離子交換層析ppt課件

1、離子交換層析離子交換層析 概述：概述： 用于生物大分子物質(zhì)如酶、蛋白質(zhì)、多肽、核酸、用于生物大分子物質(zhì)如酶、蛋白質(zhì)、多肽、核酸、寡核苷酸、病毒、噬菌體、多糖的分別和純化。寡核苷酸、病毒、噬菌體、多糖的分別和純化。 特點(diǎn)：具有開放性支持骨架特點(diǎn)：具有開放性支持骨架 具親水性具親水性 多孔性多孔性. 離子交換層析是以離子交換劑為固定相，以特定的含離子的溶液為流動(dòng)相，利用離子交換劑對需求分別的各種離子結(jié)合力的差別，而將混合物中不同離子進(jìn)展分別的層析技術(shù)。一.離子交換劑: 在惰性載體上引入(以共價(jià)結(jié)合的方式)帶有電荷的活性基團(tuán). 1.按其帶電荷的功能基團(tuán)分類按其帶電荷的功能基團(tuán)分類 (1)陽離子交換劑

2、陽離子交換劑: 載體上帶有負(fù)電荷的功能基團(tuán)載體上帶有負(fù)電荷的功能基團(tuán),能結(jié)合溶液中的正電能結(jié)合溶液中的正電荷荷. (2)陰離子交換劑陰離子交換劑: 載體上帶有正電荷的功能基團(tuán)載體上帶有正電荷的功能基團(tuán),能結(jié)合溶液中的負(fù)電能結(jié)合溶液中的負(fù)電荷荷. 2.按其載體分類按其載體分類 (1)離子交換樹脂離子交換樹脂: 主要有聚苯乙烯型樹脂和聚酚型樹脂主要有聚苯乙烯型樹脂和聚酚型樹脂. 聚苯乙烯樹脂由苯乙烯和二乙烯苯聚合而成一網(wǎng)狀聚苯乙烯樹脂由苯乙烯和二乙烯苯聚合而成一網(wǎng)狀構(gòu)造構(gòu)造. 交聯(lián)劑交聯(lián)劑:二乙烯苯二乙烯苯 二乙烯苯二乙烯苯 交聯(lián)度交聯(lián)度=100% 苯乙烯苯乙烯+二乙烯苯二乙烯苯 苯乙烯和二乙烯苯

3、混合成不同的比例就可獲得不同交苯乙烯和二乙烯苯混合成不同的比例就可獲得不同交聯(lián)度的樹脂聯(lián)度的樹脂. 二乙烯苯相對于苯乙烯的量越大二乙烯苯相對于苯乙烯的量越大,獲得的樹脂交聯(lián)度就獲得的樹脂交聯(lián)度就越大越大. 交聯(lián)度大的樹脂構(gòu)造嚴(yán)密、孔隙小交聯(lián)度大的樹脂構(gòu)造嚴(yán)密、孔隙小,大分子量的離子就大分子量的離子就不能進(jìn)入樹脂顆粒內(nèi)發(fā)生離子交換不能進(jìn)入樹脂顆粒內(nèi)發(fā)生離子交換. 交聯(lián)度的范圍從交聯(lián)度的范圍從1%16% 樹脂所含的交換基團(tuán)性質(zhì)分為兩類樹脂所含的交換基團(tuán)性質(zhì)分為兩類: a.陽離子交換樹脂陽離子交換樹脂: 能與溶液中陽離子交換能與溶液中陽離子交換,樹脂帶負(fù)電荷樹脂帶負(fù)電荷. b.陰離子交換樹脂陰離子交

4、換樹脂: 能與溶液中陰離子交換能與溶液中陰離子交換,樹脂帶正電荷樹脂帶正電荷. 根據(jù)陽離子和陰離子交換樹脂中功能基團(tuán)的酸堿解離根據(jù)陽離子和陰離子交換樹脂中功能基團(tuán)的酸堿解離程度分為強(qiáng)、弱兩種程度分為強(qiáng)、弱兩種: (a)強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂: 主要以磺酸基主要以磺酸基( R-SO3) 為功能基團(tuán)為功能基團(tuán),它的解離不受外它的解離不受外界溶液的影響界溶液的影響. 典型的交換方程式典型的交換方程式: RSO3H + NaCl RSO3Na + HCl (b)弱酸型陽離子交換樹脂弱酸型陽離子交換樹脂: 功能基團(tuán)為羧基功能基團(tuán)為羧基( -COOH)、酚羥基等、酚羥基等,它們解離程它們

5、解離程度小度小,交換性能和溶液的交換性能和溶液的pH有關(guān)有關(guān),在酸性溶液中無交換在酸性溶液中無交換作用作用. 典型交換方程式典型交換方程式: RCOOH + NaOH RCOONa + H2O ( c )強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂: 功能基團(tuán)含三甲胺的稱為強(qiáng)堿功能基團(tuán)含三甲胺的稱為強(qiáng)堿 I 型型,含二甲基乙醇胺含二甲基乙醇胺稱為強(qiáng)堿稱為強(qiáng)堿 II 型型. pH條件都不受限制條件都不受限制. 典型交換方程式典型交換方程式: RN(CH3)3 + NaOH RN(CH3)3OH +NaCl (d)弱堿型陰離子交換樹脂弱堿型陰離子交換樹脂 以伯胺基以伯胺基( -NH )、仲胺基、仲胺基

6、(NH )、叔胺基、叔胺基(N )或吡或吡啶基為功能基團(tuán)啶基為功能基團(tuán),交換才干隨溶液的交換才干隨溶液的pH條件而變化條件而變化, pH越低交換才干越強(qiáng)越低交換才干越強(qiáng). 典型交換方程式典型交換方程式: RNH3OH + HCl RNH3Cl + H2O 離子交換樹脂目的離子交換樹脂目的: 交聯(lián)度、交換容量交聯(lián)度、交換容量 a.交聯(lián)度交聯(lián)度: 交聯(lián)劑所占的百分比稱為交聯(lián)度交聯(lián)劑所占的百分比稱為交聯(lián)度.范圍從范圍從1% 16%. 交聯(lián)度小交聯(lián)度小,分子結(jié)分子結(jié) 構(gòu)較疏松構(gòu)較疏松,孔徑大孔徑大適用于適用于 分別分子分別分子 量較大的離子性物質(zhì)量較大的離子性物質(zhì).交聯(lián)度交聯(lián)度大大,孔徑孔徑 小適用分

7、別分子量小的物質(zhì)小適用分別分子量小的物質(zhì). 目數(shù)：離子交換樹脂的顆粒直徑大小目數(shù)：離子交換樹脂的顆粒直徑大小 Dowex 50 為為20-50目目 20 840m 50 297m 100 149m 代表二乙烯苯的百分含量代表二乙烯苯的百分含量 b.交換容量交換容量: 指樹脂能進(jìn)展交換的才干指樹脂能進(jìn)展交換的才干,主要決議于樹主要決議于樹 脂網(wǎng)狀脂網(wǎng)狀構(gòu)造內(nèi)所構(gòu)造內(nèi)所 含的堿性或酸性基團(tuán)的數(shù)目含的堿性或酸性基團(tuán)的數(shù)目. 以以mmol/ml 或或 mmol/g 表之表之. (2)纖維素離子交換劑纖維素離子交換劑: 在纖維素分子構(gòu)造上銜接一定的離子交換基團(tuán)在纖維素分子構(gòu)造上銜接一定的離子交換基團(tuán)就成

8、為離子交換纖維素就成為離子交換纖維素. (3)離子交換凝膠離子交換凝膠 分別大分子物質(zhì)分別大分子物質(zhì) 如如: 葡聚糖離子交換劑、瓊脂糖離子交換劑、聚丙烯葡聚糖離子交換劑、瓊脂糖離子交換劑、聚丙烯酰胺離子交換劑酰胺離子交換劑. 二二.原理原理 離子交換層析是以離子交換劑離子交換層析是以離子交換劑(具有離子交具有離子交換性能的物質(zhì)換性能的物質(zhì))作為固定相作為固定相,利用它與流動(dòng)相利用它與流動(dòng)相(洗洗脫劑脫劑)中的離子能進(jìn)展可逆交換的性質(zhì)中的離子能進(jìn)展可逆交換的性質(zhì),來分分來分分別子型化合物的一種方法別子型化合物的一種方法. 即溶液中的離子與離子交換劑上的功能基團(tuán)交即溶液中的離子與離子交換劑上的功能

9、基團(tuán)交換反響的過程換反響的過程. 離子交換過程表示： 起始 吸附 解吸 完成 x+ : 起始緩沖離子 y+ ：待分分別子 z+ ：待分分別子 帶電荷量少,親和力小的先被洗脫下來;帶電荷量多,親和力大的后被洗脫下來. 三三.操作留意點(diǎn)操作留意點(diǎn): 1.離子交換劑的選擇離子交換劑的選擇: 選擇原那么選擇原那么:根據(jù)被分別物質(zhì)的性質(zhì)選擇根據(jù)被分別物質(zhì)的性質(zhì)選擇 同同一性質(zhì)離子交換劑中選用對被分別物質(zhì)各組分一性質(zhì)離子交換劑中選用對被分別物質(zhì)各組分之間結(jié)合力差別大的型號的交換劑之間結(jié)合力差別大的型號的交換劑. 思索要素思索要素: 1.被分別物質(zhì)所帶的電荷被分別物質(zhì)所帶的電荷. 2.被分別物質(zhì)分子的大小被

10、分別物質(zhì)分子的大小. 3.被分別物質(zhì)所處的環(huán)境被分別物質(zhì)所處的環(huán)境. 4.被分別物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)被分別物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì). 5.被分別物質(zhì)的大約數(shù)量被分別物質(zhì)的大約數(shù)量. (二二)緩沖液的選擇緩沖液的選擇: 原那么原那么: 不能發(fā)生化學(xué)反響不能發(fā)生化學(xué)反響,防止使樣品發(fā)生防止使樣品發(fā)生 變變性性. 思索要素思索要素: : 1.1.被分別物質(zhì)的穩(wěn)定性被分別物質(zhì)的穩(wěn)定性. . 蛋白質(zhì)的大分子物質(zhì)在層析時(shí)不發(fā)生變性蛋白質(zhì)的大分子物質(zhì)在層析時(shí)不發(fā)生變性. . 2.2.在此緩沖溶液的在此緩沖溶液的pHpH條件下條件下, ,被分別物質(zhì)所帶的被分別物質(zhì)所帶的 電荷性質(zhì)與交換劑上的平衡離子相等電荷性質(zhì)與交換

11、劑上的平衡離子相等. . 3.3.離子交換劑的性質(zhì)離子交換劑的性質(zhì). . 防止緩沖離子與交換劑上的離子發(fā)生交換防止緩沖離子與交換劑上的離子發(fā)生交換, , 引起引起pHpH變化變化, ,降低交換容量降低交換容量. . 4.4.緩沖液必需不影響被分別物質(zhì)的測定緩沖液必需不影響被分別物質(zhì)的測定. . (三三)洗脫劑的選擇洗脫劑的選擇: 原那么原那么: 所用洗脫液比吸附物質(zhì)具有更活潑的離所用洗脫液比吸附物質(zhì)具有更活潑的離子或基團(tuán)子或基團(tuán), 改動(dòng)溶液的改動(dòng)溶液的 pH 或離子強(qiáng)度或離子強(qiáng)度 *加強(qiáng)洗脫液與離子交換劑的結(jié)和力加強(qiáng)洗脫液與離子交換劑的結(jié)和力 *降低待分別物與離子交換劑的結(jié)合力降低待分別物與離

12、子交換劑的結(jié)合力 洗脫方式洗脫方式:梯度洗脫梯度洗脫離子交換層析分別氨基酸及其測定離子交換層析分別氨基酸及其測定 ( (一一) )原理原理 氨基酸是兩性電解質(zhì)，各有一定的等電氨基酸是兩性電解質(zhì)，各有一定的等電點(diǎn)點(diǎn)pIpI。在溶液。在溶液 pH pH 小于其小于其 pI pI 值時(shí)均帶正值時(shí)均帶正電荷，反之那么帶負(fù)電荷。本實(shí)驗(yàn)所用樣品為電荷，反之那么帶負(fù)電荷。本實(shí)驗(yàn)所用樣品為天冬氨酸和賴氨酸的混合液，分別屬于酸性氨天冬氨酸和賴氨酸的混合液，分別屬于酸性氨基酸基酸 pI 2.97pI 2.97和堿性氨基酸和堿性氨基酸 pI 9.74pI 9.74。在在pH 4.2pH 4.2檸檬酸鈉緩沖液中，天冬

13、氨酸、賴氨檸檬酸鈉緩沖液中，天冬氨酸、賴氨酸各帶有負(fù)電荷和正電荷。以強(qiáng)酸型酸各帶有負(fù)電荷和正電荷。以強(qiáng)酸型 陽離子交換樹脂陽離子交換樹脂 Dowex 50Dowex 50為固定相，由于天冬氨酸在為固定相，由于天冬氨酸在 pH 4.2 pH 4.2 檸檬酸鈉緩沖液中帶負(fù)電荷不與樹脂結(jié)合，首檸檬酸鈉緩沖液中帶負(fù)電荷不與樹脂結(jié)合，首先被洗脫出來。賴氨酸帶正電荷，與樹脂嚴(yán)密結(jié)合而先被洗脫出來。賴氨酸帶正電荷，與樹脂嚴(yán)密結(jié)合而不被洗脫。隨后再經(jīng)過改動(dòng)洗脫液的不被洗脫。隨后再經(jīng)過改動(dòng)洗脫液的 pH pH 值，降低賴值，降低賴氨酸與樹脂的親和力而將賴氨酸從樹脂中洗脫出來。氨酸與樹脂的親和力而將賴氨酸從樹脂中

14、洗脫出來。 氨基酸可與茚三酮反響生成有色化合物。因此可將氨基酸可與茚三酮反響生成有色化合物。因此可將搜集到的水溶液與茚三酮試劑反響，察看其能否生成搜集到的水溶液與茚三酮試劑反響，察看其能否生成藍(lán)紫色化合物而判別洗脫情況，并可經(jīng)過比色定量藍(lán)紫色化合物而判別洗脫情況，并可經(jīng)過比色定量. . ( (二二) )試劑試劑 1.1.離子交換樹脂離子交換樹脂 Dowex 50 Dowex 50 型型 Dowex 50 Dowex 50 為強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂為強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂. . 顆粒直徑顆粒直徑 297m297m，以帶負(fù)電荷的磺酸基團(tuán)，以帶負(fù)電荷的磺酸基團(tuán) SO3H SO3H為功能基為功能基團(tuán)，它的

15、解離不受外界溶液團(tuán)，它的解離不受外界溶液 pH pH 的影響。磺酸基團(tuán)可的影響。磺酸基團(tuán)可以與帶正電荷的陽離子發(fā)生可逆的離子交換反響。以與帶正電荷的陽離子發(fā)生可逆的離子交換反響。 2.洗脫液 1 pH 4.2 檸檬酸鈉緩沖液 天冬氨酸 pI 2.97 pH 4.2 檸檬酸鈉緩沖液帶負(fù)電荷。 賴氨酸 pI 9.74 pH 4.2 檸檬酸鈉緩沖液帶正電荷。 (2)0.1 mol/L NaOH 改動(dòng)洗脫體系的改動(dòng)洗脫體系的pH值，使本與樹脂結(jié)合的賴氨值，使本與樹脂結(jié)合的賴氨 酸帶上負(fù)電荷，從而被洗脫下來。酸帶上負(fù)電荷，從而被洗脫下來。 3.樣品混合液樣品混合液 稱取天冬氨酸、賴氨酸各稱取天冬氨酸、賴氨酸各10 mg 溶于溶于10 ml pH4.2 檸檬酸鈉緩沖液中。檸檬酸鈉緩沖液中。 4.茚三酮顯色液 氨基酚與茚三酮反響顯色以檢測氨基酸洗脫情況。 (三)操作 1.層析：將Dowex50裝柱后，用0.1mol/L NaOH清洗樹脂5分鐘。再用pH4.2檸檬酸緩沖液平衡10分鐘。方法同凝膠層析法加樣8滴。當(dāng)樣品進(jìn)入樹脂后，參與pH4.2檸檬酸緩沖液洗脫加樣后立刻搜集，每管搜集3m