基因的分離技術(shù)

1、基因的分離技術(shù)基因的分離技術(shù)演講人：組演講人：組 員：員：2. cDNA的分離與純化 什么是什么是cDNA?依賴依賴RNA的的DNA聚合酶聚合酶核糖核酸酶核糖核酸酶H活力活力依賴依賴DNA的的DNA聚合酶聚合酶獲得高純度獲得高純度RNA 在一小時之內(nèi)分離在一小時之內(nèi)分離RNA在在3小時內(nèi)分離小時內(nèi)分離DNA或蛋白或蛋白質(zhì)質(zhì)在在4攝氏度條件下穩(wěn)定保攝氏度條件下穩(wěn)定保存兩年以上存兩年以上 4. 基因文庫的應(yīng)用 建立和使用基因文庫是建立和使用基因文庫是分離基因分離基因，特別是分離高等真核生物基因的特別是分離高等真核生物基因的有效手段。有效手段。 如果一個哺乳動物的基因組是如果一個哺乳動物的基因組是

2、3109堿基對，直接從細(xì)胞中提堿基對，直接從細(xì)胞中提取并分離出某一特定基因的取并分離出某一特定基因的 DNA片段在技術(shù)上是很困難的。片段在技術(shù)上是很困難的。但是在基因文庫中，不同的但是在基因文庫中，不同的 DNA片段都分別在不同的克隆中片段都分別在不同的克隆中擴增了，只要有該基因的探針存擴增了，只要有該基因的探針存在，則從許多克隆中篩選一個所在，則從許多克隆中篩選一個所需的克隆是一項比較簡單的工作。需的克隆是一項比較簡單的工作。SDS陰離子去垢劑SDSSDS(十二烷基硫酸鈉)是陰離子去垢劑，本身帶負(fù)電荷的SDS能夠與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)相結(jié)合，使蛋白質(zhì)伸展和解聚，并使蛋白質(zhì)呈一致的強負(fù)電荷，從而消除

3、了不同蛋白質(zhì)分子之間的電荷差異。在收集細(xì)胞蛋白的操作中，它主要作用有二：1、能改變細(xì)胞的表面張力而使細(xì)胞膜破裂，效果很強很迅速；2、可以使蛋白質(zhì)變性而使其與DNA分離，在收蛋白最后一步操作中離心下來的就是基因組DNA，上清液中即使有點RNA也會很快降解。在1XSDS蛋白裂解液中，SDS的終濃度為2%，即每50ml裂解液中含有1gSDS。 SDS的應(yīng)用廣泛，蛋白質(zhì)收集、Western Blot里上樣乃至SDS-PAGE凝膠電泳過程中都會應(yīng)用到。然而SDS是離子型去垢劑會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，所以對于要檢測蛋白質(zhì)間相互作用的免疫沉淀(IP)之類的實驗就不能使用了。SDS是離子型表面活性劑。 它主要功能有： (1)溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。 (2)解聚細(xì)胞中的核蛋白。 (3)SDS能與蛋 白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3R-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的