實(shí)驗(yàn)1總酚類黃酮聯(lián)合測(cè)定2010

1、 植物次生代謝與工程實(shí)驗(yàn)植物次生代謝與工程實(shí)驗(yàn) 張張 海海 森森山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 分類：分類：依分子中羥基數(shù)分為一元酚、二元酚及多元酚；羥基在萘環(huán)上的稱為萘酚，依分子中羥基數(shù)分為一元酚、二元酚及多元酚；羥基在萘環(huán)上的稱為萘酚，在蒽環(huán)上稱為蒽酚在蒽環(huán)上稱為蒽酚 多酚與多酚與FoLin-Ciocalteu試劑發(fā)生特異性反應(yīng)，反試劑發(fā)生特異性反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)特定波長有最大吸收，且吸光值與多酚的量在應(yīng)產(chǎn)物對(duì)特定波長有最大吸收，且吸光值與多酚的量在一定濃度范圍內(nèi)成線性關(guān)系。一定濃度范圍內(nèi)成線性關(guān)系。 類黃酮具有類黃酮具有 C6C3C6碳骨架結(jié)構(gòu)，黃酮類分子中碳骨架結(jié)構(gòu)，

2、黃酮類分子中具有酚羥基，可與具有酚羥基，可與Al3+在堿性溶液中顯色，在一定濃度在堿性溶液中顯色，在一定濃度范圍內(nèi)，其濃度與吸光度符合朗伯范圍內(nèi)，其濃度與吸光度符合朗伯-比耳定律，可進(jìn)行比耳定律，可進(jìn)行比色定量。比色定量。 黃酮類化合物-基本母核為2-苯基色原酮 儀器儀器：分光光度計(jì)，恒溫水浴，分光光度計(jì)，恒溫水浴，25ml具塞試管，具塞試管，10ml試管，移液器，試管，移液器，漏斗，濾紙等。漏斗，濾紙等。 試劑試劑： Folin-酚試劑，酚試劑， 20% Na2CO3， 5%亞硝酸鈉，亞硝酸鈉， 10% 硝酸鋁，硝酸鋁，4氫氧化鈉，氫氧化鈉， 50%甲醇等。甲醇等。四、實(shí)驗(yàn)材料：雪松雪松(香

3、柏香柏 )針葉針葉Cedar Tree 五、操作步驟程序： 1 1、樣品提取、樣品提取 2 2、總酚含量測(cè)定、總酚含量測(cè)定 3 3、類黃酮含量測(cè)定、類黃酮含量測(cè)定 4 4、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 5 5、結(jié)果計(jì)算、結(jié)果計(jì)算 1、樣品提取步驟取烘干的雪松葉(或銀杏葉)，粉碎，過40目(0.63毫米 )篩 稱取0.20g干樣置入20ml具塞試管中，加入10ml 50%甲醇， 蓋塞，搖床振蕩提取10h 過濾于25ml容量瓶，50%甲醇沖洗定容 得到酚類物質(zhì)的粗提液過濾時(shí)，濾紙過濾時(shí)，濾紙先用吸管吸取先用吸管吸取50甲醇潤濕甲醇潤濕2、總酚含量的測(cè)定取4支具塞試管（3支測(cè)定管，一支空白管）3支

4、測(cè)定管加入過濾的粗提液0.2ml，1支空白管加同量50甲醇 各試管中加入4.8ml蒸餾水 加入0.5ml的 Folin-酚試劑，搖勻 8分鐘內(nèi)加入20% Na2CO3 2.5ml，搖勻50恒溫水浴下避光保溫30分鐘 760nm下測(cè)定吸光度（以單寧酸為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線）以單寧酸為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線）3、類黃酮含量的測(cè)定取4支具塞試管（3支測(cè)定管，一支空白管）3支測(cè)定管加入過濾的粗提液 1ml，1支空白管加同量50甲醇 各管加0.5ml 5% NaNO2， 搖勻，靜置5min加0.5ml 10% Al(NO3)3，搖勻，靜置6 min 加2ml 4 NaOH，混勻，放置10min 510nm下測(cè)定吸

5、光度（以蘆丁為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線）以蘆丁為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線）黃酮鋁絡(luò)合物易黃酮鋁絡(luò)合物易受受CO2作用使顏?zhàn)饔檬诡伾兴兓兴兓?，要求短時(shí)間完成操求短時(shí)間完成操作，中間蓋塞作，中間蓋塞4、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 吸取100mg/LD單寧酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml分別放入8只100ml容量瓶中，加水至75ml，再加5ml的Folin-酚試劑和10ml20% Na2CO3,混合后定容。即得到系列標(biāo)準(zhǔn)液。放置30min后用760nm波長比色測(cè)定。以單寧濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？偡雍靠偡雍浚╣/g）=XV /m X為由吸光度按標(biāo)準(zhǔn)

6、曲線查的結(jié)果；為由吸光度按標(biāo)準(zhǔn)曲線查的結(jié)果；V為粗提液總體積為粗提液總體積 (ml)；m為稱樣質(zhì)量為稱樣質(zhì)量(g )（參考）總酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線：（參考）總酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0026x + 0.0245 R2 = 0.9993 類黃酮含量類黃酮含量（g/g）=XV /mX為由吸光度按標(biāo)準(zhǔn)曲線查的結(jié)果；為由吸光度按標(biāo)準(zhǔn)曲線查的結(jié)果；V為粗提液總體積為粗提液總體積(ml)；m為稱樣質(zhì)量為稱樣質(zhì)量(g)（參考）類黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線：（參考）類黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.8965x 0.0014 R2 =0.99971.開機(jī)預(yù)熱開機(jī)預(yù)熱3-5分鐘。分鐘。2.閉蓋，黑體，調(diào)閉蓋，黑體，調(diào)100%3.閉蓋，用空

7、白代替黑體，調(diào)閉蓋，用空白代替黑體，調(diào)0植物體內(nèi)總酚和類黃酮含量測(cè)定數(shù)據(jù)記錄表植物體內(nèi)總酚和類黃酮含量測(cè)定數(shù)據(jù)記錄表波長波長(nm) 稱樣量稱樣量(g)123平均值平均值含量含量(g/g)總酚總酚類黃酮類黃酮 次生代謝 vs 初生代謝 次生代謝是指生物合成生命非必需物質(zhì)并儲(chǔ)存次生代謝產(chǎn)物的過程。 初生代謝是指所有生物的共同的代謝途徑。合成糖類，氨基酸類,普通的脂肪酸類，核酸類以及由它們形成的聚合物(多糖類、蛋白質(zhì)類、RNA、 DNA等等)。這些對(duì)生物生存和健康必需的化合物就叫初生代謝產(chǎn)物。它們都是通過生物的代謝作用產(chǎn)生化學(xué)物質(zhì)的過程。 植物酚類化合物的分類 植物酚類化合物是植物次生代謝物的主要

8、類型之一, 在植物界已知有8 000種以上, 主要由類黃酮、酚酸和單寧等三類物質(zhì)構(gòu)成, 各類又由許多亞類物質(zhì)組成(圖1) 。研究發(fā)現(xiàn)酚類化合物有兩類基本結(jié)構(gòu), 一類是C6C3C6環(huán)狀結(jié)構(gòu), 包括類黃酮、部分酚酸和縮聚單寧, 另一類是C6C1型結(jié)構(gòu), 主要是部分酚酸和水解單寧。在植物中, 這些物質(zhì)并不是以簡單形式存在, 它們往往與其他物質(zhì)結(jié)合, 例如: 原花青素常與木質(zhì)素類結(jié)合成聚合物; 黃酮苷元往往與不同的糖結(jié)合以糖苷形式存在于植物體中; 酚酸也以酯合或糖苷化形式與植物體內(nèi)的酯、糖或纖維素結(jié)合。 類黃酮是目前種類最多的酚類化合物, 既與植物的花色形成密切相關(guān), 又在植物-環(huán)境互作中起重要作用(

9、如防止UV 損傷、抗病、影響豆科植物的根瘤形成等)。自然界中最常見的類黃酮是花青素、黃酮和黃酮醇, 其他包括雙氫黃酮(醇)、異黃酮、雙黃酮、黃烷醇、查爾酮、橙酮及新黃酮類等?；ㄇ嗨厥侵参锝缰凶畲蟮囊活愃苄陨? 已知天然存在的花青素有20種, 常見的有6種, 花色苷有250多種, 存在于27個(gè)科, 73個(gè)屬的植物中, 約占植物界類黃酮的15% 20%, 其基本結(jié)構(gòu)都是2- 苯基苯并吡喃形成的花色苷元, 在花色苷元上各個(gè)碳位由于取代基的不同而形成各種各樣的花色素, 通常在花色基元A 環(huán)和C環(huán)的C3, C5, C7 上的氫原子被羥基取代, B 環(huán)的C3 和C5 上的氫原子被羥基或甲氧基取代而形成

10、6 種基本花青素, 即: 天竺葵色素( pelargonidin)、矢車菊色素( cyanidin)、翠雀花色素( de lph in id in)、芍藥花色素( peonidin)、一甲翠雀花色素( petunidin)、二甲翠雀花色素, 其中前3種是最基本的花青素, 分別由堪非醇( kaemp ferol)、櫟精( quercetin)和楊梅酮( myricet in)為底物合成, 而芍藥花色素由天竺葵色素衍生而來, 一甲翠雀花色素、二甲翠雀花色素由翠雀花色素甲基化而得。 酚酸中羥基苯甲酸型有4 種在植物中普遍存在, 包括對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸和原兒茶酸, 它們通常與糖或有機(jī)酸結(jié)合形

11、成可溶的共軛物, 或者與細(xì)胞壁結(jié)合形成木質(zhì)素, 另外還有一種常見的鄰羥基苯甲酸即水楊酸, 在植物中也普遍存在; 羥基肉桂酸型的酚酸也有香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸等4種廣泛存在于植物的果實(shí)中, 容易形成酯合的結(jié)構(gòu)。酚類化合物在植物中的生理功能酚類化合物在植物中的生理功能酚類化合物在植物中有許多重要的生理功能酚類化合物在植物中有許多重要的生理功能, 對(duì)植物的品質(zhì)、產(chǎn)量等起對(duì)植物的品質(zhì)、產(chǎn)量等起著至關(guān)重要的作用著至關(guān)重要的作用,主要包括主要包括: ( 1) 作為植物葉、莖、表皮、花、果實(shí)等器官的著色劑, 主要是花青素和黃酮醇等類黃酮物質(zhì), 同時(shí)也參與了許多生物間的相互作用。其中花青素普遍存在于植

12、物各個(gè)器官中, 顯現(xiàn)藍(lán)色、紫色、紅色、中間色彩和黑色, 而黃酮醇主要存在于花、葉和果實(shí)中表現(xiàn)為淺黃色, 一定程度上可引誘鳥和昆蟲, 有助于植物種子傳播和花朵授粉; ( 2) 酚類化合物對(duì)諸如傷害、侵染、光過?；騏V 輻射等逆境脅迫有防御作用 , 尤其花青素可在一定程度上釋放出H+ 猝滅諸如強(qiáng)光、水分脅迫等逆境條件下產(chǎn)生的氧自由基, 避免光抑止、光氧化、脂質(zhì)過氧化, 保護(hù)光合器及細(xì)胞膜系統(tǒng)的完整性, 從而起到保護(hù)植物的作用; ( 3)作為細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)成分, 類黃酮和酚酸參與細(xì)胞壁的組成, 起到支撐植物的作用;( 4)酚類化合物是植物化感作用的生化分子, 目前在植物中發(fā)現(xiàn)的大部分化感物質(zhì)主要是酚類

13、和類萜化合物, 如植物受病原菌侵害產(chǎn)生的植保素大部分為異黃酮, 參與調(diào)控植物抗病性( 5)酚類化合物還可以充當(dāng)信號(hào)分子, 如水楊酸參與植物生長和發(fā)育的許多生理過程, 主要包括植物生長、器官形成、產(chǎn)熱、開花誘導(dǎo)、營養(yǎng)吸收、乙烯合成、氣孔運(yùn)動(dòng)、光合作用和抗生物或非生物脅迫等 ( 6)一些類黃酮還是一些物種的雄性育性、抗微生物制劑、取食抑制劑、植物和固氮細(xì)菌間的識(shí)別信號(hào)。在人和動(dòng)物中的營養(yǎng)功能 由于酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)中含有較多的羥基, 因此表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化作用。類黃酮具有抗變性、抗炎癥、抗病毒和抗腫瘤的活性, 酚酸具有抗氧化和抗心血管疾病的作用。在流行病學(xué)上發(fā)現(xiàn)類黃酮(黃酮醇和黃酮) 攝入的量和心臟病、

14、中風(fēng)、肺癌、胃癌發(fā)生率成反比, 所以有所謂的”法蘭西困惑”現(xiàn)象, 法國人經(jīng)常飲用葡萄酒, 而紅葡萄酒中含有大量的多酚類物質(zhì)如原花色素、兒茶素等, 這些物質(zhì)能預(yù)防冠心病, 抑制血管動(dòng)脈粥樣硬化, 從而延長人的壽命?；ㄇ嗨鼗旌衔镞€能夠抑制誘變劑對(duì)老鼠的傷害。酚類化合物的抗氧化機(jī)理酚類化合物的抗氧化機(jī)理一般分為3 種:( 1)氫原子轉(zhuǎn)移機(jī)理: 自由基從抗氧化劑分子的某個(gè)基團(tuán)(一般是羥基)上抽去一個(gè)氫原子, 形成苯氧自由基, 維生素E、咖啡酸、表兒茶酸以及五倍子酸等屬于這一類 ; ( 2)電子伴隨質(zhì)子轉(zhuǎn)移機(jī)理: 首先發(fā)生電子轉(zhuǎn)移生成抗氧化劑的正離子自由基, 然后再進(jìn)行質(zhì)子轉(zhuǎn)移完成抽氫過程, 并形成一個(gè)

15、苯氧自由基, 它可通過共振作用而穩(wěn)定, 結(jié)果使自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)減慢或終止, 例如堪非醇和白黎蘆醇;( 3) 絡(luò)合機(jī)理: 由于生物體內(nèi)存在游離金屬離子, 比如Fe2+ , 它能夠通過Fenton反應(yīng)催化H2O2 產(chǎn)生羥基自由基, 從而引發(fā)分子損傷, 例如槲皮素分子中有3個(gè)位點(diǎn)可以絡(luò)合鐵離子。展望 酚類物質(zhì)是植物中研究最廣泛的次生代謝物質(zhì), 由于其具有天然抗氧化活性, 所以在醫(yī)藥、化工、染料、制革等領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用。隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展, 各個(gè)植物中酚類物質(zhì)的種類、含量、結(jié)構(gòu)以及它們的代謝途徑、互作方式、基因調(diào)控模式等研究將逐步得以深入, 有助于未來酚類物質(zhì)的定向合

16、成和利用。同時(shí), 隨著現(xiàn)代提取工藝技術(shù)的不斷改進(jìn), 如超聲、超臨界萃取、膜技術(shù)和電化學(xué)技術(shù)等的發(fā)展, 必將為植物酚類物質(zhì)的提取提供更加簡便、快速及高效的工藝, 從而大大提高植物酚類物質(zhì)的提取效率和純度, 進(jìn)而使植物酚類物質(zhì)呈現(xiàn)出更加廣闊的應(yīng)用前景。FoLin-CiocaLteu試劑的配制： 將100g鎢酸鈉(Na2WO4 2H2O), 25g鉬酸鈉( Na2MoO42H2O) ,700 mL蒸餾水，50 mL 85%磷酸及100 mL濃鹽酸裝入帶回流裝置的2000mL圓底燒瓶中，充分混合，文火緩慢回流10h,在加入150g硫酸鋰(Li2SO4),50 mL蒸餾水及數(shù)滴液溴，然后將燒瓶內(nèi)溶液開口煮15min，以驅(qū)除過量的溴，冷至室溫后用容量瓶定容至1000mL，過濾。濾液