微生物感染的病原學(xué)檢查法參考模板

1、微生物感染的病原學(xué)檢查法文 / 張力平微生物感染的病原學(xué)檢查可查明標(biāo)本中的病原微生物并對(duì)其進(jìn)行種屬鑒定，必要時(shí)進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)和毒力檢查等，從而協(xié)助醫(yī)生對(duì)感染性疾病進(jìn)行病因?qū)W診斷、指導(dǎo)合理用藥或觀察治療效果。微生物感染的病原學(xué)實(shí)驗(yàn)室診斷方法大致包括：光學(xué)顯微鏡對(duì)標(biāo)本或組織中的病原體的形態(tài)學(xué)檢查；病原體的分離培養(yǎng)和鑒定；用免疫學(xué)技術(shù)對(duì)病原體抗原或相應(yīng)抗體的檢測(cè)；用分子生物學(xué)方法對(duì)病原體特異性基因的檢測(cè)。標(biāo)本的采集與送檢 微生物學(xué)檢查的第一步，方法的正確與否直接影響病原體的檢出率，因此應(yīng)注意下述原則：1采集標(biāo)本時(shí)應(yīng)無(wú)菌操作，盡量避免污染；盛放標(biāo)本的容器和培養(yǎng)基應(yīng)預(yù)先進(jìn)行無(wú)菌處理并貼好標(biāo)簽。2應(yīng)選擇

2、感染部位或病變明顯的部位采集標(biāo)本，避免周圍組織、器官或分泌物中的雜菌污染。例如感染性傷口，應(yīng)從其深部而不是從表面采集標(biāo)本；若采集齦溝液檢查口腔厭氧菌，應(yīng)將無(wú)菌濾紙條深入齦溝中，停留數(shù)秒后取出；懷疑細(xì)菌性痢疾時(shí)，應(yīng)采集有粘液或膿血的糞便；采集病毒的標(biāo)本應(yīng)盡量含有感染的細(xì)胞。3根據(jù)病原體在感染性疾病的不同時(shí)期的體內(nèi)分布和排出部位選擇在最佳時(shí)間采集適宜標(biāo)本。例如，可疑傷寒的病人，在病程的12周內(nèi)取血液，23周時(shí)則取糞便或尿液送檢；懷疑流行性腦膜炎的病人，應(yīng)選取腦脊液、血液或皮膚上的出血淤斑進(jìn)行檢測(cè)；如果進(jìn)行病毒培養(yǎng)或其抗原檢測(cè)，一般應(yīng)取急性期標(biāo)本，標(biāo)本采集越早，病毒的陽(yáng)性檢出率越高。4對(duì)于懷疑細(xì)菌感

3、染的標(biāo)本，盡量在抗生素使用前采集，特別是對(duì)抗生素敏感的病原體，如乙型溶血性鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌。病毒對(duì)抗生素不敏感，故無(wú)此限制。而且用于病毒分離培養(yǎng)的標(biāo)本應(yīng)加入抗生素，以避免在病毒培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染。5檢查病原體的特異性抗體IgG時(shí)，應(yīng)采集急性期和恢復(fù)期雙份血清，只有當(dāng)恢復(fù)期血清抗體效價(jià)比急性期的效價(jià)明顯升高達(dá)4倍或以上時(shí)，方有診斷價(jià)值。檢測(cè)血清特異性抗體的標(biāo)本應(yīng)保存在-20。6標(biāo)本采集后應(yīng)及時(shí)送檢。大多數(shù)細(xì)菌標(biāo)本應(yīng)冷藏送檢，但是某些細(xì)菌，如腦膜炎奈瑟菌對(duì)低溫和干燥極其敏感，應(yīng)注意保溫，盡量床旁接種，并預(yù)溫相應(yīng)的培養(yǎng)基。病毒在室溫中易于滅活，應(yīng)立即接種；如需運(yùn)送，以4為宜；若需保存較長(zhǎng)時(shí)間，

4、加入適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑如甘油或二甲基亞砜后，放入-70保存。第一節(jié) 細(xì)菌感染的微生物學(xué)檢查法醫(yī)生根據(jù)臨床上診斷和治療的需要選擇不同的標(biāo)本和檢查方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，從而鑒定出感染的病原菌。實(shí)驗(yàn)室診斷包括細(xì)菌學(xué)診斷，即檢測(cè)及鑒定病原菌；檢測(cè)病原菌成分（抗原和核酸）以及檢測(cè)患者血清中特異性抗體（圖8-1）。圖8-1 細(xì)菌感染的實(shí)驗(yàn)診斷方法一、細(xì)菌學(xué)診斷形態(tài)學(xué)檢查 光鏡下可觀察直接涂片或分離培養(yǎng)的細(xì)菌形態(tài)（包括染色標(biāo)本和不染色標(biāo)本），直接涂片染色只對(duì)特定樣品中的細(xì)菌有診斷價(jià)值。如在患者膿性腦脊液或淤血點(diǎn)中的白細(xì)胞內(nèi)檢出革蘭染色陰性的雙球菌即可診斷為流行性腦膜炎；在生殖器官病變部位的標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)革蘭染色陰性的雙

5、球菌，結(jié)合臨床癥狀即可初步診斷為淋病奈瑟菌感染。但很多細(xì)菌的形態(tài)和染色性缺乏明顯特征，僅憑形態(tài)學(xué)不能做確切的診斷，需經(jīng)細(xì)菌的分離培養(yǎng)，甚至純培養(yǎng)后，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行生化和血清學(xué)鑒定，方能明確感染的細(xì)菌。不染色標(biāo)本主要用于檢查細(xì)菌的動(dòng)力，如在鏡下觀察標(biāo)本有無(wú)“魚群”樣排列、運(yùn)動(dòng)活潑的細(xì)菌，可對(duì)霍亂弧菌進(jìn)行初步診斷。1細(xì)菌染色檢查法 主要包括革蘭染色、抗酸染色和熒光染色后光鏡檢查。（1）革蘭染色法（Gram stain）：是在1884年由革蘭（Hans Christian Gram）發(fā)明的，它一直是對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類鑒別的最常用染色方法。（2）抗酸染色法（acid-fast stain）：是鑒定結(jié)核和麻風(fēng)等

6、分枝桿菌屬細(xì)菌的重要方法。細(xì)菌經(jīng)涂片、干燥和固定后，先用5%石炭酸復(fù)紅初染，細(xì)菌被染成紅色，然后用3%鹽酸酒精脫色，由于分枝桿菌細(xì)胞壁富含脂類物質(zhì)，一旦著色，鹽酸酒精難以將其脫色，故為抗酸染色陽(yáng)性（紅色）。而一般的細(xì)菌容易脫色，再經(jīng)美蘭復(fù)染呈現(xiàn)藍(lán)色。若在痰液中檢出抗酸染色陽(yáng)性的桿狀細(xì)菌，則可診斷患者有結(jié)核分枝桿菌的感染。用金胺對(duì)結(jié)核桿菌進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下可觀察到呈金黃色熒光的菌體，此法可提高結(jié)核分枝桿菌的檢出率。另外，有一些特殊的染色方法可將細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)，如細(xì)菌的鞭毛、莢膜和芽胞進(jìn)行染色。2暗視野檢查（darkfield examination） 在普通光鏡上配置特制的暗視野聚光器即成

7、暗視野顯微鏡，其反光鏡反射過(guò)來(lái)的光線不能進(jìn)入鏡筒，使背景視野變暗。而光線只能從暗視野聚光器周圍邊緣斜射到菌體上，由于散射作用而使菌體發(fā)光，反射到物鏡映入眼中。因此在暗視野中可看到發(fā)亮的細(xì)菌。本方法易于觀察不染色活菌，故常用于檢查活菌、螺旋體及其動(dòng)力。病原菌的分離培養(yǎng) 原則上應(yīng)對(duì)所有送檢標(biāo)本做分離培養(yǎng)，以便獲得單個(gè)菌落后進(jìn)行純培養(yǎng)，從而對(duì)細(xì)菌做進(jìn)一步的生物學(xué)、免疫學(xué)、致病性或細(xì)菌的藥物敏感性等方面的檢查，最終做出確切的報(bào)告。細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)應(yīng)選擇適宜的培養(yǎng)基，以便提供特定細(xì)菌生長(zhǎng)所需的必要條件，例如，培養(yǎng)基的成分和pH、培養(yǎng)的時(shí)間、溫度等，應(yīng)給厭氧菌提供一個(gè)厭氧環(huán)境。分離培養(yǎng)后根據(jù)菌落的大小、形態(tài)、顏

8、色、表面性狀、透明度和溶血性等對(duì)細(xì)菌做出初步的識(shí)別。同時(shí)取單個(gè)菌落再次進(jìn)行革蘭染色并鏡下觀察。另外，在液體培養(yǎng)基中細(xì)菌的沉淀、渾濁或表面生長(zhǎng)狀態(tài)以及在半固體培養(yǎng)基上是否檢出細(xì)菌的動(dòng)力，均為細(xì)菌的鑒定提供有用的信息。生化試驗(yàn) 在得到細(xì)菌純培養(yǎng)物后，用糖發(fā)酵試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)等對(duì)細(xì)菌的酶系統(tǒng)和其代謝產(chǎn)物的檢查，是鑒別細(xì)菌的重要方法之一。特別是有些細(xì)菌，例如腸道感染的細(xì)菌一般為革蘭陰性菌，它們的染色性、鏡下形態(tài)和菌落特征基本相同，因此有必要經(jīng)細(xì)菌的分離培養(yǎng)后用生化試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。但其步驟繁雜耗時(shí)。隨著現(xiàn)代化技術(shù)的發(fā)展，細(xì)菌檢測(cè)的技術(shù)水平也不斷地提高，正在逐步實(shí)現(xiàn)快速化、微量化、自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)

9、化?，F(xiàn)在國(guó)內(nèi)大醫(yī)院已引進(jìn)檢測(cè)細(xì)菌生化反應(yīng)的商品化試劑盒和多種微量、快速、半自動(dòng)或全自動(dòng)的細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，一般24小時(shí)內(nèi)即可完成從微量培養(yǎng)細(xì)菌、自動(dòng)監(jiān)測(cè)、記錄到打印出結(jié)果的全過(guò)程，能準(zhǔn)確鑒定出一般醫(yī)院常見的致病菌，而且適用于難以培養(yǎng)細(xì)菌的鑒定以及藥物敏感試驗(yàn)。血清學(xué)鑒定 利用含已知的特異性抗體的免疫血清，如志賀菌屬、沙門菌屬的單價(jià)和多價(jià)診斷血清，檢測(cè)未知細(xì)菌的抗原，不僅能對(duì)分離培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行種的鑒定，還可以進(jìn)一步對(duì)細(xì)菌進(jìn)行群和型的鑒別。常用方法是玻片凝集試驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 一般不作為臨床標(biāo)本的細(xì)菌學(xué)常規(guī)檢查技術(shù)，但對(duì)測(cè)定細(xì)菌的毒力或致病性有重要意義，故可選敏感動(dòng)物用于疑難的病原菌分離或微生物學(xué)的研究。

10、常用于病原菌檢查的動(dòng)物有小鼠、豚鼠和家兔等。根據(jù)細(xì)菌致病性選擇接種途徑，有皮內(nèi)、皮下、腹腔、靜脈、腦內(nèi)、鼻腔和灌胃等?，F(xiàn)在，用家兔對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素或熱原質(zhì)的檢測(cè)已被鱟試驗(yàn)（limulus tests）替代。毒力檢測(cè) 細(xì)菌毒力依其侵襲力和產(chǎn)生毒素不同而強(qiáng)弱不一，可經(jīng)灌胃、腹腔、靜脈或皮下注射等途徑在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)測(cè)定，一般以半數(shù)致死量（median lethal dose，LD50）或半數(shù)感染量（median infective dose，ID50）來(lái)表示，即在一定時(shí)間內(nèi)，通過(guò)一定的途徑，使一定體重的某種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物半數(shù)死亡或感染的最小毒素量或最少細(xì)菌數(shù)。也可在體外用Elek平板等方法檢測(cè)細(xì)菌毒素，如白喉

11、毒素或腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌腸毒素的檢測(cè)。藥物敏感試驗(yàn)（Antimicrobial susceptibility testing） 在已確定患者所感染的病原菌后，臨床按常規(guī)用藥又沒有明顯療效的時(shí)候，有必要做藥物敏感試驗(yàn)（簡(jiǎn)稱藥敏試驗(yàn)），在體外測(cè)定藥物抑制或殺死細(xì)菌的能力，從而指導(dǎo)臨床的正確有效地用藥。特別是近年來(lái)隨著抗菌藥物的廣泛使用，耐藥菌株逐漸增多，在必要時(shí)進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)是十分重要的。其方法有紙碟法、試管法、小杯法和凹孔法等。其中紙碟法和試管法是常用的方法。前者依據(jù)藥紙片周圍是否出現(xiàn)抑菌圈及其大小，后者則憑借觀察抑菌或殺菌藥物濃度來(lái)判斷細(xì)菌對(duì)某一藥物的敏感或耐藥程度。在藥敏試驗(yàn)中，最低抑菌濃度（

12、minimum inhibitory concentration，MIC）是能夠抑制培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度；最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）是指能夠殺滅培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)菌的最低藥物濃度。MIC和MBC的值越低，表示細(xì)菌對(duì)該藥越敏感。殺菌性藥物的抑菌和殺菌濃度相等或相近，但抑菌性藥物即使在很高的濃度下也無(wú)殺菌作用?，F(xiàn)在已有檢測(cè)藥物敏感試驗(yàn)的全自動(dòng)儀器。二、檢測(cè)病原菌成分抗原的檢測(cè) 多種免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)可用于細(xì)菌抗原的檢測(cè)。其原理是用已知的特異性抗體檢測(cè)未知的細(xì)菌抗原成分。常用的方法有玻片凝集試驗(yàn)、協(xié)同凝集試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)

13、、對(duì)流免疫試驗(yàn)、酶免疫技術(shù)、免疫熒光技術(shù)和同位素標(biāo)記技術(shù)等。這些試驗(yàn)特異、敏感、簡(jiǎn)便，即使是在采集樣品前患者使用了抗生素，對(duì)細(xì)菌的培養(yǎng)不易成功，但細(xì)菌的抗原仍能被檢測(cè)出來(lái)。因此抗原的檢測(cè)是檢查病原菌的常用技術(shù)，可直接使用臨床標(biāo)本或在細(xì)菌分離培養(yǎng)后進(jìn)行。核酸的檢測(cè) 傳統(tǒng)的微生物學(xué)鑒定技術(shù)主要根據(jù)微生物形態(tài)學(xué)和生化等表型特征來(lái)進(jìn)行。但有些試驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高或難以順利完成。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，多種檢測(cè)病原菌核酸的實(shí)驗(yàn)技術(shù)已經(jīng)被建立。這不但能有助于感染性疾病的確診，還能確定病原菌的基因型，使微生物學(xué)的檢測(cè)技術(shù)從細(xì)菌生物學(xué)檢查進(jìn)展到細(xì)菌分子生物學(xué)的鑒定。一般而言，分子生物學(xué)診斷技術(shù)常用于檢測(cè)不能在

14、體外培養(yǎng)或目前的培養(yǎng)技術(shù)不敏感、費(fèi)用高昂或耗時(shí)長(zhǎng)的病原體。目前常用的方法主要有核酸雜交（nucleotide hybridization）和聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）等（圖8-2）。圖8-2 細(xì)菌感染的基因診斷技術(shù)1核酸雜交技術(shù) 核酸分子雜交是根據(jù)DNA雙螺旋分子的堿基互補(bǔ)原理而設(shè)計(jì)的。將病原體特異的基因序列合成并標(biāo)記作為探針，與待檢標(biāo)本中的核酸進(jìn)行雜交，若待檢標(biāo)本中有與探針序列完全互補(bǔ)的核酸片段，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則，探針和相對(duì)應(yīng)的核酸片段互相結(jié)合，標(biāo)記有化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、辣根過(guò)氧化物酶、地高辛或放射性物質(zhì)的探針經(jīng)不同的方法即可被檢測(cè)出來(lái)，使標(biāo)本中有無(wú)

15、相應(yīng)的病原體基因及其分子大小顯示出來(lái)。核酸雜交技術(shù)包括Southern印跡雜交（Southern blot）、Northern印跡雜交（Northern blot）、斑點(diǎn)雜交（dot blot）和原位雜交（in situ hybridization，ISH）等。Southern印跡雜交也稱為DNA 印跡雜交，是確定特異DNA片段的方法。將經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA在瓊脂糖凝膠中電泳，并轉(zhuǎn)移到固相支持物，如硝酸纖維素膜（nitrocellulose membrane，NC膜）或尼龍膜上，用同位素等方法標(biāo)記的探針與之雜交，通過(guò)放射自顯影或顯色反應(yīng)檢出已與探針DNA雜交的區(qū)帶。Northern印跡法

16、又稱為RNA 印跡雜交，原理與Southern相似，但用于檢測(cè)RNA。原位雜交是將細(xì)胞或組織固定在玻片上，然后檢查其中是否有與特異性探針相結(jié)合的目的基因。這種方法能進(jìn)行定位診斷。這些技術(shù)同時(shí)具備了堿基互補(bǔ)的高度特異性和標(biāo)記技術(shù)的敏感性，其敏感性已經(jīng)達(dá)到0.05pg/?l水平。由于它們具有快速、敏感、特異以及樣本量少的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已將此技術(shù)應(yīng)用于診斷結(jié)核分枝桿菌、軍團(tuán)菌、幽門螺桿菌、空腸彎曲菌和致病性大腸埃希菌等致病菌。2PCR 是1985年首先由Kary Mullis建立的一種選擇性DNA或RNA體外合成放大技術(shù)。其基本原理是根據(jù)細(xì)胞分裂中DNA半保留復(fù)制機(jī)理，在體外用一對(duì)寡聚DNA作為引物，通過(guò)

17、加溫退火DNA合成等幾個(gè)步驟的重復(fù)多次循環(huán)，使目的DNA片段得到擴(kuò)增。鑒于這種擴(kuò)增產(chǎn)物是以指數(shù)形式積累的，經(jīng)2030個(gè)循環(huán)后，目的基因的擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)106。經(jīng)瓊脂糖電泳，可顯示出一條特定的DNA區(qū)帶，與對(duì)照比較可做出鑒定。PCR技術(shù)整個(gè)循環(huán)過(guò)程需在特殊的DNA擴(kuò)增儀進(jìn)行，僅需要幾個(gè)小時(shí)，因此具有快速、敏感、特異和簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。PCR經(jīng)常在下列情況用于病原體的檢查：形態(tài)和生化反應(yīng)不典型的病原微生物的鑒定；解決混合標(biāo)本問(wèn)題：當(dāng)病原菌與大量正常菌群成員混合在一起時(shí)，分離鑒定耗時(shí)費(fèi)力，用PCR技術(shù)克服了上述問(wèn)題，目前已用于腸道病原菌的快速診斷；生長(zhǎng)緩慢或難于培養(yǎng)的病原體鑒定：如幽門螺桿菌、分枝桿菌和病毒

18、等；難以鑒定的病原體診斷，如淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、肝炎病毒、人乳頭瘤病毒（HPV）等。腦膜炎奈瑟菌感染病情進(jìn)展迅速，用細(xì)菌培養(yǎng)方法耗時(shí)且檢出率低，用PCR技術(shù)可快速檢出腦脊液中的特異DNA，因此PCR可作為流行性腦膜炎病原學(xué)的快速診斷方法。但應(yīng)注意的是，由于PCR技術(shù)的敏感性極高，極微量的污染即可造成非特異性擴(kuò)增，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。所以要嚴(yán)格操作，消除污染。現(xiàn)在已有實(shí)時(shí)PCR技術(shù)（real-time PCR）可以檢測(cè)出病原微生物核酸的拷貝數(shù)，從而進(jìn)行細(xì)菌定量。三、抗體的檢測(cè)病原菌侵入機(jī)體后，其抗原性物質(zhì)能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。存在于血液或其他體液中的特異性抗體，常隨病程的進(jìn)展發(fā)生變化。

19、用已知細(xì)菌或其抗原檢測(cè)病人體內(nèi)是否產(chǎn)生了相應(yīng)的特異性抗體及其量的多少，可作為某些病原菌感染的輔助診斷。因需采集病人的血清進(jìn)行此類試驗(yàn)，故稱之為血清學(xué)診斷（serological diagnosis）。常用的血清學(xué)試驗(yàn)包括：玻片或試管凝集試驗(yàn)、沉淀試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和冷凝集試驗(yàn)等，可根據(jù)病原菌的種類加以選擇。血清學(xué)診斷一般適用于病程較長(zhǎng)和抗原性較強(qiáng)的病原菌引起的感染。若以血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果作為診斷依據(jù)時(shí)，應(yīng)在急性期和恢復(fù)期各取一份血清同時(shí)檢測(cè)，恢復(fù)期血清效價(jià)明顯升高4倍或以上時(shí)方有診斷價(jià)值。用血清學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)特異性抗體對(duì)感染性疾病的診斷有兩方面的局限：在疾病的早期，抗體難以檢測(cè)出來(lái)，因此難以作為早期診

20、斷的依據(jù)；當(dāng)抗體水平升高時(shí)，很難找出抗體效價(jià)與病情之間的關(guān)系。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù)也不斷提高，同位素技術(shù)、氣相色譜技術(shù)和電阻抗技術(shù)等也已開始應(yīng)用于細(xì)菌的檢查和研究。第二節(jié) 病毒感染的微生物學(xué)檢查法經(jīng)典的病毒學(xué)檢查方法包括病毒分離鑒定和血清學(xué)診斷（抗體的檢測(cè)）。由于分子病毒學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展，近年來(lái)又建立了許多診斷方法，包括電鏡直接觀察形態(tài)、檢查病毒抗原、核酸等，使得病毒感染的快速診斷成為可能（圖8-3）。圖8-3 病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法一、形態(tài)學(xué)檢查電子顯微鏡（electromicroscopy，EM） 能觀察病毒顆粒的形態(tài)和大小。對(duì)含有高濃度的病毒顆粒（107病毒/ml）的

21、樣品，可直接用電鏡進(jìn)行觀察。對(duì)含量少的樣品可用免疫電鏡法（immunoelectromicroscopy，IEM）檢查。即先將標(biāo)本與特異性血清混合，使病毒顆粒凝聚，再進(jìn)行電鏡觀察，可提高檢出率，例如甲型肝炎病毒、輪狀病毒感染的糞便標(biāo)本、人類免疫缺陷病毒（HIV）和乙型肝炎病毒（HBV）感染者的血清標(biāo)本等均可采用此法查出典型形態(tài)的病毒顆粒。光學(xué)顯微鏡 能觀察病毒感染細(xì)胞內(nèi)的病理變化，如包涵體或多核巨細(xì)胞等。有些病毒感染細(xì)胞后，在細(xì)胞漿或胞核內(nèi)會(huì)出現(xiàn)用光學(xué)顯微鏡可觀察到的圓形或橢圓形的斑塊，稱為包涵體（inclusion body）。在多數(shù)情況下，包涵體是由大量病毒在細(xì)胞內(nèi)合成堆積而形成。包涵體的

22、位置（胞漿內(nèi)或核內(nèi)）和經(jīng)Giemsa染色表現(xiàn)的嗜酸性或嗜堿性的不同對(duì)某些病毒性疾病的診斷有重要意義。如狂犬病病毒感染后可在腦神經(jīng)細(xì)胞漿中檢出嗜酸性包涵體，稱為內(nèi)基小體（Negri body），可輔助診斷狂犬?。▓D35-3）。二、病毒的分離培養(yǎng)的方法病毒的分離用于：有新的流行發(fā)生時(shí)，如流感；不能應(yīng)用血清學(xué)診斷時(shí)；一種臨床疾病可被多種病原體引起時(shí)，例如無(wú)菌性腦膜炎可被多種病毒引起；呼吸系統(tǒng)疾病綜合征可被多種病毒、支原體或其他病原體感染引起。病毒必須在敏感的活細(xì)胞內(nèi)增殖，所以應(yīng)使用易感的活細(xì)胞對(duì)病毒進(jìn)行分離培養(yǎng)和鑒定。其方法包括動(dòng)物接種、雞胚培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)。動(dòng)物接種 動(dòng)物接種是最原始的分離病毒的方法

23、，但是現(xiàn)在已經(jīng)很少用于臨床實(shí)驗(yàn)室。目前仍然使用的是小白鼠腦內(nèi)接種對(duì)狂犬病病毒或乙型腦炎病毒的分離和鑒定。雞胚培養(yǎng) 不同日齡（914日）的雞胚經(jīng)不同的接種途徑可用于不同病毒的培養(yǎng)。如絨毛尿囊膜接種常用于痘病毒和單純皰疹病毒的培養(yǎng)，病毒繁殖后有痘斑的形成；卵黃囊用于某些嗜神經(jīng)病毒及衣原體的培養(yǎng)；羊膜腔接種用于流感病毒初次分離培養(yǎng)；尿囊腔接種常用于流感病毒和腮腺炎病毒等的培養(yǎng)。收獲尿囊液或羊水等做血凝試驗(yàn)可作為含血凝素病毒生長(zhǎng)繁殖的指標(biāo)。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的成熟和廣泛應(yīng)用，雞胚接種已經(jīng)少用，但仍然是培養(yǎng)流感病毒最敏感、特異的方法。組織培養(yǎng) 包括三種類型：器官培養(yǎng)（organ culture）、組織培養(yǎng)

24、（tissue culture）和細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture）。細(xì)胞培養(yǎng)是病毒研究、檢測(cè)以及疫苗制備的一個(gè)重要技術(shù)，在病毒學(xué)發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了相當(dāng)重要的作用。用于病毒分離培養(yǎng)的細(xì)胞主要有原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞和傳代細(xì)胞系。1原代細(xì)胞培養(yǎng) 原代細(xì)胞是由新鮮組織（動(dòng)物、雞胚或人胚組織）制備的單層細(xì)胞，對(duì)多種病毒的敏感性高。原代恒河猴腎細(xì)胞是培養(yǎng)腸道病毒、正粘病毒和副粘病毒等的常用細(xì)胞。但由于制備不方便，一般只能傳23代，故逐漸少用。2二倍體細(xì)胞培養(yǎng) 在傳代過(guò)程中保持二倍體性質(zhì)（46條染色體），一般能傳4050代，例如人胚肺成纖維細(xì)胞。二倍體細(xì)胞可用于多種病毒的分離和疫苗的制備。3傳代細(xì)胞培養(yǎng)

25、傳代細(xì)胞是能在體外持續(xù)傳代的單細(xì)胞，由突變的二倍體細(xì)胞傳代或人及動(dòng)物腫瘤細(xì)胞建立的。使用和保存方便，但不能用于疫苗的生產(chǎn)。常用于分離病毒的傳代細(xì)胞有：HeLa（子宮頸癌）細(xì)胞、Hep-2（人喉上皮癌）細(xì)胞、KB（鼻咽上皮癌）細(xì)胞和Vero（傳代非洲綠猴腎）細(xì)胞等。三、病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖的鑒定指標(biāo)將含有病毒的標(biāo)本接種在敏感的單層細(xì)胞，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，根據(jù)不同病毒的特性選擇不同的鑒定方法。細(xì)胞病變（cytopathy） 大多數(shù)病毒在敏感細(xì)胞內(nèi)增殖后，會(huì)引起細(xì)胞病變，稱細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）（圖8-4）。CPE可表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、溶解、脫落、融合、形成包涵體，甚至死亡

26、。圖8-4 細(xì)胞病變效應(yīng)A：未感染病毒的HeLa細(xì)胞；B：被柯薩奇病毒B3感染后，細(xì)胞變圓、皺縮，細(xì)胞折光性減弱；C：被腺病毒感染后，細(xì)胞腫脹，折光性增強(qiáng)，呈葡萄狀排列。?200 （李呼倫提供）不同病毒引起細(xì)胞的病變不同，例如：副粘病毒、皰疹病毒和合胞病毒等引起細(xì)胞融合；腺病毒引起Hep-2細(xì)胞圓縮；呼吸道合胞病毒引起Hep-2細(xì)胞融合，形成多核巨細(xì)胞。因此觀察細(xì)胞病變的情況是檢測(cè)病毒的常用方法。根據(jù)選擇的細(xì)胞類型、細(xì)胞病變的種類可對(duì)標(biāo)本中感染的病毒進(jìn)行判定。但是應(yīng)當(dāng)指出，有些病毒雖然在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖，但是卻不引起明顯的細(xì)胞病變。根據(jù)有無(wú)細(xì)胞病變來(lái)判斷病毒感染性和毒力的指標(biāo)是50%組織細(xì)胞感染

27、量（50% tissue culture infectious dose，TCID50）。該方法是將待測(cè)病毒作10倍系列稀釋，分別接種細(xì)胞，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，觀察CPE等指標(biāo)，以最高稀釋度能感染50%細(xì)胞的量為終點(diǎn)。用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算出TCID50。紅細(xì)胞吸附（hemadsorption） 有些病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的同時(shí)，病毒或其血凝素會(huì)出現(xiàn)于感染細(xì)胞膜上，使感染細(xì)胞能與紅細(xì)胞結(jié)合，稱之為紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。這是檢測(cè)正粘病毒和副粘病毒的間接指標(biāo)。如流感病毒在感染細(xì)胞后不出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，但其血凝素會(huì)出現(xiàn)在感染細(xì)胞上。在細(xì)胞培養(yǎng)中加入紅細(xì)胞后，后者會(huì)吸附在被感染的細(xì)胞上。紅細(xì)胞凝集（hemagglutin

28、ation） 某些病毒感染細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)增殖后，從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)。如果這些病毒具有血凝素（hemagglutinin，HA），用細(xì)胞培養(yǎng)上清液與紅細(xì)胞作用，則可出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。這也是一種檢測(cè)含血凝素病毒的方法。病毒干擾作用（viral interference） 有些病毒感染細(xì)胞后，不產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變，但是可干擾感染同一細(xì)胞的另一種病毒的正常增殖，稱為干擾作用。此法可用于檢測(cè)風(fēng)疹病毒。風(fēng)疹病毒在感染猴腎細(xì)胞后，不產(chǎn)生細(xì)胞病變，但可抑制隨后接種的埃可病毒11型在細(xì)胞培養(yǎng)中的正常增殖。而埃可病毒單獨(dú)感染猴腎細(xì)胞則可出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變。中和試驗(yàn)（neutralization test，NT）

29、將已知的抗病毒血清先與病毒懸液混合在一起，在一定溫度條件下作用一定時(shí)間后，接種于敏感細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，觀察病毒致細(xì)胞病變作用或紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象是否消失。這是比較可靠的病毒診斷方法。空斑形成試驗(yàn)（plaque formation） 是測(cè)定病毒數(shù)量的一個(gè)方法。將適宜濃度的病毒接種于敏感的單層細(xì)胞培養(yǎng)中，經(jīng)一定時(shí)間的培養(yǎng)后，在其上方覆蓋一層融化的瓊脂。繼續(xù)培養(yǎng)后，單個(gè)病毒的復(fù)制增殖使局部的單層細(xì)胞脫落，形成肉眼可見的空斑（plaque），經(jīng)染色后更加明顯。一個(gè)空斑是一個(gè)病毒大量復(fù)制而成。因此，可通過(guò)計(jì)算空斑數(shù)推算出該樣品中病毒的含量。通常以每毫升病毒懸液的空斑形成單位表示（pfu/ml）。該技術(shù)可以用于病

30、毒濃度的精確定量和測(cè)定抗病毒藥物的作用。四、病毒成分的檢測(cè)病毒抗原的檢測(cè) 一般采用免疫學(xué)技術(shù)進(jìn)行病毒抗原的檢測(cè)，用已知的病毒特異性抗體來(lái)檢測(cè)可疑標(biāo)本是否含有病毒的抗原。例如：檢測(cè)HIV和HBV抗原。此類技術(shù)操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、敏感性高、待檢樣品中不必有完整的病毒體存在，可以節(jié)省分離鑒定病毒的時(shí)間和繁雜的實(shí)驗(yàn)步驟，特別是對(duì)于一些血清型別有限的、難以用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)的病毒，更是一個(gè)快速而實(shí)用的方法。只要具有較高質(zhì)量的特異性抗體，標(biāo)本中存在一定量的病毒抗原，可在幾小時(shí)到1天的時(shí)間內(nèi)完成其檢測(cè)。經(jīng)常使用的診斷試劑是單克隆抗體，目前常用的技術(shù)是熒光標(biāo)記技術(shù)、酶標(biāo)記技術(shù)（如enzyme linked

31、 immunosorbent assay，ELISA）或放射免疫標(biāo)記技術(shù)。其中ELISA一般用辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶作為標(biāo)記物，聚苯乙烯微孔板、試管、有機(jī)小球等作為固相支持物，試驗(yàn)通過(guò)顏色的改變反映標(biāo)本中是否存在病毒抗原或其量的多少。本實(shí)驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)便、價(jià)格便宜、比免疫熒光技術(shù)敏感，沒有放射性污染，因而是最為廣泛被應(yīng)用的一個(gè)實(shí)驗(yàn)室方法。病毒核酸的檢測(cè) 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，越來(lái)越多的病毒基因已被成功地克隆并確定了其核苷酸序列，為通過(guò)檢測(cè)病毒的核酸來(lái)對(duì)病毒感染性疾病進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)室診斷奠定了良好的基礎(chǔ)。同細(xì)菌的核酸診斷技術(shù)類似，病毒核酸診斷技術(shù)也主要是核酸分子雜交和PCR技術(shù)。斑點(diǎn)雜交

32、可用于大多數(shù)病毒核酸和PCR產(chǎn)物的檢測(cè)。原位雜交主要用于細(xì)胞內(nèi)病毒的檢測(cè)和定位。目前常使用原位雜交技術(shù)對(duì)人乳頭瘤病毒進(jìn)行檢測(cè)與分型。Southern印跡法和Northern印跡法可分別用于病毒基因組DNA或RNA的檢測(cè)。PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛用于病毒學(xué)研究和病毒感染性疾病的診斷。大多數(shù)常見的病毒均有應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)道。自從PCR技術(shù)建立以來(lái)，多種不同的PCR技術(shù)已經(jīng)用于病毒的檢測(cè)。RNA病毒的檢測(cè)應(yīng)選擇逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）的方法，先將病毒mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再行PCR擴(kuò)增。原位PCR用于對(duì)病毒在細(xì)胞內(nèi)的定位檢測(cè)，敏感度可達(dá)

33、到10個(gè)拷貝/細(xì)胞。最近出現(xiàn)的實(shí)時(shí)PCR技術(shù)可以檢測(cè)基因的拷貝數(shù)。基因芯片（gene chip），又稱DNA芯片（DNA chip）或cDNA微矩陣列（cDNA Microarray），是根據(jù)標(biāo)記的核酸分子能夠與被固化的與之互補(bǔ)配對(duì)的核酸分子雜交的原理，利用光刻合成、高速打印或電定位等技術(shù)在硅、玻璃或尼龍膜上按照特定的排列方式固定有大量的基因探針，形成DNA微陣列。樣品DNA/RNA通過(guò)PCR/RT-PCR擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標(biāo)記分子與DNA微陣列雜交后，通過(guò)熒光掃描器及計(jì)算機(jī)分析，即可獲得樣品中大量基因序列及表達(dá)的信息。因此基因芯片技術(shù)在感染性疾病的診斷和流行病學(xué)的調(diào)查中將會(huì)發(fā)揮重要

34、作用，這一技術(shù)將會(huì)有力地推動(dòng)臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)水平向前發(fā)展。另外，用基因芯片不僅可以同時(shí)檢測(cè)耐藥菌的多個(gè)耐藥基因，還可以同時(shí)對(duì)多個(gè)耐藥菌的多個(gè)耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)臨床用藥和新藥物的合成均具有指導(dǎo)作用。五、病毒抗體的檢測(cè)用已知病毒抗原檢測(cè)病人血清中有無(wú)相應(yīng)抗體是病毒實(shí)驗(yàn)室檢查的主要方法手段，也稱為病毒的血清學(xué)診斷。如前所述，這類技術(shù)需要采集病人在急性期和恢復(fù)期的雙份血清，比較血清效價(jià)是否有明顯升高。病毒特異性IgG類抗體將恢復(fù)期與早期對(duì)比，升高4倍或4倍以上方具有診斷意義。因只有單份血清IgG效價(jià)的升高不能區(qū)分出既往感染或正在感染，很難作為一個(gè)輔助診斷的指標(biāo)。該法不能用于快速診斷。由于抗病毒特異性I

35、gM出現(xiàn)早，消失快，因此在某些病毒性疾病，特異性IgM的出現(xiàn)或升高則表示病毒感染的早期，例如，HBV核心抗原的特異性IgM的出現(xiàn)提示HBV感染的早期。多種免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法可用于病毒抗體的檢測(cè)，包括中和試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等經(jīng)典方法，也包括ELISA和蛋白印跡等技術(shù)。中和試驗(yàn)（neutralization test，NT） 病毒在體內(nèi)或細(xì)胞培養(yǎng)中可被特異性抗體中和而失去感染性，根據(jù)特異性血清能保護(hù)細(xì)胞（或雞胚、動(dòng)物）不出現(xiàn)病變的稀釋倍數(shù)判定抗體效價(jià)。常用于人群免疫狀況調(diào)查，臨床診斷較少使用。血凝抑制試驗(yàn)（hemagglutination inhibition test，HI） 有些病毒

36、（如流感病毒）表面有血凝素（HA），能凝集脊椎動(dòng)物（如雞、豚鼠和人等）的紅細(xì)胞，稱為血凝現(xiàn)象。但當(dāng)病毒與其HA特異性抗體作用后，可以阻止病毒表面的HA與紅細(xì)胞的結(jié)合，稱為血凝抑制試驗(yàn)。本法可用于正粘病毒、副粘病毒及黃病毒等有HA的病毒的血清學(xué)診斷和流行病學(xué)調(diào)查，也可用于鑒定病毒的型或亞型。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（complement fixation test，CF） 是用已知病毒可溶性抗原檢查患者血清中相應(yīng)抗體，即CF抗體。CF抗體常于病毒感染數(shù)日后出現(xiàn)，故可作為近期感染指標(biāo)。但由于方法繁瑣、型特異性較低，臨床不常采用。ELISA法 由于該法具有特異性高、敏感性強(qiáng)、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)

37、菌、病毒和其他病原體的臨床化驗(yàn)室檢測(cè)，特別是在病毒感染性疾病的診斷中常用。已經(jīng)有多種病毒的商品化檢測(cè)試劑盒，如單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、各型肝炎病毒、EB病毒和HIV等的診斷。蛋白印跡技術(shù)（Western blot） 是將SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白電泳的高分辨力與酶免疫技術(shù)的特異性和敏感性相結(jié)合的方法。由于病毒蛋白的分子量和所帶電荷不同，在SDS-PAGE上會(huì)得到不同的蛋白條帶。將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，最后用顯色劑（如化學(xué)發(fā)光物質(zhì)）顯示與相應(yīng)抗原結(jié)合的特異性抗體。本試驗(yàn)是用已經(jīng)病毒