瘧疾實驗技術

1、瘧疾檢測技術及進展瘧疾檢測技術及進展瘧疾瘧疾：是由按蚊叮咬傳播瘧原蟲而引起的寄生蟲病，以寒戰(zhàn)、高熱、大汗為特點。 病 原 瘧原蟲是瘧疾的病原體。 人體瘧原蟲有4種： 惡性瘧原蟲 （臨床表現(xiàn)重） 間日瘧原蟲 （可復發(fā)） 三日瘧原蟲 （可復發(fā)） 卵形瘧原蟲 人體寄生的四種瘧原蟲人體寄生的四種瘧原蟲生活史 兩階段 有性生殖（蚊體內） 無性生殖（人體內） 兩宿主 中間宿主（人） 終宿主（蚊）在蚊體內的發(fā)育階段 肝細胞內的發(fā)育間日瘧、卵型瘧四種瘧疾均可紅細胞內的發(fā)育瘧原蟲完整生活史瘧原蟲完整生活史 瘧原蟲的生活史應明確以下幾點瘧原蟲的生活史應明確以下幾點:(1) 當瘧原蟲在人體肝細胞和紅細胞內增殖時，臨

2、床上無明顯表現(xiàn)。(2) RBC內期：周期性發(fā)作有關。(3) 周期性發(fā)作：一部分裂殖子再侵入紅細胞內增殖后再釋放入血。(4) 紅細胞破壞，大量裂殖子、瘧色素及代謝產物釋放入血，引起瘧疾發(fā)作。(5) 肝細胞內期：復發(fā)、潛伏期有關。(6) 遲發(fā)型子孢子在肝細胞內的發(fā)育是復發(fā)的根源。(7) 間日瘧和卵形瘧有復發(fā)，惡性瘧和三日瘧無復發(fā)。(8) 裂殖子經3-6代增殖后發(fā)育成雌雄配子體時，具有傳染性。(9) 人為中間宿主，蚊為終宿主。瘧疾檢測技術瘧疾檢測技術瘧疾常用診斷方法u病原學診斷u免疫學診斷u分子生物學診斷一、病原學診斷血膜鏡檢法（金標準）u血片的制作u血膜染色u血片鏡檢 血片的制作（一）所需設備 1

3、載玻片：玻片使用前應清洗。 新玻片應先浸入有液態(tài)洗滌劑的清水中1020 分鐘，然后用干凈棉巾逐個擦拭，再用清水沖洗干凈，晾干，最后用干凈柔軟的棉巾將玻片擦亮。也可以用95%乙醇浸泡。 2采血針：使用一次性采血針。 3玻片盒：為防止污染和蒼蠅吸食血膜，新制作的血膜應放在玻片盒中，厚血膜放置時要保持水平，直到充分干燥。 475 乙醇棉球：用于采血前后的消毒。 5記號筆：用于玻片上書寫號碼。（二）采血部位及取血方法 采血部位：末梢血（耳垂、指端） 也可使用血常規(guī)抗凝靜脈血，但制作的血片厚血膜容易脫落。采血時間：間日瘧發(fā)作后8-10小時， 惡性瘧發(fā)作2小時。 （三）涂制血膜 取玻片2 張，1 張作載片

4、，1 張作推片（具有光滑邊緣）。 薄血膜薄血膜厚血膜厚血膜 厚血膜：用右手拇指和食指夾持推片側緣中部，用推片的左下角刮取血液45ul （相當于火柴頭大?。?，使血滴與載玻片接觸，由里向外一個方向旋轉24圈，涂成直徑0.81厘米大小圓形厚血膜（厚度以1 個油鏡視野內可見到510 個白細胞為宜） 薄血膜：用推片一端中部刮取血液11.5ul，將血置于載玻片離厚血膜適當遠的地方，推片下緣平抵載玻片的中線，當血液在載玻片與推片之間向兩側擴展至約2cm 寬時，使兩玻片保持2535角，從右向左迅速向前推成舌狀薄血膜。l推片技巧：將推片勻速向前，勿停頓。l涂片的厚薄取決于速度和角度： 快、大（厚） 慢、小（?。?/p>

5、l一張滿意的血涂片應厚薄均勻，頭、體、尾鮮明 尾 體 頭瘧疾臨床 病人血膜（四）厚、薄血膜的位置標簽厚血膜血量適宜，不宜過多或過少。薄血膜平整,無皺折和空泡，紅細胞單層排列。 血片放置待干時不可傾斜，否則厚血膜中血細胞沉在一邊，可使厚薄不勻。 制成的血膜須完全干燥后，方可進行固定及染色。否則薄血膜中的紅細胞邊緣皺縮，厚血膜容易在染色時脫落，而?，F(xiàn)網狀的背景； 血膜放置時間，夏天不宜超過48 小時，冬天不宜超過72 小時，否則厚血膜會自然固定而不能溶血，影響鏡檢。（五）制作血片的注意事項血膜的染色 （一）染色液的種類及配制 吉氏染液 保存時間長，染色時間長 瑞氏染液 保存時間短，染色時間短 28

6、吉氏（Giemsas）染液配制 吉氏粉 5.0 g 甲醇 250ml 甘油 250ml 將吉氏粉置于研缽中，加入少量甘油充分研磨，然后邊加邊磨，至甘油加完為止，倒入500ml有塞玻璃瓶中。在研缽中加入少量甲醇，洗掉剩余部分，倒入瓶內，再次加甲醇，洗后再倒入瓶中，至甲醇洗清研缽中甘油為止。塞緊瓶塞，充分搖勻，置室溫內，每天用力搖動溶液5min，3d后即可使用。 也可在帶有緊口瓶塞的硬質玻璃瓶中放入約50個玻璃珠（直徑3 5mm），用玻璃漏斗把甘油灌入瓶中，再把吉氏粉放入漏斗中，用甲醇緩慢地把所有染料粉沖入瓶內，塞緊瓶塞，置于室溫內，每天用力搖動5min，3d后即可使用。 瑞氏（Wrights）染

7、液 瑞氏染劑粉 1.0 g 甲醇 500ml 甘油 15ml 將瑞氏染劑粉置于研缽內，加入甘油充分研磨后，倒入有塞玻璃瓶中，再用甲醇洗出研缽中的甘油溶液，倒入瓶中，搖勻后，置室溫下，每天搖動5min，3d后即可使用。（二）染色用水 為使血膜著色較好，應用pH7 . 0 7 . 2 水效果最佳。常用的是中性的蒸餾水或經煮沸過濾的冷開水。最好配制緩沖液用于染液的稀釋和染色后的沖洗。常用磷酸鹽緩沖液。 PBS緩沖液的配制（0.01 mol/l PBS pH7.2） KH2PO4 0.38g Na2HPO4 1.02g (或Na2HPO4 12H2O 2.58g) NaCl 8.00g 蒸餾水加至 1

8、000ml（三）染色方法 可用吉氏或瑞氏染色法染色。 國家推薦使用吉氏染色法。 根據(jù)臨床工作的實際情況，為了方便操作，推薦使用瑞氏-吉姆薩染液（臨床用于血常規(guī)推片染色）。 吉氏染色（主要成分：水） 吉氏染液要現(xiàn)用現(xiàn)配，配制好的染液保存 不超過24小時。染液工作濃度為 2（ 2ml吉氏原液+98ml蒸餾水緩沖液混勻）。 先用甲醇固定薄血膜。 厚血膜如果放置時間超過48小時，需要用 蒸餾水或清水溶血。 取吉氏染液工作液滴在厚、薄血膜上，2030min后，水洗、晾干。 瑞氏染色（主要成分：甲醇） 厚血膜需要用蒸餾水或清水溶血。（用蠟筆在厚、薄血膜間劃一界限） 在薄血膜上滴加67滴瑞氏染液，輕輕搖動玻

9、片，使染液在血膜上展開30秒鐘，加蒸餾水或緩沖液1012滴，搖動玻片，使染液與水充分混合，并將染液引到厚血膜上，使厚薄血膜同時染色5分鐘，然后用蒸餾水或緩沖液將血膜沖洗干凈，晾干后檢查。推薦染色方法 由于瑞氏-吉姆薩染液中含有甲醇，因此在操作時，與瑞氏染液染色方法相同。 應該在厚血膜完全干燥后，用蒸餾水或清水溶血，然后再進行染色。 染色方法可參照產品說明書。四、影響血膜染色質量的因素 血片染色好壞，除與玻片的清潔程度、血膜制作的質量和染色技術等有關外，還與下列因素有關： 染劑和溶劑的質量（分析純、容器無水、試染） 染液的新舊 （染色前12周配制，越久越好） 染液的稀釋濃度 濃 著色快，各種細胞

10、著色深，薛氏點、 茂氏點等粗大顯著 。 稀 染液濃度低，著色慢，但各種細胞內部結構著色均勻、清晰，但薛氏點、茂氏點不夠清楚。 稀釋和沖洗用水（pH7.07.2 ）太藍水pH值偏堿，用pH較低的緩沖水沖洗；太紅水pH值偏酸，用pH較高的緩沖液沖洗；太深建議延長沖洗時間。 偏 酸偏 堿標 準 染色時間及溫度 染色時間長，效果好 ；溫度高，著色快 。 沖洗方法 染色后不要直接將染液倒掉，應沿玻片及染色缸邊緣加水使染液表層溢出，并輕輕沖洗，以免染液色素顆粒沾污血膜。 血涂片檢查 在染色后的血膜上加一滴香柏油，用光學顯微鏡油鏡檢查。以檢查厚血膜為主，薄血膜主要用于蟲種鑒別。 間日瘧鏡下可見：環(huán)狀體、滋養(yǎng)

11、體、裂殖 體、配子體 惡性瘧鏡下可見：環(huán)狀體、配子體厚、薄血膜鏡檢示意圖123123XXXX 著色較好的血膜，紅細胞呈淡紅色，嗜酸性粒細胞顆粒呈鮮紅色，嗜中性粒細胞核呈紫藍色，淋巴細胞及瘧原蟲胞漿呈藍色或淡藍色，瘧原蟲核呈紅色。除環(huán)狀體外，其他各期均可查見瘧色素。以查完整個厚血膜，未查見瘧原蟲者判為陰性。根據(jù)瘧原蟲形態(tài)確定惡性瘧、間日瘧、三日瘧、卵形瘧或混合感染。 嗜酸性粒細胞 中性粒細胞 淋巴細胞 中性粒細胞 單核細胞 紅細胞血細胞形態(tài) 血小板人人體體四四種種瘧瘧原原蟲蟲紅紅內內期期各各期期形形態(tài)態(tài)鑒鑒別別 環(huán)狀體環(huán)狀體大滋養(yǎng)體大滋養(yǎng)體裂殖前期裂殖前期成熟裂殖體成熟裂殖體雌配子體雌配子體雄配

12、子體雄配子體間日瘧、惡性瘧薄血膜中形態(tài)特點 間日瘧原蟲間日瘧原蟲惡性瘧原蟲惡性瘧原蟲被寄生紅被寄生紅細胞細胞脹大脹大；顏色褪色；出現(xiàn)薛氏點，紅；顏色褪色；出現(xiàn)薛氏點，紅色，細小數(shù)多。色，細小數(shù)多。大小正常大小正常，顏色正?；蛏宰?；茂氏點，顏色正?；蛏宰?；茂氏點紅色，粗大數(shù)少。紅色，粗大數(shù)少。小滋養(yǎng)體小滋養(yǎng)體(環(huán)狀體環(huán)狀體)較大較大，約占紅細胞直徑的，約占紅細胞直徑的1/3；核核1個個；胞漿較?。粺o色素。；胞漿較?。粺o色素。小環(huán)狀體較小小環(huán)狀體較小，約占紅細胞直徑，約占紅細胞直徑1/6, 大環(huán)狀體與間日瘧原蟲相似；大環(huán)狀體與間日瘧原蟲相似；核核1或或2個個；胞漿小環(huán)狀體纖細，大環(huán)狀體與；胞漿小環(huán)

13、狀體纖細，大環(huán)狀體與間日瘧原蟲相似；無色素。間日瘧原蟲相似；無色素。大滋養(yǎng)體大滋養(yǎng)體較大較大；核多見核多見1個個；胞漿阿米巴樣，；胞漿阿米巴樣，含空泡；色素黃褐色，細小，桿狀，含空泡；色素黃褐色，細小，桿狀，散在分布多見。散在分布多見。較小較??；核核1或或2個個；胞漿圓形，空泡不；胞漿圓形，空泡不顯著；色素黃褐色，細小，結成團塊顯著；色素黃褐色，細小，結成團塊后，呈黑褐色。后，呈黑褐色。未成熟裂未成熟裂殖體殖體較大較大；核；胞漿圓形或不規(guī)則，空；核；胞漿圓形或不規(guī)則，空泡消失；色素黃褐色，分布不勻。泡消失；色素黃褐色，分布不勻。較小較??；核；核2個以上胞漿圓形，空泡消個以上胞漿圓形，空泡消失；

14、色素黑褐色團塊狀。失；色素黑褐色團塊狀。成熟裂殖成熟裂殖體體大于正常紅細胞大于正常紅細胞；裂殖子較大，；裂殖子較大，224個；排列不規(guī)則；色素黃褐個；排列不規(guī)則；色素黃褐色，常聚集一側。色，常聚集一側。小于正常紅細胞小于正常紅細胞；裂殖子較小，；裂殖子較小，826個，排列不規(guī)則；色素為黑褐色團個，排列不規(guī)則；色素為黑褐色團塊。塊。雌配子體雌配子體大于正常紅細胞，大于正常紅細胞，圓形圓形；核核1個個，較小，深紅色，較小，深紅色，位于一側位于一側；胞漿深；胞漿深藍色；色素黃褐色，均勻散在。藍色；色素黃褐色，均勻散在。較大，較大，新月形新月形，兩端尖銳；核，兩端尖銳；核1個，個，較小，深紅色，位于中

15、央；胞漿深藍較小，深紅色，位于中央；胞漿深藍色；色素黑褐色，緊密分布于核周圍。色；色素黑褐色，緊密分布于核周圍。雄配子體雄配子體大于正常紅細胞，大于正常紅細胞，圓形圓形；核；核1個，個，較大，淡紅色，較大，淡紅色，位于中央位于中央；胞漿淺；胞漿淺藍色；色素黃褐色，均勻散在。藍色；色素黃褐色，均勻散在。較大，較大，臘腸形臘腸形，兩端鈍園；核，兩端鈍園；核1個，個，較大，淡紅色，位于中央；胞漿淺藍較大，淡紅色，位于中央；胞漿淺藍色或淡紅色；色素黑褐色，松散分布色或淡紅色；色素黑褐色，松散分布于核周圍。于核周圍。被瘧原蟲寄生的RBC變化 蟲種蟲種RBC大小大小RBC顏色顏色間日瘧脹大變淡惡性瘧正?；?/p>

16、縮小正常間日瘧環(huán)狀體形態(tài) 約占寄生紅細胞的1/3，很少見到一個紅細胞寄生2個環(huán)狀體和一個環(huán)狀體有2個核。間日瘧大滋養(yǎng)體形態(tài) 蟲體增大，胞質增多，伸出偽足。 出現(xiàn)黃褐色的瘧色素。 紅細胞脹大，變形，顏色變淡，并出現(xiàn)數(shù)量較多，淡紅色的小點，稱薛氏小點間日瘧成熟裂殖體形態(tài)紅細胞紅細胞： 脹大，褪色，可見薛氏小點。大大 小?。?個體較大。胞漿和核胞漿和核：裂殖子1224個平均16個，排列不規(guī)則，核紅色，胞漿淺蘭色。色色 素素： 黃褐色常集于瘧原蟲的一邊。間日瘧配子體形態(tài) 雌配子體：蟲體較大，占滿脹大的紅細胞。胞質致密，色深藍核，小致密，深紅色，多位于蟲體一側，瘧色素分散 雄配子體：蟲體較小，占滿脹大的

17、紅細胞。胞質淺藍；核大疏松，淡紅色，多位于蟲體的中央。瘧色素分散 間日瘧大滋養(yǎng)體與配子體的區(qū)別大滋養(yǎng)體大滋養(yǎng)體配子體配子體蟲體蟲體較小較小較大較大胞漿胞漿邊緣不規(guī)則可見空泡邊緣不規(guī)則可見空泡 邊緣規(guī)則無空邊緣規(guī)則無空泡泡 核核較小、不規(guī)則較小、不規(guī)則 較大有不染色較大有不染色帶帶色素色素較少、分布不勻較少、分布不勻色素分布均勻色素分布均勻惡性瘧環(huán)狀體形態(tài) 蟲體：約占RBC的1/5-1/6,環(huán)狀。常見幾個蟲同時寄生在同一細胞 核： 小致密規(guī)則、常見2個核 胞漿：纖細完整惡性瘧配子體形態(tài) 雄（?。┡渥芋w：臘腸形，兩端鈍圓。胞漿淺藍色或淡紫紅色。核較大，疏松，位于中央，淺紅色，核周可見不染色帶。瘧色

18、素松散分布于核周圍。雌（大）配子體：新月形，兩端稍尖。胞漿深藍色。核較小，致密，深紅色，位于中央，核周可見透明不染色帶。瘧色素密布于核的周圍。間日瘧、惡性瘧厚血膜中形態(tài)特點 間日瘧原蟲間日瘧原蟲惡性瘧原蟲惡性瘧原蟲小滋養(yǎng)體（環(huán)狀體）較大。核1個，較大，胞漿較厚。常呈！或，狀。較小。核12個，較小，胞漿纖細。常呈！、飛鳥、和斷環(huán)狀。大滋養(yǎng)體較大。呈阿米巴樣，形狀不規(guī)則。核位于胞漿之中或外邊，胞漿常縮成圓形或斷裂成數(shù)塊。色素分布不勻。較小。常呈圓形，色素細小或結成12個團塊。裂殖體較大。裂殖子較大，1224個。較小；裂殖子較小，826個。配子體較大。圓形，色素粗大。雌配子體較大，核小，胞漿深藍色，

19、雄配子體較小，核大，胞漿淺藍色。雌配子體新月形，雄配子體臘腸形。色素黃褐色，細小。桿狀，或結成粗大顆粒。分布不勻。黃褐色，顆粒細小，結成團塊后，呈黑褐色。配子體色素粗大，分布于核周圍。被寄生紅細胞常見紅細胞“影子”和薛氏點可見紅細胞“影子”和茂氏點厚血膜瘧原蟲形態(tài)特點間日瘧原蟲間日瘧原蟲惡性瘧原蟲惡性瘧原蟲 厚血膜由于用血量較多，涂制的血膜小，紅細胞重疊且干燥慢，致使蟲體皺縮，空泡消失，胞漿變形，各期瘧原蟲的體積都略微縮小，其中只有大、小滋養(yǎng)體的形態(tài)有較大改變，而裂殖體和配子體的形態(tài)則無明顯變化。間間日日瘧瘧原原蟲蟲厚厚血血膜膜涂涂片片嗜酸性粒細胞裂殖體小配子體大配子體大滋養(yǎng)體小滋養(yǎng)體大滋養(yǎng)體

20、厚血膜環(huán)狀體體形態(tài) 環(huán)狀體： 胞漿呈環(huán)狀或向核的一側或兩側收縮，使環(huán)的中間斷裂，或圍繞核。間日瘧原蟲的環(huán)較大，常呈分號“；”和感嘆號“！”狀；惡性瘧原蟲的環(huán)纖細，常呈冒號“：”、飛鳥“.”、V狀和斷環(huán)狀。 間日瘧小滋養(yǎng)體惡性瘧小滋養(yǎng)體61厚血膜間日瘧各期惡性瘧小滋養(yǎng)體厚血膜間日瘧配子體形態(tài) 雄（小）配子體雄（?。┡渥芋w核大，疏松，圓形或呈星狀，胞漿較少，著色淡，瘧色素顆粒大，數(shù)量較多，散在分布。 雌（大）配子體雌（大）配子體與圓形成熟的大滋養(yǎng)體相似，但配子體瘧色素顆粒粗大，多而散在分布。間日瘧原蟲的配子體間日瘧原蟲的配子體呈圓形或卵圓形，除蟲體略縮小且著色深外，均與薄血膜相似。63厚血膜惡性瘧

21、配子體形態(tài) 配子體配子體呈新月形或臘腸形，如血膜干燥較慢，則可縮成圓形，核居中，瘧色素圍在核周，外圍一圈胞漿。此外，還可見配子體的胞漿部分或全部消失，只留下核和瘧色素，或核和胞漿均消失，只留下一些瘧色素。 64間日瘧配子體惡性瘧配子體厚血膜配子體 A.疑似 瘧色素 染色液雜質或灰塵 大小、色澤、位置。轉動顯微鏡的微調時，可見它浮于紅細胞之上，與原蟲不在一個平面上。 B. 疑似瘧原蟲核 球菌或白細胞破裂散出的顆粒 球菌較大、較多，白細胞顆粒著色較淡，邊緣整齊，附近常有白細胞的碎屑。 C. 疑似瘧原蟲胞質 網織紅細胞和白細胞殘留物 依據(jù)蟲體大小、折光是否均勻以及核與胞質是否在一個平面上予以區(qū)別。雜

22、質與瘧原蟲的鑒別鑒定是否為瘧原蟲的五條原則1、瘧原蟲要有核有漿有核有漿（紅核藍漿）。2、瘧原蟲各期（除環(huán)狀體外）均含有瘧色素。均含有瘧色素。3、瘧原蟲自然形態(tài)要像自然形態(tài)要像；瘧原蟲呈半透明狀態(tài)呈半透明狀態(tài)，模糊一團不透明者不是。4、體積最大最大的瘧原蟲也不不能超過中性粒細胞大。超過中性粒細胞大。5、數(shù)量極少，似是而非者判為可疑，應重新選擇時即多次制片、多次檢查。67血片中的瘧原蟲與雜質瘧原蟲雜質血片鏡檢的意義 優(yōu)點：是瘧疾確診的依據(jù)金標準；簡便、價廉、能夠鑒別瘧原蟲種類，方便評估感染原蟲密度。 缺點：費時費力、對檢驗者的專業(yè)知識和操作經驗要求較高，檢測敏感性低。二、免疫學診斷1、循環(huán)抗體檢測

23、2、循環(huán)抗原檢測1、循環(huán)抗體檢測 人類感染瘧疾后，在感染后2周內出現(xiàn)特異性抗體，48周達高峰，然后下降，并且在瘧疾清除后仍可持續(xù)3-6個月（帶蟲免疫）。 方法： 間接熒光抗體試驗(IFA)、 間接血凝試驗 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)原理：用已知抗原檢測未知抗體原理：用已知抗原檢測未知抗體 間間 接接 免免 疫疫 熒熒 光光 法法 原原 理理 示示 意意 圖圖瘧瘧原原蟲蟲血血涂涂片片間間接接熒熒光光抗抗體體試試驗驗意義 由于瘧疾抗體在患者治愈后仍能持續(xù)一段時間，且廣泛存在著個體差異，因此抗體檢測在臨床上僅作為輔助診斷。其主要用于瘧疾的流行病學調查，包括了解瘧疾地方性流行水平、監(jiān)測傳播強度、確定范圍、防治效果評估及輸血對象的篩選。2、循環(huán)抗原檢測 利用血清學方法檢測瘧原蟲。循環(huán)抗原常用的方法有放射免疫試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗和快速診斷實驗(RDTs)等?？焖僭\斷實驗(RDTs) 是用來檢測瘧疾現(xiàn)癥或近期感染者血液中瘧原蟲特異性抗原的試驗方法。其檢測原理主要基于免疫層析技術利用纖維膜的毛細作用，使血液中待測瘧原蟲抗原沿膜表面向前運動與檢測區(qū)標記的特異性抗體結合根據(jù)