1.2基因工程的基本操作程序PPT學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)11.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序第1頁/共43頁從基因文庫獲得從基因文庫獲得利用利用PCR技術(shù)擴增技術(shù)擴增第2頁/共43頁基因文庫基因文庫: : 將含有某種生物不同基因的許多將含有某種生物不同基因的許多DNADNA片段，導(dǎo)入片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫的不同的基因，稱為基因文庫(gene library)(gene library)。基因組文庫基因組文庫: : 基因文庫中包含了一種生物所有的基因，這種基基因文庫中包含了一種生物所有的基因，這種基因文庫叫做基因組文庫。因

2、文庫叫做基因組文庫。部分基因文庫部分基因文庫: : 基因文庫中包含了一種生物的一部分基因，這種基因文庫中包含了一種生物的一部分基因，這種基因文庫叫做部分基因文庫。基因文庫叫做部分基因文庫。第3頁/共43頁第4頁/共43頁某生物體內(nèi)某生物體內(nèi)全部全部DNA DNA 許多許多DNADNA片段片段受體菌群體受體菌群體限制酶限制酶與運載體連接與運載體連接 導(dǎo)入導(dǎo)入基因組文庫基因組文庫某種生物某個時期的某種生物某個時期的mRNAmRNAcDNAcDNA反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄受體菌群體受體菌群體與運載體連接與運載體連接 導(dǎo)入導(dǎo)入部分基因文庫部分基因文庫（cDNA文庫）文庫）第5頁/共43頁外顯子內(nèi)含子與RNA聚合酶

3、結(jié)合位點編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點編碼區(qū)原核生物基因原核生物基因真核生物基因真核生物基因內(nèi)含子外顯子第6頁/共43頁真核生物真核生物cDNA文庫與的區(qū)別基因組文庫文庫與的區(qū)別基因組文庫文庫類型文庫類型cDNA文庫文庫基因組文庫基因組文庫文庫大小文庫大小基因中啟動子基因中啟動子基因中內(nèi)含子基因中內(nèi)含子基因多少基因多少種間的基因交流種間的基因交流小小大大無無有有無無有有某種生物某種生物部分部分基因基因某種生物某種生物全部全部基因基因可以可以部分基因可以部分基因可以第7頁/共43頁2、利用、利用PCR技術(shù)擴增目的基因技術(shù)擴增目的基因 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在生物體外復(fù)制特

4、定聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在生物體外復(fù)制特定DNADNA片段的核酸合成技術(shù)?？梢垣@得大量的目的基片段的核酸合成技術(shù)?？梢垣@得大量的目的基因。因。第8頁/共43頁循環(huán)循環(huán)（重復(fù)重復(fù)）變性變性退火退火延伸延伸第9頁/共43頁PCR技術(shù)的原理：技術(shù)的原理：DNA復(fù)制復(fù)制(體外體外)過程：變性過程：變性 退火退火 延伸延伸（解鏈為單鏈）（解鏈為單鏈） （冷卻）（冷卻） （子鏈合成）（子鏈合成）條件：條件： 引物（引物（2 2種）；種）； 模板模板:DNA:DNA的兩條鏈的兩條鏈； 四種脫氧核苷酸；四種脫氧核苷酸； 熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）。酶）。多次重復(fù)多次重復(fù)第10頁/共43

5、頁PCRPCR技術(shù)與技術(shù)與DNADNA體內(nèi)復(fù)制的區(qū)別：體內(nèi)復(fù)制的區(qū)別：DNADNA復(fù)制復(fù)制( (體內(nèi)）體內(nèi)）PCRPCR技術(shù)技術(shù)引物引物解旋解旋酶酶操作環(huán)境操作環(huán)境需要需要需要需要常溫條件、解旋酶、常溫條件、解旋酶、ATP高溫條件（高溫條件（9095）DNA解旋酶、解旋酶、DNA聚合酶、聚合酶、 耐高溫的耐高溫的Taq酶酶體內(nèi)（細(xì)胞內(nèi)）體內(nèi)（細(xì)胞內(nèi)）體外體外第11頁/共43頁練習(xí)有關(guān)練習(xí)有關(guān)PCRPCR技術(shù)的說法，不正確的是技術(shù)的說法，不正確的是( ( ）A APCRPCR是一項在生物體外復(fù)制特定的是一項在生物體外復(fù)制特定的DNADNA片段的核片段的核酸合成技術(shù)酸合成技術(shù)B BPCRPCR技術(shù)

6、的原理是技術(shù)的原理是DNADNA雙鏈復(fù)制雙鏈復(fù)制C C利用利用PCRPCR技術(shù)獲取目的基因的前提是要有一段技術(shù)獲取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列已知目的基因的核苷酸序列D DPCRPCR擴增中必須有解旋酶才能解開雙鏈擴增中必須有解旋酶才能解開雙鏈DNADNA第12頁/共43頁（1 1）催化）催化過程的酶是過程的酶是_ 。（2 2）過程也稱為過程也稱為DNADNA的變性，此過程在溫度高達(dá)的變性，此過程在溫度高達(dá)90959095時才時才能完成，說明能完成，說明DNADNA分子具有分子具有_性。性。（3 3）由圖中信息分析可知，催化）由圖中信息分析可知，催化過程的酶都是過程的酶都是

7、_，兩者在作用特性上的區(qū)別是，兩者在作用特性上的區(qū)別是_ 。（4 4）如果）如果RNARNA單鏈中有堿基單鏈中有堿基100100個，其中個，其中A A占占25%25%，U U占占15%15%，則通，則通過該過程合成的一個雙鏈過該過程合成的一個雙鏈DNADNA片段中有胞嘧啶片段中有胞嘧啶_個。個。7075RNA單鏈雜交雙鏈RNA鏈 DNA鏈核酸酶H單鏈DNA雙鏈DNA90955560反轉(zhuǎn)錄酶（或逆轉(zhuǎn)錄酶）反轉(zhuǎn)錄酶（或逆轉(zhuǎn)錄酶）練習(xí)：練習(xí)：19701970年，特明和巴爾的摩證實了年，特明和巴爾的摩證實了RNARNA病毒能依賴病毒能依賴RNARNA合成合成DNADNA的過程，并的過程，并發(fā)現(xiàn)了催化此

8、過程的酶。下面為形成發(fā)現(xiàn)了催化此過程的酶。下面為形成cDNAcDNA的過程和的過程和PCRPCR擴增過程示意圖。請根擴增過程示意圖。請根據(jù)圖解回答下列問題：據(jù)圖解回答下列問題：穩(wěn)定穩(wěn)定DNA聚合酶聚合酶催化催化過程的酶耐高溫過程的酶耐高溫60第13頁/共43頁3. 3. 通過通過第14頁/共43頁第15頁/共43頁第16頁/共43頁啟動子啟動子：+目的基因目的基因：+終止子：終止子：標(biāo)記基因標(biāo)記基因：+是是 的結(jié)合位點，的結(jié)合位點，驅(qū)動驅(qū)動 過程。過程。RNA聚合酶聚合酶轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄終止終止 過程。過程。轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 有目的基因的有目的基因的受體細(xì)胞。受體細(xì)胞。鑒定和篩選鑒定和篩選編碼人類所需的蛋白質(zhì)

9、編碼人類所需的蛋白質(zhì), 使生物使生物表達(dá)相應(yīng)性狀表達(dá)相應(yīng)性狀.復(fù)制原點：復(fù)制原點： 啟動復(fù)制啟動復(fù)制第17頁/共43頁質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA分子分子限制酶處理限制酶處理兩個切口兩個切口獲得目的基因獲得目的基因DNADNA連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質(zhì)粒分子（重組質(zhì)粒）同一種同一種一個切口一個切口兩個黏性末端兩個黏性末端基因表達(dá)載體的組成基因表達(dá)載體的組成復(fù)制原點復(fù)制原點+啟動子啟動子+目的基因目的基因+終止子終止子+標(biāo)記基因標(biāo)記基因第18頁/共43頁1. 1. 上述表達(dá)載體的啟動子、目的基因、終止子、標(biāo)記上述表達(dá)載體的啟動子、目的基因、終止子、標(biāo)記基因的化學(xué)成分相同嗎？基因的化學(xué)成

10、分相同嗎？都是都是DNA2. 2. 終止子和終止密碼的化學(xué)成分是否一致？終止子和終止密碼的化學(xué)成分是否一致？終止子終止子DNA, 終止轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄;終止密碼終止密碼RNA上，終止翻譯上，終止翻譯.第19頁/共43頁3. 3. 圖為某種質(zhì)粒表達(dá)載體簡圖，小箭頭所指分別為限制性圖為某種質(zhì)粒表達(dá)載體簡圖，小箭頭所指分別為限制性內(nèi)切酶內(nèi)切酶EcoRIEcoRI、BamHIBamHI的酶切位點，的酶切位點，ampampR R為青霉素抗性基因，為青霉素抗性基因，tcttctR R 為四環(huán)素抗性基因，為四環(huán)素抗性基因，P P啟動子，啟動子，T T為終止子，為終止子，oriori為復(fù)制為復(fù)制原點。已知目的基因

11、的兩端分別有包括原點。已知目的基因的兩端分別有包括EcoRIEcoRI、BamHIBamHI在內(nèi)的在內(nèi)的多種酶的酶切位點。多種酶的酶切位點。據(jù)圖回答：據(jù)圖回答：（1 1）將含有目的基因的）將含有目的基因的DNADNA與質(zhì)粒該表達(dá)載體分別與質(zhì)粒該表達(dá)載體分別用用EcoRIEcoRI酶切，酶切產(chǎn)物用連接酶進(jìn)行連接后，其中由酶切，酶切產(chǎn)物用連接酶進(jìn)行連接后，其中由 兩個兩個DNADNA片段之間連接形成的產(chǎn)物有片段之間連接形成的產(chǎn)物有 、 、 三種三種 。若。若要從這些連接產(chǎn)物中分離出重組質(zhì)粒，需要對這些連接產(chǎn)物進(jìn)要從這些連接產(chǎn)物中分離出重組質(zhì)粒，需要對這些連接產(chǎn)物進(jìn)行行 . .（2 2）用上述）用上

12、述3 3種連接產(chǎn)物與無任何抗藥性的原核宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)種連接產(chǎn)物與無任何抗藥性的原核宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化實驗。之后將這些宿主細(xì)胞接種到含青霉素的培養(yǎng)基中，能生化實驗。之后將這些宿主細(xì)胞接種到含青霉素的培養(yǎng)基中，能生長的原核宿主細(xì)胞所含有的連接產(chǎn)物是長的原核宿主細(xì)胞所含有的連接產(chǎn)物是 ；目的基因運載體連接物目的基因運載體連接物運載體運載體連接物運載體運載體連接物目的基因目的基因連接物目的基因目的基因連接物分離純化分離純化目的基因運載體連接物目的基因運載體連接物運載體運載體連接物運載體運載體連接物第20頁/共43頁練習(xí)練習(xí). . 圖為某種質(zhì)粒表達(dá)載體簡圖，小箭頭圖為某種質(zhì)粒表達(dá)載體簡圖，小箭頭所指分別為

13、限制性內(nèi)切酶所指分別為限制性內(nèi)切酶EcoRIEcoRI、BamHIBamHI的酶切的酶切位點，位點，ampampR R為青霉素抗性基因，為青霉素抗性基因，tcttctR R 為四環(huán)素為四環(huán)素抗性基因，抗性基因，P P啟動子，啟動子，T T為終止子，為終止子，oriori為復(fù)制為復(fù)制原點。已知目的基因的兩端分別有包括原點。已知目的基因的兩端分別有包括EcoRIEcoRI、BamHIBamHI在內(nèi)的多種酶的酶切位點。在內(nèi)的多種酶的酶切位點。（3 3）目的基因表達(dá)時，）目的基因表達(dá)時，RNARNA聚合酶識別和結(jié)合的位點是聚合酶識別和結(jié)合的位點是 ，其合成的產(chǎn)物是，其合成的產(chǎn)物是 。（4 4）在上述實

14、驗中，為了防止目的基因和質(zhì)粒表達(dá)載體在酶）在上述實驗中，為了防止目的基因和質(zhì)粒表達(dá)載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接，酶切時應(yīng)選用的酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接，酶切時應(yīng)選用的酶是是 。EcoRI和和BamHI啟動子啟動子mRNA第21頁/共43頁轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化第22頁/共43頁1.1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞第23頁/共43頁第24頁/共43頁123456789花柄花柄花托花托子房子房花萼花萼花瓣花瓣花柱花柱柱頭柱頭花藥花藥花絲花絲雄蕊雄蕊雌雌蕊蕊（花冠）（花冠）第25頁/共43頁第26頁/共43頁2.2.將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞顯微注射技術(shù)：顯微注射技術(shù)：

15、 利用微量注射器在利用微量注射器在顯微鏡下直接把目的基顯微鏡下直接把目的基因注入宿主細(xì)胞。因注入宿主細(xì)胞。3.3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞胞 導(dǎo)入大腸桿菌的方法導(dǎo)入大腸桿菌的方法: 首先用首先用Ca2+ 處理細(xì)胞處理細(xì)胞，使細(xì)胞使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)分子的生理狀態(tài)感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞。 第二步是將第二步是將重組表達(dá)載體重組表達(dá)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合胞混合，在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收，在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)分子，完成轉(zhuǎn)化過程。化過程。顯微注射技

16、術(shù)顯微注射技術(shù)提純基因表達(dá)載體提純基因表達(dá)載體體外顯微注射入受精卵體外顯微注射入受精卵受精卵移植受精卵移植第27頁/共43頁蔡信之微生物學(xué)181頁，兩種理論都是假說，1、局部原生質(zhì)化，也就是細(xì)胞壁上出現(xiàn)孔，2、好像還涉及細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)化因子（分子量5000-1-0000）的蛋白質(zhì)的形成和細(xì)胞表面受體結(jié)合的轉(zhuǎn)運問題。 劉祖洞得遺傳書下冊，174頁，用鈣離子處理使細(xì)胞膜上出現(xiàn)漏隙，DNA容易進(jìn)入。 第28頁/共43頁體外重組的DNA分子，需按一定的方式導(dǎo)入宿主細(xì)胞，通過宿主細(xì)胞的復(fù)制而使目的基因得到大量的擴增。宿主細(xì)胞也稱為受體細(xì)胞，分為原核細(xì)胞和真核細(xì)胞兩類。原核細(xì)胞以大腸桿菌為主，真核細(xì)胞包括酵

17、母及動物細(xì)胞等。重組分子導(dǎo)入適宜的宿主細(xì)胞的過程就是轉(zhuǎn)化。在基因克隆技術(shù)中，轉(zhuǎn)化(transformation)特指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入宿主細(xì)胞的過程。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備（氯化鈣法）及轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備（氯化鈣法）及轉(zhuǎn)化第29頁/共43頁第30頁/共43頁1、檢測與鑒定的目的、檢測與鑒定的目的 目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性。和表達(dá)其遺傳特性。2、抗原抗原-抗體雜交抗體雜交DNA分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)DNA-RNA分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)第31頁/共43頁第32頁/共43頁DNA附著在膜上附著

18、在膜上硝化纖維素硝化纖維素加探針加探針報告基因（含熒光素分子）報告基因（含熒光素分子）變性變性DNA雜交雜交（如檢測（如檢測SARS病毒等）病毒等）abcd第33頁/共43頁第34頁/共43頁基基因因工工程程的的基基本本操操作作程程序序目的基因的獲取目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測與鑒定1、從基因文庫中獲取目的基因、從基因文庫中獲取目的基因2、利用、利用PCR技術(shù)擴增目的基因技術(shù)擴增目的基因3、化學(xué)方法人工合成、化學(xué)方法人工合成復(fù)制原點復(fù)制原點 + + 目的基因目的基因 + + 啟動子啟動子 + +

19、 終止子終止子 + + 標(biāo)記基因標(biāo)記基因農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法、顯微注射法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法、顯微注射法、CaCa2+2+處理處理法法DNADNA分子雜交技術(shù)、分子雜交技術(shù)、抗原分子雜交技術(shù)、分子雜交技術(shù)、抗原抗體雜交技抗體雜交技術(shù)術(shù)分子檢測外的個體水平鑒定分子檢測外的個體水平鑒定第35頁/共43頁A.A.所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列 B.B.質(zhì)粒是基因工程中唯一的運載體質(zhì)粒是基因工程中唯一的運載體 C.C.運載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與運載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，

20、以便與外源基因連接外源基因連接 D.D.基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來3.在遺傳工程技術(shù)中在遺傳工程技術(shù)中,下列何種目的基因一般以直接分離的方法獲下列何種目的基因一般以直接分離的方法獲得得 A.人的胰島素基因 B.蠶的蠶絲蛋白基因C.芽孢桿菌的抗蟲基因 D.菜豆儲藏蛋白基因第36頁/共43頁第37頁/共43頁第38頁/共43頁1.1.利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細(xì)胞器利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細(xì)胞器功能的知識，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，功能的知識，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白

21、，可以用大腸桿菌嗎？若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器，因此存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成成分。當(dāng)它的成分異常時珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成成分。當(dāng)它的成分異常時，動物有可能患某種疾病，如鐮刀形細(xì)胞貧血癥。假如讓你，動物

22、有可能患某種疾病，如鐮刀形細(xì)胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的-珠蛋白，想一珠蛋白，想一想，應(yīng)如何進(jìn)行設(shè)計？想，應(yīng)如何進(jìn)行設(shè)計？尋根問底：尋根問底：第39頁/共43頁（1）從小鼠中克隆出）從小鼠中克隆出-珠蛋白基因的編碼序列（珠蛋白基因的編碼序列（cDNA）。）。（2）將）將cDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動子，另外加前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動子，另外加上抗四環(huán)素的基因，構(gòu)建成一個表達(dá)載體。上抗四環(huán)素的基因，構(gòu)建成一個表達(dá)載體。（3）將表達(dá)載體導(dǎo)入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有）將表達(dá)載體導(dǎo)入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中

23、，然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達(dá)載體未進(jìn)入大腸桿四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達(dá)載體未進(jìn)入大腸桿菌中，大腸桿菌會因不含有抗四環(huán)素基因而死掉；如果培養(yǎng)基菌中，大腸桿菌會因不含有抗四環(huán)素基因而死掉；如果培養(yǎng)基上長出大腸桿菌菌落，則表明上長出大腸桿菌菌落，則表明-珠蛋白基因已進(jìn)入其中。珠蛋白基因已進(jìn)入其中。（4）培養(yǎng)進(jìn)入了）培養(yǎng)進(jìn)入了-珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎后珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎后從中提取從中提取-珠蛋白。珠蛋白。第40頁/共43頁尋根問底尋根問底（1）為什么要構(gòu)建基因文庫？直接從含有目的基因的生物體為什么要構(gòu)建基因文庫？直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎？內(nèi)提取不行嗎？提示：提示：構(gòu)建基因文庫是獲取目的基因的方法之一，并構(gòu)建基因