第七講 生物催化與轉(zhuǎn)化的應(yīng)用實(shí)例

1、應(yīng)用例1微生物酶法拆分制備D-泛解酸內(nèi)酯 D-泛解酸內(nèi)酯是D-泛酸鈣與D-泛醇的重要手性中間體。 OHOO維生素藥物D-泛酸和D-泛醇 D-泛酸，Pantothenic acid，又稱(chēng)遍多酸、維生素B5、或B3，是構(gòu)成輔酶A的成分，它是一種重要的藥物、食品添加劑和飼料添加劑。產(chǎn)品一般為其鈣鹽D-泛酸鈣（Calcium Pantothenate）。 D-泛醇（D-panthenol），又稱(chēng)維生素原B5，是以液體形式存在的D-泛酸鈣的同效物，D-泛醇進(jìn)入人體內(nèi)能轉(zhuǎn)化為泛酸，進(jìn)而合成輔酶A，促進(jìn)人體蛋白質(zhì)、脂肪、糖類(lèi)的代謝，保護(hù)皮膚和粘膜，改善毛發(fā)光澤，防止疾病的發(fā)生。因此，D-泛醇作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑，特

2、別適用于醫(yī)藥、食品、化妝品行業(yè)。HOOHCONHCOOHCa2HOOHCONHCOOKPLOOOD-PLOOOH 以近平滑假絲酵母Candida parapsilosis及小紅酵母Rhodotorula minuta為催化劑，葡萄糖作為能源，進(jìn)行還原反應(yīng)，在28，pH46下反應(yīng)兩天，還原率達(dá)到100%，反應(yīng)液中產(chǎn)品D-泛解酸內(nèi)酯的濃度達(dá)到5090 g/L，光學(xué)純度達(dá)到94%98%e.e.。 OOHCOOHKPAD-PLOOOHOHOHCOOHD-PAOOOKPL 與以前面的酮基泛解酸內(nèi)酯還原方法相比較，酮基泛解酸還原方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：酮基泛解酸還原酶的產(chǎn)生菌都屬于Agrobacterium屬，

3、而許多屬的微生物具有酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶的活性。酮基泛解酸還原酶的光學(xué)選擇性很高（98% e.e.以上），而酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶的光學(xué)選擇性與產(chǎn)生該酶的微生物所在屬或者種無(wú)關(guān)。這些結(jié)果表明催化酮基泛解酸還原的酶為單一酶（可能是酮基泛解酸還原酶），而酮基泛解酸內(nèi)酯的還原酶可能是多種具有不同光學(xué)選擇性的還原酶共同作用的。 1.1.3 不對(duì)稱(chēng)氧化和還原兩步酶法轉(zhuǎn)化消旋泛解酸內(nèi)酯 L-PLOHOOOOOKPLOHOOD-PL Nocardia asteroides可以不對(duì)稱(chēng)氧化DL-泛解酸內(nèi)酯中的L-型成酮基泛解酸內(nèi)酯，酮基泛解酸內(nèi)酯又可以由Candida parapsilosis不對(duì)稱(chēng)還原成D-泛解

4、酸內(nèi)酯。在這個(gè)兩步酶催化反應(yīng)體系中，D-型的泛解酸內(nèi)酯始終沒(méi)有被修飾，而是L-型的泛解酸內(nèi)酯經(jīng)過(guò)兩步微生物酶催化，最終變成了D-型。 OOHCOOHKPAD-PLOOOHOHOHCOOHD-PAOOOKPL L-PLOHOOOHOO 可以用來(lái)代替Candida parapsilosis，與Nocardia asteroides共同進(jìn)行反應(yīng)，它可以在酮基泛解酸內(nèi)酯自發(fā)水解為酮基泛解酸后，將其不對(duì)稱(chēng)還原成D-泛解酸，D-泛解酸再酯化得到D-泛解酸內(nèi)酯。這一系列反應(yīng)用洗滌過(guò)的細(xì)胞可在同一生物反應(yīng)器內(nèi)一步轉(zhuǎn)化完成。 OOOHOHOHCOOHOOOH+內(nèi)酯化，消旋化DL-PLL-PAD-PL 用L-立體

5、專(zhuān)一性?xún)?nèi)酯水解酶水解，將L-泛解酸內(nèi)酯水解為L(zhǎng)-泛解酸，可直接得到未水解的D-泛解酸內(nèi)酯。L-泛解酸可以回收，經(jīng)過(guò)消旋化反應(yīng)得到DL-泛解酸內(nèi)酯重新用于拆分。 +消旋化OOOHDL-PLOOOHL-PLOHOHCOOHD-PAOOOHD-PL內(nèi)酯化 用鐮孢霉菌Fusarium等微生物選擇性水解DL-泛解酸內(nèi)酯生成D-泛解酸，分離后的D-泛解酸在酸性條件下加熱，轉(zhuǎn)化為D-泛解酸內(nèi)酯。 D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的串珠鐮孢霉菌Fusarium moniliformeSW-902，用于發(fā)酵生產(chǎn)的菌絲體作酶源，水解DL-泛解酸內(nèi)酯中的D-泛解酸內(nèi)酯，分離得到D-泛解酸，再經(jīng)過(guò)內(nèi)酯化反應(yīng)，可得到很高光學(xué)純度的

6、D-泛解酸內(nèi)酯。該方法不要求水解徹底，反應(yīng)時(shí)間短，得到產(chǎn)品D-泛解酸內(nèi)酯的光學(xué)純度高，工藝控制簡(jiǎn)單，反應(yīng)容易控制，底物的濃度可以很高。此項(xiàng)技術(shù)已在浙江鑫富生化公司實(shí)施產(chǎn)業(yè)化。異丁醛等D-泛酸鈣D-泛醇D-泛解酸內(nèi)酯的酶法拆分工藝流程L-泛解酸內(nèi)酯DL-泛解酸內(nèi)酯異丁醛，甲醛，HCN 消旋化反應(yīng)D-泛解酸微生物酶D-泛解酸內(nèi)酯內(nèi)酯化反應(yīng)orD-泛酸鈣D-泛醇 具有特定功能基團(tuán)的手性醇是用于合成手性藥物和其他手性化學(xué)品重要的中間體。3-氯-1-苯丙醇是一種重要的手性藥物中間體。光學(xué)純的3-氯-1-苯丙醇可用于制備S-(+)-氟西汀，R-(-)-托莫西汀，()-尼索西汀。S-(+)-氟西汀是R-(+

7、)-氟西汀藥效的3倍；R-(-)-托莫西汀是消旋體托莫西汀藥效的2倍，是S-(-)-托莫西汀藥效的9倍。以上三種藥物均為抗抑郁藥，可通過(guò)下圖制備。由由3-氯氯-1-苯丙醇制備手性抗憂郁藥苯丙醇制備手性抗憂郁藥 氟 西 汀氟 西 汀托托莫莫西西西西汀汀汀汀尼尼索索菌種菌種Saccharomyces P2Saccharomyces B5Candida 104Candida 1257產(chǎn)率產(chǎn)率(%)305048100光學(xué)純光學(xué)純度度( ee%)7410010033* A：3-氯-1-苯丙酮（31.166min），B：S-3-氯-1-苯丙醇（42.613min）m in3234363840424446p

8、A10012014016018030ABCA：3-氯-1-苯丙酮（31.166min），C: R-3-氯-1-苯丙醇(44.022min)min303234363840424446pA93.594.595.596.597.5CA3-氯-1-苯丙 酮3-氯-1-苯丙 醇氧化還 原酶乙 醇 乙 醛乙 醇脫氫酶NADHNAD+ strains Reaction conditionAnoxybiotic cultureOxybiotic cultureYield(%)ee(%)yield(%)ee(%)shaking0/50100standing0/28100 Candida 104shaking0/

9、48100standing0/26100Saccharo-myces B5 重復(fù)利用次數(shù)重復(fù)利用次數(shù)Saccharomyces B5Candida 104yield(%)ee(%)yield(%)ee(%)1511004810025010048100350100471004371000/50/0/S- S- - -氰基氰基-3-3-苯氧基芐醇苯氧基芐醇( (S-CPBA )S-CPBA )的合成與應(yīng)用的合成與應(yīng)用OCNOHS-CPBAOCNOHR-CPBAOHOOCNOH+HCNmPBA(S)-CPBAcatalyst3-苯氧基苯甲醛（mPBA）的不對(duì)稱(chēng)羥氰化反應(yīng) 手性金屬?gòu)?fù)合物 生物堿催化

10、多肽催化 醇腈酶（Oxynitrilases）或醇氰裂解酶（hydroxynitrile lyases） 催化劑:3.1 拆分制備S-CPBAS-CPBA的過(guò)程的過(guò)程RCNOH(R,S)-CPBA(S)-CPBAPa-HnlsHCNmPBARCNOHRCNOS-醇腈酶催化拆分合成S-CPBA RCNOH(R,S)-CPBA(S)-CPBARCNOAcRCNOH(R,S)-CPBAc水解酯化Ac2OLipase脂肪酶催化選擇性水解合成S-CPBA RCNOH(R,S)-CPBA(R)-CPBARCNOAcRCNOH(S)-CPBAc+lipaseHOAc 酶催化不對(duì)稱(chēng)酯化拆分合成S-CPBA l

11、ipaseR-OHCNChnRxnOAcOPhCNChnRxnOHOPhCNChnRxnOAcOPh(R,S)-CPBAc(S)-CPBA(R)-CPBAcR-OAc酶催化不對(duì)稱(chēng)醇解合成S-CPBA RHO(R,S)-CPBAmPBARCNOHRCNOAc(S)-CPBAclipaseOHCNAcOanion exchange resink=l=m=n=a=b=Cld=OOe=Oj=OCH2i=h=g=OFf=OFCH3c=CH3O(CH3)2CHCH3(CH2)4其中R為： 化學(xué)-酶催化一鍋化合成S-CPBA lipaseR-OHorganic solventsCNOAcOPhCNOHOPh

12、CNOAcOPh(R,S)-CPBAc(S)-CPBA(R)-CPBAcR-OAc酶反應(yīng)時(shí)間反應(yīng)溶劑底物醇S-CPBAmPBA(mmol/l)Yield%e.e.%2228hrTHF甲醇48.7499.168.97乙醇49.9899.057.68二氯甲烷甲醇35.5998.9530.34乙醇34.8799.1124.11乙醚甲醇50.1396.1317.22乙醇50.7797.6912.432430hrTHF甲醇49.6095.3720.58乙醇46.2296.1515.4氯仿甲醇20.4691.5762.65乙醇21.3892.7355.34甲苯甲醇26.5274.0297.88乙醇20.8

13、775.1992.55OHCH3COOCHCH2OCOCH3CH3CHO+(R, S)(R)Lipase無(wú)溶劑體系酶催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)式 生物催化法制備手性2-芳基丙酸 2-芳基丙酸類(lèi)非甾體抗炎藥(Non-Steroid Anti-Inflamming Drugs，NSAIDs)，是一類(lèi)重要的消炎鎮(zhèn)痛藥，可用化學(xué)通式ArCH(CH3)COOH表示。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有解熱、消炎鎮(zhèn)痛作用的2-芳基丙酸類(lèi)藥物有幾十種，大多數(shù)已經(jīng)工業(yè)化生產(chǎn)。常見(jiàn)的品種有：萘普生(Naproxen)、布洛芬(Ibuprofen)、氟比洛芬(Flurbiprofen)、酮基布洛芬(Ketoprofen)、舒洛芬(Suprofe

14、n)等等。以酮基布洛芬為例，其消炎鎮(zhèn)痛作用比阿司匹林強(qiáng)150倍，解熱作用強(qiáng)100倍，臨床上用于治療慢性類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、變形關(guān)節(jié)炎、外傷和術(shù)后疼痛。 CH3COOHMeOCH3COOHOCH3COOHCH3COOHFSOCH3COOHIbuprofenNaproxenKetoprofenFlurbiprofenSuprofenCOOHR酶催化水解拆分芳基丙酸酯反應(yīng)示意圖酶催化水解拆分芳基丙酸酯反應(yīng)示意圖CH3ArCO2RCH3ArCO2HCH3ArCO2R+脂肪(酯)酶或催化抗體 研究發(fā)現(xiàn)來(lái)源于根霉（Rhizopus）、毛霉（Mucor）和假絲酵母（Candida）屬的胞外脂肪酶均對(duì)不同的萘普生酯

15、具有很高的立體選擇性，且穩(wěn)定性和底物耐受性很高（1mol/L）。 酶催化水解拆分芳基丙腈（酰胺）反應(yīng)示意圖酶催化水解拆分芳基丙腈（酰胺）反應(yīng)示意圖 CNCH3ArCH3ArCOOHCNCH3ArCH3ArCONH2H2OH2ONH3H2ONH3+腈水解酶腈水合酶酰胺酶 其路線主要有兩條：一是用微生物腈水解酶(Nitrilase)直接立體選擇性水解拆分2-芳基丙腈為光學(xué)純的2-芳基丙酸；二是腈水合酶(Nitrile Hydratase)和酰胺酶(Amidase)相結(jié)合立體選擇性水解拆分2-芳基丙腈為光學(xué)純的2-芳基丙酸。酶催化酯化CH3ArCOOHCH3ArCOORCH3ArCOOH+ROH+酶

16、催化酯化反應(yīng)拆分酶催化酯化反應(yīng)拆分2-芳基丙酸反應(yīng)示意圖芳基丙酸反應(yīng)示意圖 來(lái)源于Candida rugosa、Rhizomucor miehei、Candida antarctica等的脂肪酶均可用于2-芳基丙酸酯化的拆分。如Novo公司的Lipozyme 1000L(來(lái)源于Rhizomucor miehei)用于催化(R,S)-布洛芬與辛醇的選擇性酯化反應(yīng)，優(yōu)先選擇(S)-構(gòu)型，對(duì)映選擇率(E)100;不過(guò)對(duì)于酮基布洛芬，優(yōu)先選擇(R)-構(gòu)型，而且E值僅有2.4。 酶催化氧化C H3A rC H2C H2C H3C H3A rC O O H微生物酶催化氧化芳基烷烴制備酶催化氧化芳基烷烴制備

17、(S)-2-芳基丙酸示意圖芳基丙酸示意圖酶催化氧化芳基丙醛制備酶催化氧化芳基丙醛制備(S)-布洛芬布洛芬 CHOCOOH微生物 非水相酶促酯化拆分萘普生的技術(shù)路線非水相酶促酯化拆分萘普生的技術(shù)路線 MeOCOOHMeOCOORMeOCOOHMeOCOOHMeOCOORMeOCOOH+產(chǎn)品分離消旋非水介質(zhì)+ROH, Lipase水解S-萘普生MeOCOOHMeOCOORMeOCOORMeOCOOHMeOCOONaMeOCOOR+酯化lipase，水解分 離有機(jī)相水相消旋化1234 酶促選擇性水解萘普生酯的技術(shù)路線酶促選擇性水解萘普生酯的技術(shù)路線 COOHCOORCOOHCOOHCOORCOOH+

18、ROH, Lipase非水介質(zhì)產(chǎn)品分離水解消旋S-布洛芬非水相酶促酯化拆分布洛芬的技術(shù)路線非水相酶促酯化拆分布洛芬的技術(shù)路線 COOHCOORCOORCOOHCOORCOOH+酯化lipase，水解分 離有機(jī)相水相消旋化1234+ 酶促選擇性水解布洛芬酯的技術(shù)路線酶促選擇性水解布洛芬酯的技術(shù)路線 (S)-布洛芬的提取工藝布洛芬的提取工藝 水解反應(yīng)液鹽酸酸化石油醚提取 水相有機(jī)相丟棄5% NaOH溶液反應(yīng)水相有機(jī)相鹽酸酸化石油醚提取 水相有機(jī)相丟棄S(+)-布洛芬R(-)-布洛芬乙酯布洛芬消旋乙酯 OCOOHOCOOHOCOOROCOOROCOOHOCOOH+ROH, Lipase產(chǎn)品分離水解消

19、旋非水相酶促酯化拆分酮洛芬的技術(shù)路線非水相酶促酯化拆分酮洛芬的技術(shù)路線 乙醇乙醇Novozym 4351,2-二氯丙烷總產(chǎn)率：60%Novozym 4351,2-二氯丙烷OCOOHOCOOEtOCOOHOCOOHOCOOHOCOOHOCOOR(+)-1, (500 g)(-)-2, ee 55% (322 g)(+)-1, ee 77% (209 g)(+)-1, (209 g)(+)-1, ee 38% (418 g)(+)-1, ee 96% (209 g)(-)-2, ee 20% (232 g)大規(guī)模的制備（大規(guī)模的制備（S）-酮基布洛芬酮基布洛芬 OCOOHOCOOROCOOHOCO

20、OROCOONaOCOOR+酯化lipase，水解分離有機(jī)相水相消旋化1234+酶促選擇性水解酮洛芬酯的技術(shù)路線酶促選擇性水解酮洛芬酯的技術(shù)路線 L-苯丙氨酸的酶法制備 苯丙氨酸純品為白色粉末，有苦味，微溶于醇，不溶于苯，熔點(diǎn)283，比旋光D25=34.4（c=1，H2O）。25時(shí)在水中溶解度是2.97g/100g。等電點(diǎn)為pH5.48。NH2COOH結(jié)構(gòu)式： L-苯丙氨酸是人體必需的八種氨基酸之一，作為一種營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑，是配制氨基酸輸液和制劑及氨基酸營(yíng)養(yǎng)食品的主要成份，L-苯丙氨酸目前最大的用途是用于天苯二肽甜味劑的合成，其中阿斯巴甜的世界銷(xiāo)量為4萬(wàn)噸/年。阿斯巴甜以安全、美味、低熱值、高甜度

21、而成為優(yōu)秀的無(wú)糖甜味劑。 苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶酶法 HOOCH2CCOOHH2NHCH2COOHH2NHCH2C COOHOHOOCCH2C COOHOaminotransferaseL-Aspartic acidL-Phenylalanine+H3CCOxaloacetic acidCOOHPyruvic acidOCO2Phenylpyruvate+ 肉桂酸酶法(苯丙氨酸解氨酶（PLA） ) +CHNCH2CHCOOHLNCHCOOHPLA芐基海因酶法橫關(guān)健三等以苯甲醛和海因?yàn)樵虾铣傻玫紻L-芐基海因，在L-海因酶和N氨甲酰水解酶的作用下酶法水解得到L-苯丙氨酸，該路線的關(guān)鍵是前體芐基海因的低

22、成本制備和高活性L-海因酶的篩選。 苯丙酮酸脫氫酶法 以苯丙酮酸為前體，通過(guò)還原性氨化作用合成L-苯丙氨酸。1987年，Asano等人采用從自然界中分離到的尿素芽孢八疊球菌（Sporosurcina ureae）SCRC-R04所生產(chǎn)的高活性苯丙氨酸脫氫酶，與用于輔酶NADH再生的甲酸脫氫酶組成共軛反應(yīng)體系，L-苯丙氨酸產(chǎn)率達(dá)到116g/L，轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到89%。工藝路線示意如下：CH2COCOOH NADH NH4CH2CHCOOHNAHOH2NH2 藥用氨基酸： L-色氨酸、 L-蛋氨酸等 1969年日本千鈾一郎首先在工業(yè)上應(yīng)用固定化氨基?；覆鸱諨L-氨基酸獲得成功。被稱(chēng)為酶工程的開(kāi)始。

23、有些氨基酸發(fā)酵法很難，酶工程方法是目前推崇的方法天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化轉(zhuǎn)氨反應(yīng)生產(chǎn)L-苯丙氨酸 以苯丙酮酸和L-天門(mén)冬氨酸為原料，用天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，生成 L-苯丙氨酸和草酰乙酸，草酰乙酸脫羧生成丙酮酸和二氧化碳。反應(yīng)式右圖。 L-天冬氨酸天冬氨酸 E.coli SW0209-31酶法制備D-氨基酸 （1）多肽抗生素 LLDLDLDLDLDLDLHCONHValGlyAlaLeuAlaValValValTrpLeuLeuTrpTrpLeuTrpNOH短桿菌肽 A CysD-PheSSCysPheD-TrpLysThrThr生長(zhǎng)抑制素八肽類(lèi)似物(oxtreotide)，用于治療VIP瘤、類(lèi)

24、癌綜合癥及胃泌素瘤等CysPheSSCysD-TrpLysThrThrH(D)OL( 醇) 醋酸奧曲肽(sandostatin acetate，商品名：善得定),用于治療肢端肥大癥、胰瘺、腫瘤激素性腹瀉的肽激素分泌失調(diào)、非腫瘤性腹瀉，治療胃切除后發(fā)生的腹瀉綜合癥。 半合成抗生素 以D-HPG或D-PG為側(cè)鏈的半合成抗生素，因其肽鍵很難被-內(nèi)酰胺酶作用從而具有較高的穩(wěn)定性，而且具有抗菌譜廣、毒性小、過(guò)敏性低、吸收快、血濃度高、藥力持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、口服效果好等遠(yuǎn)優(yōu)于青霉素G的藥理性能。 肽類(lèi)甜味劑具有很高的商業(yè)價(jià)值。目前市售的天苯二肽（商品名阿斯巴甜，aspartame）是一種優(yōu)良的甜味劑，其甜度為蔗

25、糖的200倍，適用于肥胖癥、糖尿病和心血管病人食用。但它不適合苯丙酮酸尿患者，并且對(duì)酸堿和溫度穩(wěn)定性差，限制了其在食品領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。由D-Ala與L-Asp反應(yīng)合成得到的天丙二肽（商品名阿力甜，alitame），其甜度為蔗糖的2,000倍，且對(duì)熱和酸堿穩(wěn)定，可廣泛適用于食品工業(yè)、日用化學(xué)工業(yè)作甜味劑，具有極好的市場(chǎng)前景。1983年由Brennan T.M.獲得的阿力甜的美國(guó)專(zhuān)利，目前已在澳大利亞、新西蘭等國(guó)獲準(zhǔn)應(yīng)用、上市。 ?；阜?NH2HRCOOHHNH2RCOOH(CH3C)2OOCH3CONHHRCOOHHNHCCH3ORCOOHNH2HRCOOHHNHCCH3ORCOOHHNH2RCOOHL-AAD-AA酰化酶D或L-AA消 旋化氨 基酸乙?；a(chǎn) 物 容易分離的混 合 物 水解L或D-AAL或D的乙?；疉A ?；覆鸱窒被岬倪^(guò)程 Tripathi等研究了從Alcaligenes denitrificans和Alcaligenes faecalis中誘導(dǎo)產(chǎn)生D-氨基酸?；?，利用培養(yǎng)產(chǎn)生的完整細(xì)胞可將各種N-乙酰-D-氨基酸轉(zhuǎn)化為D-Met、D-Val、D-Phe和D-Leu。羧肽酶法 RCHOHCNNH3RCHCNNH2RCHCON