第六章微生物學(xué)技術(shù)(4)

1、第六章第六章 培養(yǎng)基的制備、玻璃器培養(yǎng)基的制備、玻璃器皿的無(wú)菌準(zhǔn)備及顯微鏡技術(shù)皿的無(wú)菌準(zhǔn)備及顯微鏡技術(shù)微生物的基本方法和基本技能微生物的基本方法和基本技能第一節(jié)第一節(jié) 培養(yǎng)基的制培養(yǎng)基的制備及無(wú)菌準(zhǔn)備備及無(wú)菌準(zhǔn)備 培養(yǎng)基培養(yǎng)基：是人工地將多種物質(zhì)按各：是人工地將多種物質(zhì)按各種微生物生長(zhǎng)的需要配制而成的一種種微生物生長(zhǎng)的需要配制而成的一種混合營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，以培養(yǎng)或分離各種微混合營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，以培養(yǎng)或分離各種微生物。生物。一、培養(yǎng)基的類(lèi)型一、培養(yǎng)基的類(lèi)型按成分的不同分按成分的不同分天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基按培養(yǎng)基的按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分物理狀態(tài)分半固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基固

2、體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基按培養(yǎng)基的用途分按培養(yǎng)基的用途分營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 又稱(chēng)普通培養(yǎng)基，含牛肉膏、蛋白胨和又稱(chēng)普通培養(yǎng)基，含牛肉膏、蛋白胨和NaClNaCl，其中牛肉膏提供碳源和能源；蛋白胨提供氮源；其中牛肉膏提供碳源和能源；蛋白胨提供氮源；NaClNaCl提供無(wú)機(jī)鹽。是最廣泛和最普通的提供無(wú)機(jī)鹽。是最廣泛和最普通的細(xì)菌細(xì)菌基基礎(chǔ)培養(yǎng)基。礎(chǔ)培養(yǎng)基。 幾種常見(jiàn)的培養(yǎng)基幾種常見(jiàn)的培養(yǎng)基(一）熱力滅菌法 高溫殺滅細(xì)菌焚燒-最徹底的滅菌方法燒灼-直接用火焰滅菌方法干烤-加熱160-180 2h干熱滅菌法干熱

3、滅菌法紅外線-熱效應(yīng) 與干烤類(lèi)似濕熱滅菌法加壓蒸汽滅菌法加壓蒸汽滅菌法最有效的滅菌方法最有效的滅菌方法 121.3 20-30mim121.3 20-30mim煮沸消毒法煮沸消毒法水煮水煮100 5100 5mimmim( (繁殖體繁殖體)-2h()-2h(芽胞芽胞) )流通蒸汽消毒法流通蒸汽消毒法巴氏消毒法巴氏消毒法間歇蒸汽滅菌法間歇蒸汽滅菌法水蒸汽水蒸汽100 15-30100 15-30mimmim( (繁殖體繁殖體) )反復(fù)多次流動(dòng)蒸汽間歇加熱滅菌反復(fù)多次流動(dòng)蒸汽間歇加熱滅菌較低的溫度（較低的溫度（61 3061 30mimmim/71 30s/71 30s）殺滅致病菌）殺滅致病菌濕熱

4、滅菌與干熱滅菌的比較同一溫度下，濕熱滅菌比干熱滅菌效果好同一溫度下，濕熱滅菌比干熱滅菌效果好原因原因1、濕熱中細(xì)菌菌體蛋白較易凝固2、濕熱的穿透力比干熱大3、濕熱的蒸汽有潛熱（二）輻射殺菌法 紫外線殺菌機(jī)理：殺菌機(jī)理：波長(zhǎng)240-300nm的紫外線具有殺菌作用,其中260-266nm殺菌作用最強(qiáng)干擾DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄紫外線穿透力較弱不耐熱物品的表面消毒特特 點(diǎn)：點(diǎn)：應(yīng)用范圍：應(yīng)用范圍：空氣消毒 手術(shù)室、傳染病房、細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室 殺菌機(jī)理：殺菌機(jī)理：應(yīng)用范圍：應(yīng)用范圍：電離輻射包括高速電子、X射線和 射線產(chǎn)生游離基,破壞DNA。一次性醫(yī)用塑料制品的消毒食品的消毒-不破壞其營(yíng)養(yǎng)成分 |微波微波-電磁波

5、|波長(zhǎng)為1mm到1m波段的無(wú)線電波。它具有很強(qiáng)的穿透云霧的能力，并可用于全天候遙感。或者說(shuō)是波長(zhǎng)低于10cm,但高于紅外線波長(zhǎng)的射頻電磁波。|超聲波超聲波-可裂解細(xì)菌，主可裂解細(xì)菌，主要用于粉碎細(xì)胞、提取抗要用于粉碎細(xì)胞、提取抗原等。原等。（三）濾過(guò)除菌法 用物理阻留的方法用物理阻留的方法 將液體或空氣中的細(xì)菌除去,以達(dá)到除菌目的濾菌器濾菌器含有微細(xì)小孔0.22m,只允許液體或氣體及 孔徑0.22m的顆粒通過(guò)，細(xì)菌不能濾過(guò) 適用范圍適用范圍血清、毒素、抗生素以及空氣等的除菌 低溫與干燥在低溫狀態(tài)下真空抽去水分用途：用途：保存菌種冷凍真空干燥法：冷凍真空干燥法：培養(yǎng)物：培養(yǎng)物：在人為規(guī)定的條件下

6、培養(yǎng)、繁殖在人為規(guī)定的條件下培養(yǎng)、繁殖得到的微生物群體。得到的微生物群體。純培養(yǎng)物：純培養(yǎng)物：只有一種微生物的培養(yǎng)物。只有一種微生物的培養(yǎng)物。無(wú)菌技術(shù)：無(wú)菌技術(shù)：在分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)純培養(yǎng)物在分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)純培養(yǎng)物時(shí)防止其被其他微生物污染的技術(shù)。時(shí)防止其被其他微生物污染的技術(shù)。一、分離和純培養(yǎng)一、分離和純培養(yǎng)1 1、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)稀釋倒平板法稀釋倒平板法涂布平板法涂布平板法平板劃線分離法平板劃線分離法稀釋搖管法稀釋搖管法微生物的分離微生物的分離稀釋搖管法稀釋搖管法 對(duì)厭氧微生物而言的，是稀釋對(duì)厭氧微生物而言的，是稀釋倒平板法的一種變通方式。倒平板法的一種變通方式

7、。 將一系列無(wú)菌瓊脂培養(yǎng)基的試管將一系列無(wú)菌瓊脂培養(yǎng)基的試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在5050左右，將待分離的材料用這些左右，將待分離的材料用這些試管進(jìn)行稀釋?zhuān)嚬苎杆贀u動(dòng)均勻，試管進(jìn)行稀釋?zhuān)嚬苎杆贀u動(dòng)均勻，待冷凝后倒液體石蠟。待冷凝后倒液體石蠟。2 2、用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)、用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng) 用于分離一些細(xì)胞大的用于分離一些細(xì)胞大的細(xì)菌、許多原生動(dòng)物和藻類(lèi)。細(xì)菌、許多原生動(dòng)物和藻類(lèi)。通常采用稀釋法進(jìn)行分離通常采用稀釋法進(jìn)行分離。（在固體培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)（在固體培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)的微生物）的微生物）3 3、單細(xì)胞或單孢子分離法、單細(xì)胞或單孢子分離法 達(dá)到菌

8、株純或細(xì)胞純達(dá)到菌株純或細(xì)胞純水平。采用顯微分離法從水平。采用顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)混雜群體中直接分離單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)。以獲得純培養(yǎng)。4 4、選擇培養(yǎng)分離、選擇培養(yǎng)分離利用選擇培養(yǎng)基利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行直接分離進(jìn)行直接分離富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)將土壤樣品接將土壤樣品接種到含有對(duì)羥種到含有對(duì)羥基苯甲酸為唯基苯甲酸為唯一碳源的液體一碳源的液體富集培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)基中涂布到含有該涂布到含有該物質(zhì)的培養(yǎng)基物質(zhì)的培養(yǎng)基平板表面平板表面培養(yǎng)培養(yǎng)培養(yǎng)培養(yǎng)培養(yǎng)培養(yǎng)將單菌落接種到液體將單菌落接種到液體培養(yǎng)基并進(jìn)行培養(yǎng)培養(yǎng)基并進(jìn)行培養(yǎng)在沒(méi)有該底物的培養(yǎng)在沒(méi)有該底物的

9、培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)基中不能生長(zhǎng)在含有該底物的在含有該底物的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)病毒的分離病毒的分離病毒純化前的預(yù)備工作病毒純化前的預(yù)備工作（1）繁殖病毒：繁殖病毒：因自然感染的生物體的因自然感染的生物體的器官組織或細(xì)胞的量往往難以滿足提純器官組織或細(xì)胞的量往往難以滿足提純的要求，需要用人工接種寄主來(lái)大量繁的要求，需要用人工接種寄主來(lái)大量繁殖病毒。殖病毒。（2）利用生物學(xué)方法純化病毒：因自然）利用生物學(xué)方法純化病毒：因自然感染易引起混合浸染，植物病毒能在很感染易引起混合浸染，植物病毒能在很多植物葉片上產(chǎn)生一個(gè)個(gè)孤立的枯斑，多植物葉片上產(chǎn)生一個(gè)個(gè)孤立的枯斑，動(dòng)物病毒能在單層細(xì)胞上產(chǎn)生病理性的動(dòng)物

10、病毒能在單層細(xì)胞上產(chǎn)生病理性的蝕斑，噬菌體能在鋪滿細(xì)菌寄主細(xì)胞的蝕斑，噬菌體能在鋪滿細(xì)菌寄主細(xì)胞的平面上產(chǎn)生透明的噬菌斑?？莅?、蝕斑平面上產(chǎn)生透明的噬菌斑。枯斑、蝕斑和噬菌斑都認(rèn)為是單個(gè)毒?；騿蝹€(gè)侵染和噬菌斑都認(rèn)為是單個(gè)毒?；騿蝹€(gè)侵染單位感染所致。單位感染所致。病毒純化的基本原理：病毒純化的基本原理：（1）病毒的釋放和萃?。阂虿《绢w粒主）病毒的釋放和萃?。阂虿《绢w粒主要存在于寄主組織細(xì)胞內(nèi)，首先應(yīng)破要存在于寄主組織細(xì)胞內(nèi)，首先應(yīng)破碎細(xì)胞，但因考慮到破碎方法及破碎碎細(xì)胞，但因考慮到破碎方法及破碎后細(xì)胞液對(duì)病毒活性的影響。后細(xì)胞液對(duì)病毒活性的影響。（2）病毒萃取液的分級(jí)純化：采用方法）病毒萃取液的

11、分級(jí)純化：采用方法把病毒與其他細(xì)胞器或碎片分開(kāi)?；虬巡《九c其他細(xì)胞器或碎片分開(kāi)?；虿捎秒x心、色譜和電泳等方法。采用離心、色譜和電泳等方法。（3）病毒的檢測(cè)：侵染力的測(cè)定。）病毒的檢測(cè)：侵染力的測(cè)定。n厭氧培養(yǎng)：厭氧培養(yǎng)：除了最簡(jiǎn)便的深層液體培養(yǎng)除了最簡(jiǎn)便的深層液體培養(yǎng)以外，可以采用物理、化學(xué)或生物學(xué)的以外，可以采用物理、化學(xué)或生物學(xué)的方法來(lái)排除培養(yǎng)容器中的空氣或空氣中方法來(lái)排除培養(yǎng)容器中的空氣或空氣中的氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。的氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。 對(duì)于嚴(yán)格厭氧的微生物，要用化學(xué)和對(duì)于嚴(yán)格厭氧的微生物，要用化學(xué)和物理并用的方法。厭氧培養(yǎng)罐，以某種物理并用的方法。厭氧培養(yǎng)罐，以某種氣體取代培養(yǎng)容器中

12、空氣，并添加還原氣體取代培養(yǎng)容器中空氣，并添加還原劑，如產(chǎn)氣袋法和換氣法。在進(jìn)行厭氧劑，如產(chǎn)氣袋法和換氣法。在進(jìn)行厭氧培養(yǎng)時(shí)，可以用指示劑檢查系統(tǒng)中的還培養(yǎng)時(shí)，可以用指示劑檢查系統(tǒng)中的還原條件，一般實(shí)驗(yàn)室中常用的如葡萄糖原條件，一般實(shí)驗(yàn)室中常用的如葡萄糖美蘭指示劑。美蘭指示劑。病毒的培養(yǎng)：病毒的培養(yǎng)： 培養(yǎng)物中只含有二種微培養(yǎng)物中只含有二種微生物，而且是有意識(shí)地保生物，而且是有意識(shí)地保持二者之間的特定關(guān)系的持二者之間的特定關(guān)系的培養(yǎng)物稱(chēng)為培養(yǎng)物稱(chēng)為二元培養(yǎng)物二元培養(yǎng)物。一般采用原代細(xì)胞、二倍一般采用原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞或連續(xù)細(xì)胞系。體細(xì)胞或連續(xù)細(xì)胞系。|區(qū)分和識(shí)別各大類(lèi)微生物通常包括菌落形態(tài)區(qū)

13、分和識(shí)別各大類(lèi)微生物通常包括菌落形態(tài)（群體形態(tài)）和細(xì)胞形態(tài)（個(gè)體形態(tài)兩方面的（群體形態(tài)）和細(xì)胞形態(tài)（個(gè)體形態(tài)兩方面的觀察。觀察。|菌落形態(tài)：菌落形態(tài)： 菌落表面濕潤(rùn)細(xì)菌菌落表面濕潤(rùn)細(xì)菌薄而小，酵母菌薄而小，酵母菌厚厚而大。而大。 菌落表面干燥：放線菌菌落表面干燥：放線菌密而小，霉菌密而小，霉菌松而大。松而大。|細(xì)胞形態(tài)：細(xì)胞形態(tài)： 細(xì)菌細(xì)菌小而分散小而分散 酵母菌酵母菌大而分散大而分散 放線菌放線菌絲狀細(xì)絲狀細(xì) 霉菌霉菌絲狀粗絲狀粗第一章第一章 顯微鏡的構(gòu)造、性能顯微鏡的構(gòu)造、性能 和使用方法和使用方法 微生物的顯微技及培養(yǎng)微生物的顯微技及培養(yǎng)|機(jī)械裝置機(jī)械裝置：鏡座、鏡臂、鏡筒、轉(zhuǎn)換器、載物

14、臺(tái)、調(diào)焦裝置|光學(xué)系統(tǒng)：光學(xué)系統(tǒng)：物鏡、目鏡、聚光器、光源、濾光片|油鏡物鏡的工作距離：油鏡物鏡的工作距離：油鏡約是0.15mm；10倍物鏡約是7.0mm；40倍物鏡約是0.6mm。二、油鏡物鏡的基本原理二、油鏡物鏡的基本原理物鏡分低倍物鏡（10）、高倍物鏡（40）工作距離分別為7.0mm、0.6mm。油鏡的焦距和工作距離最短(0.15mm)，光圈開(kāi)得最大。數(shù)值孔徑（NA）=介質(zhì)折射率(n)鏡口角的半數(shù)的正弦(sin)能辨別兩點(diǎn)之間最小距離=（光波波長(zhǎng)）/2NA|光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)|標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)顯微技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)顯微技術(shù)|暗視野顯微技術(shù)暗視野顯微技術(shù)|相差顯微技術(shù)相差顯微技術(shù)免疫熒光顯微技術(shù)免

15、疫熒光顯微技術(shù)聚焦掃描顯微技術(shù)聚焦掃描顯微技術(shù)電子顯微技術(shù)電子顯微技術(shù)透射電子顯微技術(shù)透射電子顯微技術(shù) 掃描電子顯微技術(shù)掃描電子顯微技術(shù)1、光學(xué)顯微技術(shù)、光學(xué)顯微技術(shù)是使用玻璃透鏡把一束光聚焦到待研究的標(biāo)本上，透過(guò)標(biāo)本的光線再被其他透鏡聚焦，產(chǎn)生放大的映像。標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)顯微技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)顯微技術(shù)當(dāng)今最普遍使用的顯微鏡是復(fù)式顯微鏡。主要分為二個(gè)部分：光學(xué)放大系統(tǒng)、支架系統(tǒng)。樣品需做成石蠟切片并染色。光學(xué)顯微鏡的最大分辨率約為0.2m。石蠟切片制作的具體過(guò)程石蠟切片制作的具體過(guò)程取材，固定取材，固定 脫水脫水 透明透明 包埋包埋 切片切片 貼片貼片 脫蠟脫蠟 染色染色 分色分色 脫水脫水 (95%乙醇配

16、的伊紅染色乙醇配的伊紅染色) 透明透明 封片。封片。 染色染色細(xì)胞組分須經(jīng)染色，才能分辨開(kāi)。許多化學(xué)染色劑可與生物分子結(jié)合：如伊紅及亞甲基藍(lán)可與蛋白質(zhì)結(jié)合，堿性品紅可與DNA結(jié)合。 細(xì)胞化學(xué)染色法細(xì)胞化學(xué)染色法 利用酶促反應(yīng)使無(wú)色的前體產(chǎn)生有色的沉淀，然后利用光學(xué)顯微鏡觀察到有關(guān)酶的位置。如過(guò)氧化酶體可以用過(guò)氧化氫酶的細(xì)胞化學(xué)染色觀察。2、暗視野顯微技術(shù)、暗視野顯微技術(shù)來(lái)自聚光器的光線有一角度，因此沒(méi)有入射光直接進(jìn)入接物鏡，只有經(jīng)標(biāo)本折射或衍射（散射）的光線才可進(jìn)入接物鏡。此種顯微鏡的分辨率不高，但可使一些入射光折射比率大而個(gè)體小的研究對(duì)象顯現(xiàn)為明亮的顆粒，如用于觀察某些細(xì)菌。3、相差顯微術(shù)、

17、相差顯微術(shù)是適合于改變光波相位變化光波相位變化的光學(xué)顯微鏡術(shù)，它產(chǎn)生一種映像，標(biāo)本區(qū)域的高度因折射率不同而異。利用一相板相板置于觀測(cè)者與標(biāo)本之間，以提高鮮明對(duì)比度。入射光穿過(guò)一個(gè)環(huán)狀光圈，把光環(huán)聚焦到標(biāo)本上。因標(biāo)本對(duì)來(lái)光的折射，即轉(zhuǎn)變了相位，這經(jīng)轉(zhuǎn)變了相位的來(lái)光穿過(guò)相板的透明區(qū)。經(jīng)折射和衍射的光與未經(jīng)折射光的波長(zhǎng)融合在一起，產(chǎn)生映像。倒置顯微鏡倒置顯微鏡倒置顯微鏡invertedmicroscope組成和普通顯微鏡一樣，只不過(guò)物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺(tái)之下，后者在載物臺(tái)之上，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，具有相差物鏡。 4、免疫熒光顯微技術(shù)、免疫熒光顯微技術(shù)將熒光化合物（可吸收一定的波長(zhǎng)激發(fā)光，

18、又可發(fā)射出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光）與特異的抗體結(jié)合，將標(biāo)記的抗體加到標(biāo)本上，使此抗體與亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的相應(yīng)抗原結(jié)合，同時(shí)將未結(jié)合的抗體除掉，標(biāo)本在激發(fā)光波長(zhǎng)被照亮，從而可觀察到結(jié)合抗體的部位。最常用的化合物是羅丹明發(fā)紅光。將熒光標(biāo)記的抗體加到組織切片上，或可透光的細(xì)胞上。還可應(yīng)用于活細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)運(yùn)動(dòng)隨著時(shí)間進(jìn)行觀察。5、聚焦掃描顯微術(shù)、聚焦掃描顯微術(shù)是標(biāo)準(zhǔn)掃描顯微術(shù)的改進(jìn)型。它使用的是只在激發(fā)波長(zhǎng)下的激光束，對(duì)標(biāo)本各個(gè)部分進(jìn)行掃描，并在不同深度上透過(guò)標(biāo)本得到一系列的映像。經(jīng)計(jì)算機(jī)處理，可提供出一個(gè)完整的三維圖形。激光聚焦掃描顯微鏡基本原理激光聚焦掃描顯微鏡基本原理6、電子顯微技術(shù)、電子顯微技

19、術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)是使用透鏡聚焦成為光束；而電子顯微技術(shù)是使用電磁透鏡將電子聚焦為一束。因電子可被空氣中的原子所吸收，要求標(biāo)本放置在真空中。電子顯微鏡的分辨率可達(dá)0.10nm透射電子顯微技術(shù)透射電子顯微技術(shù)電子束直接穿透標(biāo)本，透射電子經(jīng)電磁透鏡聚焦成像，或照射到觀測(cè)屏幕上，或照射到像底上。標(biāo)本的切片比標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)顯微鏡的要求更薄（厚度：50100nm）。標(biāo)本常使用重金屬如金或鋨對(duì)其進(jìn)行染色。常用四氧化鋨對(duì)某些細(xì)胞成分進(jìn)行染色，電子致密的金屬散射入射的電子，從而產(chǎn)生標(biāo)本的映像。用于研究蛋白質(zhì)，病毒及細(xì)胞器的形態(tài)用于研究蛋白質(zhì)，病毒及細(xì)胞器的形態(tài)信息。信息。電鏡超薄切片的具體制作過(guò)程電鏡超薄切片的具體制作

20、過(guò)程取材固定（戊二醛）沖洗（磷酸緩沖液）鋨酸染色沖洗（磷酸緩沖液）利用各級(jí)酒精脫水環(huán)氧丙烷包埋切片電鏡下觀察掃描電子顯微術(shù)掃描電子顯微術(shù)用重金屬如鉑覆蓋在標(biāo)本（不用做成切片）的表面，然后用一電子束在標(biāo)本上進(jìn)行掃描，標(biāo)本中激發(fā)的分子可釋放出次級(jí)電子，把這些電子聚焦即產(chǎn)生標(biāo)本的三維構(gòu)像。標(biāo)本中任何一點(diǎn)所產(chǎn)生的次級(jí)電子的數(shù)目，依賴(lài)于電子束與標(biāo)本面的角度。掃描電鏡的分辨率為10nm，較透射電鏡細(xì)約100倍。第二節(jié)第二節(jié) 微生物的染色和形態(tài)觀察微生物的染色和形態(tài)觀察|細(xì)菌細(xì)胞通常帶細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷負(fù)電荷，常用，常用堿堿性染料性染料對(duì)其進(jìn)行染色。常用的堿對(duì)其進(jìn)行染色。常用的堿性染料有美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性

21、復(fù)性染料有美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅、番紅（沙黃）等。紅、番紅（沙黃）等。|分為分為單染色法單染色法和和復(fù)染色法復(fù)染色法。（一）、革蘭氏染色法（一）、革蘭氏染色法因細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同呈現(xiàn)因細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同呈現(xiàn)對(duì)革蘭氏染色的不同反應(yīng)。對(duì)革蘭氏染色的不同反應(yīng)。|涂片涂片 干燥干燥 固定固定 草草酸胺結(jié)晶紫染色（酸胺結(jié)晶紫染色（1 12 2分鐘）分鐘） 水洗水洗 碘液媒染（碘液媒染（1 1分鐘）分鐘） 95%95%乙醇脫色（乙醇脫色（3030秒）秒） 蕃紅蕃紅復(fù)染（復(fù)染（1 12 2分鐘）分鐘） 沖洗沖洗 干燥干燥 鏡檢鏡檢革蘭氏染色操作示意圖革蘭氏染色操作示意圖3. 結(jié)晶紫染結(jié)晶紫染液第一次

22、染液第一次染色色 1-2min1.涂片涂片干燥干燥2.固定固定4.水洗水洗5.媒染媒染碘碘-碘化鉀碘化鉀溶液浸濕溶液浸濕1分鐘分鐘6. 脫色脫色進(jìn)行顏色進(jìn)行顏色洗脫洗脫30秒秒7.復(fù)復(fù)染染第第二次二次染色染色1-2分鐘分鐘細(xì)菌呈現(xiàn)第一次染色的細(xì)菌呈現(xiàn)第一次染色的效果效果，； 呈現(xiàn)第二次染色的效果呈現(xiàn)第二次染色的效果；稱(chēng)（二）、細(xì)菌芽孢染色法（二）、細(xì)菌芽孢染色法 利用細(xì)菌的芽孢和菌體對(duì)染料的利用細(xì)菌的芽孢和菌體對(duì)染料的親合力不同的原理進(jìn)行染色。同時(shí)芽親合力不同的原理進(jìn)行染色。同時(shí)芽孢壁厚、透性低，著色、脫色均較困難。孢壁厚、透性低，著色、脫色均較困難。細(xì)菌芽孢染色的過(guò)程：細(xì)菌芽孢染色的過(guò)程：涂

23、片涂片孔雀綠染色孔雀綠染色加熱到剛冒蒸氣加熱到剛冒蒸氣番紅復(fù)染番紅復(fù)染鏡檢鏡檢芽孢呈綠色；菌體呈紅色芽孢呈綠色；菌體呈紅色制菌懸液制菌懸液涂片涂片加苯酚品紅溶液加苯酚品紅溶液在沸水浴中加熱在沸水浴中加熱方法方法1方法方法2 水洗水洗 水洗水洗95%乙醇沖洗乙醇沖洗加黑色素溶液加黑色素溶液自然干燥自然干燥鏡檢鏡檢芽孢呈紅色；芽孢呈紅色；菌體呈白色菌體呈白色水洗水洗（三）莢膜染色法（三）莢膜染色法莢膜是多糖類(lèi)，不易染色。莢膜是多糖類(lèi)，不易染色。故用襯托染色法，將菌體和背景著色，故用襯托染色法，將菌體和背景著色，把不著色且透明的莢膜襯托出來(lái)。把不著色且透明的莢膜襯托出來(lái)。莢膜染色法的過(guò)程：莢膜染色法

24、的過(guò)程：鏡檢鏡檢背景黑色背景黑色莢膜無(wú)色莢膜無(wú)色細(xì)菌紅色細(xì)菌紅色制菌懸液制菌懸液加番加番紅液紅液甲醇固定甲醇固定涂片涂片加黑色素溶液加黑色素溶液（四）鞭毛染色法（四）鞭毛染色法借媒染劑和染色劑的沉淀作用，借媒染劑和染色劑的沉淀作用，加粗鞭毛的直徑，同時(shí)使鞭毛著色。加粗鞭毛的直徑，同時(shí)使鞭毛著色。鞭毛染色法的過(guò)程：鞭毛染色法的過(guò)程：鏡檢鏡檢菌體為深褐色菌體為深褐色鞭毛為褐色鞭毛為褐色染色染色A染液（含單寧酸）染液（含單寧酸）B染液（含染液（含AgNO3）涂片涂片自然干燥自然干燥新培養(yǎng)的菌種新培養(yǎng)的菌種|菌種活化的情況菌種活化的情況|菌齡要合適菌齡要合適|新鮮的染色液新鮮的染色液|載玻片要求干凈無(wú)

25、油污載玻片要求干凈無(wú)油污（五）富爾根氏核染色法（五）富爾根氏核染色法 富爾根氏核染色法是根據(jù)席夫氏富爾根氏核染色法是根據(jù)席夫氏試劑（試劑（ SchiffSchiff）進(jìn)行的反應(yīng)建立的。進(jìn)行的反應(yīng)建立的。 席夫氏試劑含有堿性復(fù)紅和亞硫酸，席夫氏試劑含有堿性復(fù)紅和亞硫酸，其中堿性復(fù)紅與亞硫酸結(jié)合后，失去醌其中堿性復(fù)紅與亞硫酸結(jié)合后，失去醌氏結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o(wú)色，當(dāng)氏結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o(wú)色，當(dāng)DNADNA經(jīng)酸作用后生經(jīng)酸作用后生成的醛化合物與席夫氏試劑結(jié)合后使醌成的醛化合物與席夫氏試劑結(jié)合后使醌氏結(jié)構(gòu)恢復(fù)，合成一種紫紅色的堿性氏結(jié)構(gòu)恢復(fù)，合成一種紫紅色的堿性復(fù)紅衍生物。這個(gè)染色法對(duì)復(fù)紅衍生物。這個(gè)染色法對(duì)DNADNA

26、有特異性。有特異性。富爾根氏核染色法主要分兩步：富爾根氏核染色法主要分兩步：A A、將細(xì)菌用、將細(xì)菌用HClHCl溫的水解，溫的水解，使使DNADNA中的嘌呤與戊糖分開(kāi)，中的嘌呤與戊糖分開(kāi)，放出戊糖的醛基；放出戊糖的醛基；B B、放出的戊糖醛基與席夫氏、放出的戊糖醛基與席夫氏試劑作用后呈紫紅色。試劑作用后呈紫紅色。富爾根氏核染色法的過(guò)程：富爾根氏核染色法的過(guò)程：涂片涂片先用鋨酸蒸氣固定，再用先用鋨酸蒸氣固定，再用Schandium固定液固定固定液固定加加HCl水解水解加加Schiff試劑試劑用亞硫酸水溶液漂洗用亞硫酸水溶液漂洗鏡檢鏡檢水洗水洗水洗水洗（六）、細(xì)菌細(xì)胞壁的染色（六）、細(xì)菌細(xì)胞壁的染色法和法和 細(xì)胞質(zhì)膜的觀察細(xì)胞質(zhì)膜的觀察 細(xì)菌細(xì)胞壁與染料的結(jié)合能力差。細(xì)菌細(xì)胞壁與染料的結(jié)合能力差。須設(shè)法使細(xì)胞壁著色；須設(shè)法使細(xì)胞壁著色；細(xì)胞質(zhì)不易著色，細(xì)胞質(zhì)不易著色， 常用的方法有單寧酸法和磷鉬酸法。常用的方法有單寧酸法和磷鉬酸法。 單寧酸法和磷鉬酸起媒染作用，單寧酸法和磷鉬酸起媒染作用，使細(xì)胞壁形成可著色的復(fù)合物，使細(xì)胞壁形成可著色的復(fù)合物，經(jīng)結(jié)晶紫或甲基綠染色后，可觀察到經(jīng)結(jié)晶紫或甲基綠染色后，可觀察到細(xì)胞壁。細(xì)胞壁。|可用石炭