細菌菌落總數的測定

1、 食品微生物學檢驗食品微生物學檢驗 菌落總數的測定菌落總數的測定 一一、目的目的 1、 學習并掌握食品中菌落總數測定方學習并掌握食品中菌落總數測定方法和原理法和原理。22 、了解菌落總數測定在對被樣品進行了解菌落總數測定在對被樣品進行衛(wèi)生學評價中的意義衛(wèi)生學評價中的意義 。二、原理二、原理 細菌數量的表示方法由于所采用的細菌數量的表示方法由于所采用的計數方法不同而有兩種：計數方法不同而有兩種：菌落總數菌落總數和和細細菌總數菌總數。 1、菌落總數菌落總數 是指食品檢樣經過處理，在一定條是指食品檢樣經過處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得件下培養(yǎng)后，所得1g或或1mL檢樣中形成檢樣中形成的細菌菌落總數。

2、以的細菌菌落總數。以 CFU/g（mL）來）來表示。表示。 一定條件包括培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度一定條件包括培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時間、和時間、pH、是否需要氧氣等。、是否需要氧氣等。 按國家標準方法規(guī)定，即在按國家標準方法規(guī)定，即在需氧需氧情況情況下，下， 36 36 11培養(yǎng)培養(yǎng)48482 2h，能在，能在平板平板計數瓊脂計數瓊脂上生長發(fā)育的細菌菌落總數。上生長發(fā)育的細菌菌落總數。所以厭氧或微需氧菌、有特殊營養(yǎng)要求所以厭氧或微需氧菌、有特殊營養(yǎng)要求的以及非嗜中溫的細菌，由于現有條件的以及非嗜中溫的細菌，由于現有條件不能滿足其生理需求，故難以繁殖生長。不能滿足其生理需求，故難以繁殖生長。菌落總數

3、菌落總數并不表示實際中的所有細菌總并不表示實際中的所有細菌總數，也不能區(qū)分其中細菌的種類，只包括數，也不能區(qū)分其中細菌的種類，只包括一群在計數平板瓊脂中生長發(fā)育、嗜中溫一群在計數平板瓊脂中生長發(fā)育、嗜中溫的需氧和兼性厭氧的細菌菌落總數，所以的需氧和兼性厭氧的細菌菌落總數，所以有時被稱為有時被稱為雜菌數雜菌數，需氧菌數需氧菌數等。等。 菌落總數主要作為判別菌落總數主要作為判別食品被污染食品被污染程度程度的標志，也可以應用這一方法觀察的標志，也可以應用這一方法觀察細菌在食品中繁殖的動態(tài)，以便對被檢細菌在食品中繁殖的動態(tài)，以便對被檢樣品進行衛(wèi)生學評價時提供依據。樣品進行衛(wèi)生學評價時提供依據。 食品中

4、細菌食品中細菌菌落總數越多菌落總數越多，則食品，則食品含有致病菌含有致病菌的可能性越大，食品的可能性越大，食品質量越質量越差差；菌落總數越小，則食品含有致病菌；菌落總數越小，則食品含有致病菌的可能性越小。須配合的可能性越小。須配合大腸菌群和致病大腸菌群和致病菌菌的檢驗，才能對食品做出較全面的評的檢驗，才能對食品做出較全面的評價。價。 2 2、細菌總數、細菌總數指一定數量或面積的食品樣品經過指一定數量或面積的食品樣品經過適當的處理后，在顯微鏡下對細菌進行適當的處理后，在顯微鏡下對細菌進行直接計數。其中包括各種直接計數。其中包括各種活菌數活菌數和尚未和尚未消失的消失的死菌數死菌數。細菌總數也稱細菌

5、直接。細菌總數也稱細菌直接顯微鏡數。通常以顯微鏡數。通常以1g或或1mL樣品中的細樣品中的細菌總數來表示。菌總數來表示。三三 、 材料材料 1、食品檢樣食品檢樣 2、培養(yǎng)基培養(yǎng)基 平板計數培養(yǎng)基，無菌生理鹽水或磷酸平板計數培養(yǎng)基，無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液鹽緩沖液 3、其它其它 無菌培養(yǎng)皿，無菌吸管，電爐、無菌培養(yǎng)皿，無菌吸管，電爐、恒溫培恒溫培養(yǎng)箱養(yǎng)箱等。等。 四、四、 流程流程 1 1、檢樣、檢樣 2 2、做幾個適當倍數的做幾個適當倍數的稀釋液稀釋液3、選擇、選擇23個適宜個適宜稀釋度各稀釋度各1 mL,1 mL,分別加入分別加入滅菌平皿內滅菌平皿內 4 4、平皿內傾注、平皿內傾注1515

6、20 mL20 mL瓊脂培養(yǎng)基，混勻瓊脂培養(yǎng)基，混勻5 5、36 36 11培養(yǎng)培養(yǎng)48482 2小時或（小時或（24242 2）?。┬r時6、記錄稀釋倍數和相應的記錄稀釋倍數和相應的各平板各平板菌落數量菌落數量7 7、 計算菌落總數計算菌落總數 報告報告 五、五、 步驟步驟 (一一) 取樣、稀釋和培養(yǎng)取樣、稀釋和培養(yǎng) 1、以無菌操作取檢樣以無菌操作取檢樣25g（mL），），放于放于225mL滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液 的滅菌玻的滅菌玻璃瓶內（瓶內預置適量的玻璃珠）或滅菌乳缽內，璃瓶內（瓶內預置適量的玻璃珠）或滅菌乳缽內，經充分振蕩或研磨制成經充分振蕩或研磨制成1:1

7、0的均勻稀釋液。的均勻稀釋液。 固體和半固體檢樣在加入稀釋液后，最好置固體和半固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質器中以滅菌均質器中以800010000r/min的速度處理的速度處理12min，制成，制成1:10的均勻稀釋液。的均勻稀釋液。 2、用用1 mL滅菌吸管吸取滅菌吸管吸取1:10稀釋稀釋液液1 mL，沿管壁徐徐注入含有，沿管壁徐徐注入含有9 mL滅滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液的試管內，菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液的試管內，振搖試管振搖試管或反復吹打混合均勻，制成或反復吹打混合均勻，制成1:100的稀釋液。的稀釋液。 3、另取另取1 mL滅菌吸管，按上項操滅菌吸管，按上項操作順序，制作順序

8、，制10倍遞增稀釋液，如此每倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即遞增稀釋一次即換用換用1支支1 mL吸管。吸管。 4、根據標準要求或對污染情況的估根據標準要求或對污染情況的估計，選擇計，選擇23個個適宜稀釋度，分別在制適宜稀釋度，分別在制作作10倍遞增稀釋的同時，以吸取該稀釋倍遞增稀釋的同時，以吸取該稀釋度的吸管移取度的吸管移取1ml稀釋液于滅菌平皿中，稀釋液于滅菌平皿中，每個稀釋度做每個稀釋度做兩個平皿兩個平皿。同時分別取同時分別取1ml稀釋液（不含樣品）稀釋液（不含樣品）加入兩個滅菌平皿內作加入兩個滅菌平皿內作空白對照空白對照。5、稀釋液移入平皿后，將冷卻至稀釋液移入平皿后，將冷卻至46瓊脂

9、培養(yǎng)基注入平皿約瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約1520ml，并轉動平皿，并轉動平皿，混合均勻混合均勻。6、待瓊脂凝固后，翻轉平板，置待瓊脂凝固后，翻轉平板，置361溫箱內培養(yǎng)溫箱內培養(yǎng)482h，水產品，水產品301溫箱內培養(yǎng)溫箱內培養(yǎng)723h。如樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌如樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長的菌落時，可在凝固后的瓊脂表面漫生長的菌落時，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4毫升），凝固毫升），凝固后培養(yǎng)。后培養(yǎng)。 （二）（二）菌落記錄方法菌落記錄方法 做平板菌落數記錄時，可用肉眼觀察，做平板菌落數記錄時，可用肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏

10、。在記必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平皿的菌落總數后，求出下各平皿的菌落總數后，求出同稀釋度同稀釋度的各的各平板平均菌落數平板平均菌落數。 到達規(guī)定培養(yǎng)時間，應立即計數。如果到達規(guī)定培養(yǎng)時間，應立即計數。如果不能立即計數，應將平板放置于不能立即計數，應將平板放置于0 044，但但不要超過不要超過24h24h。 1 1、 平皿菌落數的選擇平皿菌落數的選擇 選取菌落數在選取菌落數在3030300300之間的平板作之間的平板作為菌落總數測定標準。每一個稀釋度應為菌落總數測定標準。每一個稀釋度應采用采用兩個平皿兩個平皿，大于大于300300的可記為多不的可記為多不可計?？捎嫛?、其中一個平板有

11、較大、其中一個平板有較大片狀菌落片狀菌落生生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數；若生長的平板作為該稀釋度的菌落數；若片狀菌落片狀菌落不到平板的一半不到平板的一半，而，而其余一半其余一半中菌落分布又很中菌落分布又很均勻均勻，則可以計算，則可以計算半個半個平板后乘以平板后乘以2，以代表一個平板的菌落，以代表一個平板的菌落數。數。3、當平板上有鏈狀菌落生長時，、當平板上有鏈狀菌落生長時，如呈如呈鏈狀生長鏈狀生長的菌落之間無任何明顯的菌落之間無任何明顯界限，則應作為一個菌落計，如存在界限，則應作為一個菌落計，如存在有幾條不同來源的鏈，則每

12、條鏈均應有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應按一個菌落計算，不要把鏈上生長的按一個菌落計算，不要把鏈上生長的每一個菌落分開計數。每一個菌落分開計數。 （三）菌落總數的計算（三）菌落總數的計算 1 1、若只有一個稀釋度平板上的菌落數在若只有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內，計算兩個平板菌落數的適宜計數范圍內，計算兩個平板菌落數的平均值平均值，再將平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數乘以相應稀釋倍數，作為每作為每g g（mLmL）中菌落總數結果。）中菌落總數結果。試樣試樣例次例次稀釋度稀釋度選定計數稀釋度選定計數稀釋度菌量菌量/(/(個個/g/g或或mL)mL)1010-2-21010-3-31

13、010-4-41 1平平均均菌菌落落數數380380525218181010-3-35.2x105.2x104 42 252652620520532321010-3-3，1010-4-42.6x102.6x105 53 343543521021048481010-3-3，1010-4-43.5x103.5x105 54 428428415215237371010-2-2，1010-3-39.0 x109.0 x104 45 5262612125 51010-2-22.6x102.6x103 36 6無法計數無法計數5685683123121010-4-43.1x103.1x106 6 2 2、

14、若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數在適宜計、若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時，按如下公式計算：數范圍內時，按如下公式計算：N=C/N=C/（n n1 1+0.1n+0.1n2 2）d d（1 ) 1 ) 式中：式中：N N 樣品中菌落數；樣品中菌落數；C C 平板（含適宜范圍菌落數的平板）菌落平板（含適宜范圍菌落數的平板）菌落數之和；數之和；n nl l 第一個適宜稀釋度平板數；第一個適宜稀釋度平板數；n n2 2 第二個適宜稀釋度平板數；第二個適宜稀釋度平板數；d d 稀釋因子（第一稀釋度）。稀釋因子（第一稀釋度）。例如：例如：稀釋度稀釋度1:100（第一稀釋度）（第一稀釋度）1

15、:1000（第二稀釋度）（第二稀釋度）菌落數菌落數232，24433，35232+244+33+35(2+0.12)10-2=544/0.022=24727四舍五入表示為四舍五入表示為:2.5104試樣試樣例次例次稀釋度稀釋度選定計數稀釋度選定計數稀釋度菌量菌量/(/(個個/g/g或或mL)mL)1010-2-21010-3-31010-4-41 1平平均均菌菌落落數數380380525218181010-3-35.2x105.2x104 42 252652620520532321010-3-3，1010-4-42.6x102.6x105 53 343543521021048481010-3-

16、3，1010-4-43.5x103.5x105 54 428428415215237371010-2-2，1010-3-39.0 x109.0 x104 45 5262612125 51010-2-22.6x102.6x103 36 6無法計數無法計數5685683123121010-4-43.1x103.1x106 63、若所有稀釋度的平板菌落數若所有稀釋度的平板菌落數均均300，則取，則取最高稀釋度最高稀釋度的平均菌落數乘的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。以稀釋倍數計算。試樣試樣例次例次稀釋度稀釋度選定計數稀釋度選定計數稀釋度菌量菌量/(/(個個/g/g或或mL)mL)1010-2-21010

17、-3-31010-4-41 1平平均均菌菌落落數數380380525218181010-3-35.2x105.2x104 42 252652620520532321010-3-3，1010-4-42.6x102.6x105 53 343543521021048481010-3-3，1010-4-43.5x103.5x105 54 428428415215237371010-2-2，1010-3-39.0 x109.0 x104 45 5262612125 51010-2-22.6x102.6x103 36 6無法計數無法計數5685683123121010-4-43.1x103.1x106 6

18、4、若所有稀釋度平板菌落數、若所有稀釋度平板菌落數均均30，則以則以最低稀釋度最低稀釋度的平均菌落數乘稀釋倍的平均菌落數乘稀釋倍數計算。數計算。5、若所有稀釋度平板均、若所有稀釋度平板均無菌落生長無菌落生長，則應按則應按300，有的又，有的又30，則應以，則應以最接近最接近300或或30的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。（四）（四）菌落計數報告方法菌落計數報告方法1、菌落數在、菌落數在1100時，按四舍五入報時，按四舍五入報告告兩位有效數字。兩位有效數字。2、菌落數菌落數100時，第三位數字按四舍時，第三位數字按四舍五入計算，取五入計算，取前面兩位有效數字前面兩位有效

19、數字，為了縮，為了縮短數字后面的零數，也可以短數字后面的零數，也可以10的指數表示。的指數表示。3 3、若所有平板上為蔓延菌落而無法計若所有平板上為蔓延菌落而無法計數，則報告數，則報告菌落蔓延菌落蔓延。 4 4、 若空白對照上有菌落生長，則此次檢若空白對照上有菌落生長，則此次檢測測結果無效結果無效。5 5、稱重取樣以稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積為單位報告，體積取樣以取樣以CFU/mL為單位報告。為單位報告。注意事項注意事項1、無菌操作、無菌操作操作中必須有操作中必須有“無菌操作無菌操作”的概念，所用的概念，所用玻璃器皿必須是完全滅菌的。所用剪刀、鑷子玻璃器皿必須是完全滅菌的。所用剪刀、

20、鑷子等器具也必須進行消毒處理。樣品如果有包裝，等器具也必須進行消毒處理。樣品如果有包裝，應用應用75%75%乙醇乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。操在包裝開口處擦拭后取樣。操作應當在作應當在超凈工作臺超凈工作臺或經過消毒處理的或經過消毒處理的無菌室無菌室進行。進行。 2 2、采樣的代表性、采樣的代表性 如系固體樣品，取樣時不應集中一如系固體樣品，取樣時不應集中一點，宜多采幾個部位。點，宜多采幾個部位。固體樣品固體樣品必須經必須經過均質或研磨，過均質或研磨，液體樣品液體樣品須經過振搖，須經過振搖，以獲得均勻稀釋液。以獲得均勻稀釋液。 3 3、稀釋液、稀釋液 樣品稀釋液主要是樣品稀釋液主要是滅菌生理鹽水

21、滅菌生理鹽水，或，或磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液（或（或0.1蛋白胨水蛋白胨水），后），后者對食品已受損傷的細菌細胞有一定的保者對食品已受損傷的細菌細胞有一定的保護作用。如對含鹽量較高的食品（如醬油）護作用。如對含鹽量較高的食品（如醬油）進行稀釋，可以采用進行稀釋，可以采用滅菌蒸餾水滅菌蒸餾水。 4 4、每遞增稀釋一次即換用、每遞增稀釋一次即換用1 1支支1ml1ml滅菌滅菌吸管。吸管。 5 5、傾注用培養(yǎng)基應在、傾注用培養(yǎng)基應在4646水浴內保溫，水浴內保溫，溫度過高會影響細菌生長，過低瓊脂易溫度過高會影響細菌生長，過低瓊脂易于凝固而不能與菌液充分混勻。如無水于凝固而不能與菌液充分混勻。如無水浴

22、，應以皮膚感受較熱而不燙為宜。浴，應以皮膚感受較熱而不燙為宜。 6 6、傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一，從、傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一，從121220ml20ml不等，一般以不等，一般以15ml15ml較為適宜，平板較為適宜，平板過厚可影響觀察，太薄又易于干裂。傾過厚可影響觀察，太薄又易于干裂。傾注時，培基底部如有沉淀物，應將底部注時，培基底部如有沉淀物，應將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計數觀察。棄去，以免與菌落混淆而影響計數觀察。7、為使菌落能在平板上均勻分布，、為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿后，應盡快傾注培養(yǎng)基并檢液加入平皿后，應盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉混勻旋轉混勻，可正反兩個方向旋轉，檢樣，

23、可正反兩個方向旋轉，檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間間不宜超過不宜超過20min，以防止細菌有所死，以防止細菌有所死亡或繁殖。亡或繁殖。8、培養(yǎng)溫度一般為、培養(yǎng)溫度一般為37（水產品的（水產品的培養(yǎng)溫度，由于其生活環(huán)境水溫較低，培養(yǎng)溫度，由于其生活環(huán)境水溫較低，故多采用故多采用30）。培養(yǎng)時間一般為）。培養(yǎng)時間一般為48h，有些方法只要求有些方法只要求24h的培養(yǎng)即可計數。的培養(yǎng)即可計數。培養(yǎng)箱應保持一定的濕度，瓊脂平板培培養(yǎng)箱應保持一定的濕度，瓊脂平板培養(yǎng)養(yǎng)48h后，培養(yǎng)基失重不應超過后，培養(yǎng)基失重不應超過15。 9 9、為了避免食品中的微小顆?；蚺?/p>

24、、為了避免食品中的微小顆粒或培基中的雜質與細菌菌落發(fā)生混淆，不易基中的雜質與細菌菌落發(fā)生混淆，不易分辨，可同時作一稀釋液與瓊脂培基混分辨，可同時作一稀釋液與瓊脂培基混合的平板，不經培養(yǎng)，而于合的平板，不經培養(yǎng)，而于4 4環(huán)境中放環(huán)境中放置，以便計數時作對照觀察。置，以便計數時作對照觀察。 六、六、結果結果1、將實驗測出的樣品數據以表格的將實驗測出的樣品數據以表格的方式報告。方式報告。2、對樣品菌落總數作出是否符合衛(wèi)對樣品菌落總數作出是否符合衛(wèi)生要求的結論。生要求的結論。報告方式報告方式樣品樣品稀釋液及稀釋液及菌落數菌落數選擇稀選擇稀釋度釋度報告報告(CFU/g,ml)10-210-310-4樣品樣品名稱名稱原始原始數據數據計算公式計算公式報告報告平均平均七、思考七、思考1、什么是細菌菌落總數（什么是細菌菌落總數（cfu）