分子難于直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞利用體外利用體外包裝成病毒顆粒，然后通過感染的方法注入包裝成病毒顆粒，然后通過感染的方法注入DNA。 6) 載體的種類載體的種類 i. 插入型插入型即將外源即將外源DNA直接插入已構(gòu)建載體中，如直接插入已構(gòu)建載體中，如gt11，可以插入長達(dá)，可以插入長達(dá)7 Kb的的DNA。這類載體被限制酶。這類載體被限制酶切成左右臂。切成左右臂。 .取代型取代型即利用一段外源即利用一段外源DNA去取代載體中的一段去取代載體中的一段DNA，而這段，而這段DNA常含

23、有一定的標(biāo)記基因。這類載體常含有一定的標(biāo)記基因。這類載體常被限制酶切為三段：左臂、隔離段和右臂。常被限制酶切為三段：左臂、隔離段和右臂。 * 有的取代型有的取代型載體亦可用作插入型載體載體亦可用作插入型載體,如如Charon 4A左臂 隔離段 右臂E Xb E E 50kb lac5 bio256 KH54nin5 QSR80限制酶 克隆方式： EcoRI取代法E E 20.1kb 7.1kbXbI 插入法 Xb Xb 5.64 0大腸桿菌大腸桿菌載體載體Charon 4Ared gamred gamP2 導(dǎo)入 外源DNA 取代無噬菌斑+ P2導(dǎo)入滾環(huán)復(fù)制-Spi 重組子的篩選重組子的篩選 7

24、) 載體的遺傳標(biāo)記基因和重組子篩選載體的遺傳標(biāo)記基因和重組子篩選 由于由于載體或重組載體或重組DNA是通過感染途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞的，是通過感染途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞的，因而形成的噬菌斑就是一個明顯的標(biāo)記。用于重組子檢測的因而形成的噬菌斑就是一個明顯的標(biāo)記。用于重組子檢測的遺傳標(biāo)記基因主要有遺傳標(biāo)記基因主要有l(wèi)acZ 基因。不管是用插入或取代法，該基因。不管是用插入或取代法，該標(biāo)記基因均會失活。標(biāo)記基因均會失活。 利用利用spi-選擇重組子選擇重組子：野生型：野生型不能在不能在P2溶源化菌種中成活，溶源化菌種中成活，稱之為稱之為spi+(sensitive to P2 interference)，這與，

25、這與red和和gam基因基因有關(guān)。若用外源有關(guān)。若用外源DNA將這些基因取代，形成的重組將這些基因取代，形成的重組DNA分分子可在子可在P2菌中株中存活，并形成噬菌斑。菌中株中存活，并形成噬菌斑。載體載體1059、L47.1均屬此類，這種選擇方式亦稱之為顯性選擇。均屬此類，這種選擇方式亦稱之為顯性選擇。 2. P1噬菌體載體噬菌體載體 1) 基本結(jié)構(gòu)與特征基本結(jié)構(gòu)與特征 i. 基因組長基因組長88 kb, 在噬菌體顆粒中的在噬菌體顆粒中的DNA長長100 kb, 呈呈線狀線狀,其中約有其中約有12%的多余的多余DNA; ii. 可以低拷貝質(zhì)粒形式存在于細(xì)菌細(xì)胞中可以低拷貝質(zhì)粒形式存在于細(xì)菌細(xì)胞

26、中, 又可以烈性又可以烈性噬菌體形式進(jìn)行復(fù)制噬菌體形式進(jìn)行復(fù)制; iii. P1噬菌體包裝原理噬菌體包裝原理: 漸進(jìn)滿頭機(jī)制（漸進(jìn)滿頭機(jī)制（processive headful mechanism） 底物底物: 滾環(huán)復(fù)制過程形成的頭尾相連串狀體滾環(huán)復(fù)制過程形成的頭尾相連串狀體 包裝過程包裝過程: 始于一個長始于一個長162bp的的P1 pac位點位點，識別和切割，識別和切割此位點的是此位點的是P1編碼的編碼的pacase，切出的，切出的pac一端進(jìn)入預(yù)制頭一端進(jìn)入預(yù)制頭部，當(dāng)其頭部充滿部，當(dāng)其頭部充滿DNA后，后，DNA再次被切。再次被切。第二次切割第二次切割是隨機(jī)的是隨機(jī)的，無特異性，無特異

27、性DNA序列。第二輪包裝則從非特異性序列。第二輪包裝則從非特異性切割出的末端開始。因此，多次包裝都是從一個切割出的末端開始。因此，多次包裝都是從一個pac位點位點開始的。開始的。P1頭部可容頭部可容110Kb。 pac位點位點: 一端含一端含4個六聚體個六聚體(5 TGATCA/G 3)，另一端，另一端則有三個，中間區(qū)域長則有三個，中間區(qū)域長90 bp，pacase切點位于靠近切點位于靠近90 bp區(qū)的中心序列。每個六聚體都有一個腺嘌呤甲基化位點區(qū)的中心序列。每個六聚體都有一個腺嘌呤甲基化位點(damGATC), pacase 只作用甲基化的只作用甲基化的pac位點位點.PacP1基因組(88

28、 kb)大腸桿菌大腸桿菌P1噬菌體基因組和包裝噬菌體基因組和包裝 2) P1載體載體-pAd10 sacB i. 優(yōu)點優(yōu)點 i) 可克隆較大插入片段可克隆較大插入片段, 可插入可插入95Kb外源外源DNA，二倍，二倍于于cos質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 ii) 較高的轉(zhuǎn)化頻率較高的轉(zhuǎn)化頻率, 12g載體載體 + 24g外源外源DNA105轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子 iii) 與與YAC載體相比，它易于產(chǎn)生多拷貝的基因組片載體相比，它易于產(chǎn)生多拷貝的基因組片段段; 易于獲得大量特定的克隆易于獲得大量特定的克隆DNA; 克隆過程更可克隆過程更可靠靠; 克隆片段易于進(jìn)行次克隆克隆片段易于進(jìn)行次克隆 ii. 結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 載體被

29、二個載體被二個loxP重組位點分隔為兩區(qū)重組位點分隔為兩區(qū) Ampr和和Kanr區(qū)區(qū) Ampr區(qū)：來自區(qū)：來自pBR322的的ori, pac位點位點(反時針包反時針包裝裝), 來自腺病毒的來自腺病毒的11Kb填充片段填充片段(插入到插入到Sca位點位點) Kanr 區(qū)：區(qū)：Kanr(Tn903)和和Tetr基因，基因，P1質(zhì)粒復(fù)制子質(zhì)粒復(fù)制子和分離系統(tǒng)，和分離系統(tǒng)，P1裂解復(fù)制子，其活性受裂解復(fù)制子，其活性受lac操縱基操縱基因啟動子控制因啟動子控制E.coli promotersacBP1 repressorbinding siteT7 T3 SalISfiINotI BamHI loxP

30、AmpAd10 pAD10sacBII(29.3 kb)XbaIScaIpacloxPtetlyt Repplasmid Rep kanr大腸桿菌大腸桿菌P1噬菌體載體噬菌體載體p Ad10 sacB sacBBamHI+ 95 kb DNA fragment pac loxPsacBKanDNA headful +Cre Recombi- lation DNAAmplifi- cationpac cleavageproteinloxPAmpAd10 pAD10sacBII(29.3 kb)XbaIScaIpacloxPlyt Repplasmid Rep kanrrP1噬菌體載體構(gòu)建噬菌體載

31、體構(gòu)建基因組文庫的示意圖基因組文庫的示意圖pAd10 sacB ScaI+BamHI 長臂長臂 + 短臂短臂 加入外源加入外源DNA片段片段 重組重組DNA分子分子 離體包裝離體包裝 感染宿主細(xì)胞感染宿主細(xì)胞 SacB基因基因:編碼一種編碼一種將蔗糖轉(zhuǎn)化為果聚糖的酶將蔗糖轉(zhuǎn)化為果聚糖的酶，當(dāng)含該基因，當(dāng)含該基因的細(xì)胞培養(yǎng)在的細(xì)胞培養(yǎng)在2%以上蔗糖培養(yǎng)基中時以上蔗糖培養(yǎng)基中時,果聚糖積累在細(xì)胞周質(zhì)空果聚糖積累在細(xì)胞周質(zhì)空間內(nèi)，導(dǎo)致大腸桿菌細(xì)胞死亡間內(nèi)，導(dǎo)致大腸桿菌細(xì)胞死亡 SacB基因被克隆到原基因被克隆到原Tetr 基因的基因的BamHI- SalI間間,在其上游加在其上游加上上E.coli基

32、因啟動子基因啟動子,克隆位點克隆位點BamHI位于這兩個位于這兩個DNA片段間片段間,外源外源DNA片段插入時可進(jìn)行片段插入時可進(jìn)行顯性篩選重組子顯性篩選重組子 為了為了使使sacB基因自發(fā)突變減小到最小限度基因自發(fā)突變減小到最小限度,sacB基因上游還有基因上游還有一個一個P1 C1阻遏物結(jié)合位點阻遏物結(jié)合位點與其啟動子重疊。與其啟動子重疊。凡是表達(dá)凡是表達(dá)P1 C1基因基因的細(xì)胞，的細(xì)胞，sacB基因表達(dá)受阻，在無蔗糖條件下，這種細(xì)胞會生長基因表達(dá)受阻，在無蔗糖條件下，這種細(xì)胞會生長得更好得更好 iii. 克隆策略克隆策略 3.3kb短臂短臂：含：含pac,loxP,無啟動子的無啟動子的s

33、acB 26kb長臂長臂: 含含P1裂解復(fù)制子，裂解復(fù)制子，Kanr，P1質(zhì)粒復(fù)制子，質(zhì)粒復(fù)制子，loxP 位點位點包裝包裝: 重組重組DNA分子先用分子先用pacase或抽提物或抽提物酶切酶切pac位點，然位點，然后用抽提物后用抽提物（含頭部和尾部）進(jìn)行包裝直至頭部充滿（含頭部和尾部）進(jìn)行包裝直至頭部充滿DNA，最后與尾部相連成有感染力的重組，最后與尾部相連成有感染力的重組P1噬菌體顆粒。噬菌體顆粒。 iV. 重組重組DNA分子形成分子形成 當(dāng)重組當(dāng)重組DNA分子進(jìn)入宿主細(xì)胞后，特異性位點重組發(fā)分子進(jìn)入宿主細(xì)胞后，特異性位點重組發(fā)生在兩個方向相同的生在兩個方向相同的loxP位點，該過程由宿主

34、細(xì)胞表達(dá)位點，該過程由宿主細(xì)胞表達(dá)的重組酶（的重組酶（Cre）催化）催化 v. 宿主菌宿主菌 E.coli NS3529菌株基因型菌株基因型recA-，lacq，mcrABC，mrr: recA-:防止插入防止插入DNA片段內(nèi)的同源重組，以免發(fā)生重排片段內(nèi)的同源重組，以免發(fā)生重排; lacq : 抑制抑制P1裂解復(fù)制子的激活裂解復(fù)制子的激活, 使使P1質(zhì)粒復(fù)制子在細(xì)質(zhì)粒復(fù)制子在細(xì)胞中以單拷貝形式存在，亦防止外源胞中以單拷貝形式存在，亦防止外源DNA分子重排分子重排; mcr和和mrr: 抑制富含抑制富含GpMeC或或ApMeC插入片段的選擇性丟插入片段的選擇性丟失失 3. M13和和fd載體載

35、體 1) 結(jié)構(gòu)特征結(jié)構(gòu)特征環(huán)狀環(huán)狀ssDNA，病毒顆粒呈絲狀，病毒顆粒呈絲狀 2) 復(fù)制過程復(fù)制過程：ss（+） RF(0-1 min) RF RF(0-20 min) RF ss(+)(20 min)DNA包裝無嚴(yán)格限制包裝無嚴(yán)格限制 3) 生活史生活史 a. 病毒粒子靠小分子衣殼蛋白和病毒粒子靠小分子衣殼蛋白和A蛋白附著于性纖毛頂端蛋白附著于性纖毛頂端（E.coli中中F因子提供）因子提供） b. 病毒病毒DNA和和A 蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，大部分衣殼蛋白則留在細(xì)蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，大部分衣殼蛋白則留在細(xì)胞膜上胞膜上 c. 病毒病毒DNA變?yōu)殡p鏈復(fù)制形式（變?yōu)殡p鏈復(fù)制形式（RF）, 衣殼蛋白可能為衣

36、殼蛋白可能為DNA復(fù)制提供附著位點復(fù)制提供附著位點 d. RF進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制，形成單鏈，同時基因與蛋白質(zhì)結(jié)合進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制，形成單鏈，同時基因與蛋白質(zhì)結(jié)合 e. ssDNA環(huán)化，并形成線狀的環(huán)化，并形成線狀的DNA基因與蛋白質(zhì)復(fù)合物基因與蛋白質(zhì)復(fù)合物 f. 病毒病毒DNA穿膜時，基因與蛋白質(zhì)被附著于膜上的衣殼蛋白穿膜時，基因與蛋白質(zhì)被附著于膜上的衣殼蛋白取代，完整病毒從細(xì)胞中釋放，釋放時不殺死細(xì)胞，但因取代，完整病毒從細(xì)胞中釋放，釋放時不殺死細(xì)胞，但因感染細(xì)胞生長緩慢，仍然可見噬菌斑感染細(xì)胞生長緩慢，仍然可見噬菌斑M(jìn)13噬菌體的生活史噬菌體的生活史 1）基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu) 基因基因、和和編碼特異性蛋

37、白質(zhì)，參與病毒顆粒的組裝編碼特異性蛋白質(zhì)，參與病毒顆粒的組裝 基因基因參與參與DNA復(fù)制復(fù)制 基因基因、和和編碼編碼M13的結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)蛋白 基因基因參與單鏈復(fù)制過程中的環(huán)化作用參與單鏈復(fù)制過程中的環(huán)化作用 基因基因是衣殼蛋白的重要組成部分是衣殼蛋白的重要組成部分 2）M13mp系列載體系列載體 a. 特點特點：在：在IR區(qū)中插入一個區(qū)中插入一個lacZ基因，然后在該基因中逐基因，然后在該基因中逐漸構(gòu)建一個多克隆位點區(qū)，漸構(gòu)建一個多克隆位點區(qū)，ds-DNA可用常規(guī)方法直接導(dǎo)入，可用常規(guī)方法直接導(dǎo)入，ss-DNA常用感染的方法常用感染的方法 噬菌斑的形成用于選擇噬菌斑的形成用于選擇DNA導(dǎo)入的細(xì)胞，在導(dǎo)入的細(xì)胞，在X-Gal平板上形成平板上形成的無色噬菌斑檢測重組子的無色噬菌斑檢測重組子 b. 優(yōu)點優(yōu)點：易于獲得：易于獲得ss-DNA用于用于DNA序列測定和基因突變，序列測定和基因突變，從細(xì)胞中易于檢測分離到從細(xì)胞中易于檢測分離到RF型的型的ds-DNA用于外源用于外源DNA重組重組M13mpM13mp系列載體的多克隆位點區(qū)系列載體的多克隆位點區(qū) 四四. COS質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 1. 結(jié)構(gòu)特點結(jié)構(gòu)特點：在普通質(zhì)粒載體中插入一個或兩個來自在普通質(zhì)粒載體中插入一個或兩個來自的的cos位點片段位點片段, 雙雙cos