生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)與保存

1、第四章第四章 生產(chǎn)菌種的制備和保藏生產(chǎn)菌種的制備和保藏生產(chǎn)菌種的制備過(guò)程生產(chǎn)菌種的制備過(guò)程生產(chǎn)菌種的保藏生產(chǎn)菌種的保藏生產(chǎn)菌種的質(zhì)量控制生產(chǎn)菌種的質(zhì)量控制1 1 1 第一節(jié)第一節(jié) 生產(chǎn)菌種的制備過(guò)程生產(chǎn)菌種的制備過(guò)程菌種菌種 母斜面母斜面 子斜面子斜面 搖瓶菌絲搖瓶菌絲 種子罐種子罐 發(fā)酵罐發(fā)酵罐 實(shí)驗(yàn)室階段：不用種子罐，所用的設(shè)備為培養(yǎng)箱、搖實(shí)驗(yàn)室階段：不用種子罐，所用的設(shè)備為培養(yǎng)箱、搖床等實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)設(shè)備，在工廠這些培養(yǎng)過(guò)程一般都在床等實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)設(shè)備，在工廠這些培養(yǎng)過(guò)程一般都在菌種室完成，因此現(xiàn)象地將這些培養(yǎng)過(guò)程稱為實(shí)驗(yàn)室菌種室完成，因此現(xiàn)象地將這些培養(yǎng)過(guò)程稱為實(shí)驗(yàn)室階段的種子培養(yǎng)。階段的種

2、子培養(yǎng)。生產(chǎn)車(chē)間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進(jìn)行，一般在生產(chǎn)車(chē)間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進(jìn)行，一般在工程歸為發(fā)酵車(chē)間管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過(guò)程工程歸為發(fā)酵車(chē)間管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過(guò)程為生產(chǎn)車(chē)間階段。為生產(chǎn)車(chē)間階段。 種子擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過(guò)扁瓶或搖瓶及種試管斜面活化后，再經(jīng)過(guò)扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng), ,最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過(guò)程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。量的純種過(guò)程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。種子擴(kuò)培的目

3、的種子擴(kuò)培的目的q 接種量的需要接種量的需要q 菌種的馴化菌種的馴化q 縮短發(fā)酵時(shí)間、保證生產(chǎn)水平縮短發(fā)酵時(shí)間、保證生產(chǎn)水平種子的要求：種子的要求：q 總量及濃度能滿足要求總量及濃度能滿足要求q 生理狀況穩(wěn)定，個(gè)體與群體生理狀況穩(wěn)定，個(gè)體與群體q 活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵后，能夠迅速生長(zhǎng)活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵后，能夠迅速生長(zhǎng)q 無(wú)雜菌污染無(wú)雜菌污染一、孢子的制備一、孢子的制備放線菌孢子的制備：放線菌孢子的制備： 營(yíng)養(yǎng)要求：營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量要低，特別是氮源營(yíng)養(yǎng)要求：營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量要低，特別是氮源 培養(yǎng)基：瓊脂斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)基：瓊脂斜面培養(yǎng)基 培養(yǎng)溫度：培養(yǎng)溫度：2837 培養(yǎng)時(shí)間：培養(yǎng)時(shí)間：514天天 斜面含水

4、量：低斜面含水量：低 棒狀鏈霉菌成熟單菌落生棒狀鏈霉菌成熟單菌落生長(zhǎng)豐滿，緊密，菌落呈草帽形，長(zhǎng)豐滿，緊密，菌落呈草帽形，中間突起，氣生菌絲顏色為白中間突起，氣生菌絲顏色為白色，基內(nèi)菌絲由淺黃到灰黃，色，基內(nèi)菌絲由淺黃到灰黃，都不產(chǎn)生可溶性色素，孢子為都不產(chǎn)生可溶性色素，孢子為暗灰綠色，成熟后，孢子易于暗灰綠色，成熟后，孢子易于刮下刮下 棒狀鏈霉菌出發(fā)菌株單菌落形態(tài)特征棒狀鏈霉菌出發(fā)菌株單菌落形態(tài)特征 棒狀鏈霉菌斜面一棒狀鏈霉菌斜面一般培養(yǎng)四到五天左右產(chǎn)生般培養(yǎng)四到五天左右產(chǎn)生孢子，六到七天斜面孢子孢子，六到七天斜面孢子生長(zhǎng)成熟，氣生菌絲顏色生長(zhǎng)成熟，氣生菌絲顏色為白色，基內(nèi)菌絲由淺黃為白色，

5、基內(nèi)菌絲由淺黃到灰黃，都不產(chǎn)生可溶性到灰黃，都不產(chǎn)生可溶性色素，孢子呈暗灰綠色色素，孢子呈暗灰綠色 棒狀鏈霉菌出發(fā)菌株的斜面培養(yǎng)特征棒狀鏈霉菌出發(fā)菌株的斜面培養(yǎng)特征 霉菌孢子的制備：霉菌孢子的制備： 營(yíng)養(yǎng)要求：碳、氮含量要低，無(wú)機(jī)鹽適量營(yíng)養(yǎng)要求：碳、氮含量要低，無(wú)機(jī)鹽適量 培養(yǎng)基：天然農(nóng)產(chǎn)品培養(yǎng)基：天然農(nóng)產(chǎn)品 培養(yǎng)溫度：培養(yǎng)溫度：2528 培養(yǎng)時(shí)間：培養(yǎng)時(shí)間：414天天 細(xì)菌種子的制備：細(xì)菌種子的制備： 營(yíng)養(yǎng)要求：營(yíng)養(yǎng)豐富，氮源含量要高營(yíng)養(yǎng)要求：營(yíng)養(yǎng)豐富，氮源含量要高 培養(yǎng)基：牛肉膏、蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏、蛋白胨 培養(yǎng)溫度：培養(yǎng)溫度：37 培養(yǎng)時(shí)間：培養(yǎng)時(shí)間：12天（芽孢天（芽孢58天）天）二

6、、搖瓶種子的制備二、搖瓶種子的制備一級(jí)搖瓶一級(jí)搖瓶 二級(jí)搖瓶二級(jí)搖瓶 種子罐種子罐三、種子罐種子的制備三、種子罐種子的制備一級(jí)種子罐一級(jí)種子罐 二級(jí)種子罐二級(jí)種子罐 發(fā)酵罐（三級(jí)發(fā)酵）發(fā)酵罐（三級(jí)發(fā)酵）級(jí)數(shù)的確定：菌種的特性；發(fā)酵罐的體積級(jí)數(shù)的確定：菌種的特性；發(fā)酵罐的體積谷氨酸：三級(jí)發(fā)酵谷氨酸：三級(jí)發(fā)酵一級(jí)種子（搖瓶）一級(jí)種子（搖瓶）二級(jí)種子二級(jí)種子 （小罐）（小罐）發(fā)酵發(fā)酵青霉素：三級(jí)發(fā)酵青霉素：三級(jí)發(fā)酵一級(jí)種子一級(jí)種子 （小罐）（小罐）二級(jí)種子（中罐）二級(jí)種子（中罐）發(fā)酵發(fā)酵 一般由菌絲體培養(yǎng)開(kāi)始計(jì)算發(fā)酵級(jí)數(shù)，但有時(shí)，一般由菌絲體培養(yǎng)開(kāi)始計(jì)算發(fā)酵級(jí)數(shù)，但有時(shí)，工廠從第一級(jí)種子罐開(kāi)始計(jì)算發(fā)

7、酵級(jí)數(shù)。工廠從第一級(jí)種子罐開(kāi)始計(jì)算發(fā)酵級(jí)數(shù)。發(fā)酵級(jí)數(shù)確定的依據(jù)發(fā)酵級(jí)數(shù)確定的依據(jù)q 級(jí)數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長(zhǎng)特性、接種量的影響級(jí)數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長(zhǎng)特性、接種量的影響q 級(jí)數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一級(jí)數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一 般般2-4級(jí)。級(jí)。q 在發(fā)酵產(chǎn)品的放大中，反應(yīng)級(jí)數(shù)的確定是非常重要在發(fā)酵產(chǎn)品的放大中，反應(yīng)級(jí)數(shù)的確定是非常重要 的一個(gè)方面的一個(gè)方面四、四、 種子制備過(guò)程舉例種子制備過(guò)程舉例1、谷氨酸生產(chǎn)的種子制備、谷氨酸生產(chǎn)的種子制備制備過(guò)程制備過(guò)程斜面菌種斜面菌種一級(jí)種子培養(yǎng)一級(jí)種子培養(yǎng)二級(jí)種子培養(yǎng)二級(jí)種子培養(yǎng)發(fā)酵發(fā)酵斜面斜面 (AS1.299)培

8、養(yǎng)基：蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨 1%，牛肉膏，牛肉膏1%，氯化鈉，氯化鈉 0.5 瓊脂瓊脂 2%， pH 7.0-7.2培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于菌體的生長(zhǎng)，原料比較精細(xì)培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于菌體的生長(zhǎng)，原料比較精細(xì)培養(yǎng)條件：培養(yǎng)條件：32，生長(zhǎng)，生長(zhǎng)18-24小時(shí)小時(shí) 生長(zhǎng)斜面要求：生長(zhǎng)良好，所使用斜面連續(xù)傳代不超生長(zhǎng)斜面要求：生長(zhǎng)良好，所使用斜面連續(xù)傳代不超過(guò)過(guò)3次次一級(jí)一級(jí)種子（搖瓶）種子（搖瓶）培養(yǎng)條件：于培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液三角瓶中，裝液200-250ml,32培培 養(yǎng)養(yǎng)12小時(shí)小時(shí)培養(yǎng)基：葡萄糖培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素，尿素0.5%，玉米漿，玉米漿 2.5%， K2HPO4 0.

9、1%培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于菌體的生長(zhǎng)，所使用的原料已經(jīng)基培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于菌體的生長(zhǎng)，所使用的原料已經(jīng)基 本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基二級(jí)種子二級(jí)種子(種子罐種子罐)培養(yǎng)條件：在種子罐中培養(yǎng)（容積為發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件：在種子罐中培養(yǎng)（容積為發(fā)酵罐的1%），）， 32培養(yǎng)培養(yǎng)7-10個(gè)小時(shí)個(gè)小時(shí)培養(yǎng)基：和一級(jí)種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，培養(yǎng)基：和一級(jí)種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替， 濃度為濃度為2.5%培養(yǎng)基的特點(diǎn)：長(zhǎng)菌體，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)基的特點(diǎn)：長(zhǎng)菌體，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基種子的質(zhì)量要求：種子的質(zhì)量要求：108-109個(gè)個(gè)/ml大小均勻，呈單個(gè)或八字排列大小均勻，呈單個(gè)或八字排

10、列pH 7.0-7.2時(shí)結(jié)束，時(shí)結(jié)束，6.887.0-7.2活力旺盛活力旺盛2、青霉素生產(chǎn)的種子制備、青霉素生產(chǎn)的種子制備制備過(guò)程制備過(guò)程安培管安培管 斜面孢子斜面孢子 大米孢子大米孢子 一級(jí)種子一級(jí)種子 二級(jí)種子二級(jí)種子 發(fā)酵發(fā)酵斜面孢子斜面孢子培養(yǎng)基：甘油、培養(yǎng)基：甘油、 葡萄糖、葡萄糖、 蛋白胨等蛋白胨等培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于長(zhǎng)孢子，用量少而精細(xì)培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于長(zhǎng)孢子，用量少而精細(xì)培養(yǎng)條件：培養(yǎng)條件：25、7天天, 注意濕度注意濕度50%左右左右大米孢子大米孢子培養(yǎng)基：大米及氮源（玉米漿）培養(yǎng)基：大米及氮源（玉米漿）培養(yǎng)基的特點(diǎn)：成本低、米粒之間結(jié)構(gòu)疏松提高比表培養(yǎng)基的特點(diǎn)：成本低、米粒之

11、間結(jié)構(gòu)疏松提高比表面積和氧的傳質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)適當(dāng)（要求大米面積和氧的傳質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)適當(dāng)（要求大米的白點(diǎn)?。┯欣阪咦拥纳L(zhǎng)。的白點(diǎn)?。┯欣阪咦拥纳L(zhǎng)。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)條件：25、7天，控制濕度天，控制濕度大米孢子的要求：大米孢子的要求：1粒米含粒米含1.4*106個(gè)孢子個(gè)孢子一級(jí)種子一級(jí)種子培養(yǎng)基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米漿培養(yǎng)基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米漿目的：長(zhǎng)菌體目的：長(zhǎng)菌體培養(yǎng)條件：培養(yǎng)條件：27，40小時(shí)小時(shí)接種量：接種量：200億孢子億孢子/噸噸二級(jí)種子二級(jí)種子培養(yǎng)基：同上培養(yǎng)基：同上培養(yǎng)條件：培養(yǎng)條件：27、10-14小時(shí)小時(shí)接種量：接種量：10%種子的質(zhì)量要求種子的質(zhì)量要求菌絲長(zhǎng)

12、稠呈絲狀、菌絲團(tuán)很少，有中小空孢，處于菌絲長(zhǎng)稠呈絲狀、菌絲團(tuán)很少，有中小空孢，處于期期青霉素發(fā)酵菌絲體的生長(zhǎng)共分為青霉素發(fā)酵菌絲體的生長(zhǎng)共分為6個(gè)期，個(gè)期，1-4為年青期，為年青期，4-6期合成青霉素的能力最強(qiáng)期合成青霉素的能力最強(qiáng)第二節(jié)第二節(jié) 生產(chǎn)菌種的質(zhì)量控制生產(chǎn)菌種的質(zhì)量控制一、影響孢子質(zhì)量的因素一、影響孢子質(zhì)量的因素1.培養(yǎng)基培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分營(yíng)養(yǎng)成分滅菌的質(zhì)量滅菌的質(zhì)量斜面培養(yǎng)基的含水量斜面培養(yǎng)基的含水量2.培養(yǎng)溫度和濕度的影響培養(yǎng)溫度和濕度的影響 菌體生長(zhǎng)溫度范圍寬些菌體生長(zhǎng)溫度范圍寬些2837 ，孢子，孢子形成溫度窄形成溫度窄27、283.培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)間 過(guò)短：孢子不成熟；低溫保藏

13、時(shí)、易死亡過(guò)短：孢子不成熟；低溫保藏時(shí)、易死亡 過(guò)長(zhǎng)：菌體代謝活力降低，產(chǎn)量低過(guò)長(zhǎng)：菌體代謝活力降低，產(chǎn)量低4.保藏時(shí)間保藏時(shí)間 一般不超過(guò)一星期一般不超過(guò)一星期5.接種量接種量 在母斜面上形成單菌落，在子斜面上在母斜面上形成單菌落，在子斜面上形成一層菌落形成一層菌落二、影響種子質(zhì)量的因素及控制措施二、影響種子質(zhì)量的因素及控制措施1.影響因素：影響因素：培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)間 最適種齡：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期最適種齡：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期 種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開(kāi)始移入種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開(kāi)始移入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。原則：對(duì)數(shù)生

14、長(zhǎng)期末，細(xì)胞活力強(qiáng)，菌體濃度原則：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末，細(xì)胞活力強(qiáng)，菌體濃度相對(duì)較大，但是最終由實(shí)驗(yàn)結(jié)果定。相對(duì)較大，但是最終由實(shí)驗(yàn)結(jié)果定。菌齡過(guò)小：延遲期長(zhǎng)，菌體生長(zhǎng)緩慢，生物菌齡過(guò)?。貉舆t期長(zhǎng)，菌體生長(zhǎng)緩慢，生物合成期縮短，產(chǎn)量降低合成期縮短，產(chǎn)量降低種齡長(zhǎng)：易老化種齡長(zhǎng)：易老化接種量接種量 接入種子液的體積接入種子液的體積 接入后培養(yǎng)液體積接入后培養(yǎng)液體積 接種量范圍：接種量范圍：125%，但是一般認(rèn)為大一點(diǎn)好，但是一般認(rèn)為大一點(diǎn)好 過(guò)大：菌體過(guò)度生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及溶氧不能滿足過(guò)大：菌體過(guò)度生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及溶氧不能滿足 菌體需要，使菌體衰老、自溶菌體需要，使菌體衰老、自溶 過(guò)小：生產(chǎn)期延長(zhǎng)，以產(chǎn)生

15、菌絲結(jié)團(tuán)，產(chǎn)量降低過(guò)?。荷a(chǎn)期延長(zhǎng)，以產(chǎn)生菌絲結(jié)團(tuán)，產(chǎn)量降低接種量接種量= 100%雙種：兩個(gè)種子罐接種到一個(gè)發(fā)酵罐中。雙種：兩個(gè)種子罐接種到一個(gè)發(fā)酵罐中。倒種：一部分種子來(lái)源于種子罐，一部分來(lái)源于發(fā)酵罐。倒種：一部分種子來(lái)源于種子罐，一部分來(lái)源于發(fā)酵罐。 2.種子質(zhì)量的控制指標(biāo)種子質(zhì)量的控制指標(biāo)菌體的形態(tài)菌體的形態(tài)碳、氮、磷的代謝情況碳、氮、磷的代謝情況菌株的生產(chǎn)能力菌株的生產(chǎn)能力特殊酶活力特殊酶活力3.種子異常分析種子異常分析菌絲生長(zhǎng)過(guò)慢：培養(yǎng)基質(zhì)量不好；滅菌質(zhì)量菌絲生長(zhǎng)過(guò)慢：培養(yǎng)基質(zhì)量不好；滅菌質(zhì)量 不好；通入空氣的溫度過(guò)低不好；通入空氣的溫度過(guò)低菌絲結(jié)團(tuán)：接種量??；培養(yǎng)基粘度不當(dāng)；攪菌

16、絲結(jié)團(tuán)：接種量??；培養(yǎng)基粘度不當(dāng)；攪 拌不好拌不好菌絲粘壁：攪拌不好；裝料系數(shù)少；泡沫多菌絲粘壁：攪拌不好；裝料系數(shù)少；泡沫多第三節(jié)第三節(jié) 生產(chǎn)菌種的保藏生產(chǎn)菌種的保藏一、微生物菌種的保藏要求一、微生物菌種的保藏要求要求：要求： 是廣泛是廣泛收集收集各種研究、教學(xué)和生產(chǎn)性菌種，各種研究、教學(xué)和生產(chǎn)性菌種，滿足各方面需求；滿足各方面需求； 高質(zhì)量保藏高質(zhì)量保藏，即要求保藏的菌種不死亡、活，即要求保藏的菌種不死亡、活性不衰老、特性不變異、分類(lèi)不紊亂；性不衰老、特性不變異、分類(lèi)不紊亂； 隨時(shí)可隨時(shí)可提供提供保持有原始特性的菌種用于交換保持有原始特性的菌種用于交換和使用。和使用。二、菌種保藏原理二、菌

17、種保藏原理原理：原理： 將微生物菌種保存在將微生物菌種保存在不利于微生物活躍生長(zhǎng)和代不利于微生物活躍生長(zhǎng)和代謝的不良環(huán)境謝的不良環(huán)境中，如干燥、低溫、缺氧、黑暗、營(yíng)養(yǎng)中，如干燥、低溫、缺氧、黑暗、營(yíng)養(yǎng)饑餓等等，使微生物代謝速率極為緩慢或處于休眠狀饑餓等等，使微生物代謝速率極為緩慢或處于休眠狀態(tài)。態(tài)。 而一旦而一旦恢復(fù)恢復(fù)所保存菌種生長(zhǎng)的正常環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)條所保存菌種生長(zhǎng)的正常環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)條件，即可獲得具有高生理活性和保持原種優(yōu)良性狀的件，即可獲得具有高生理活性和保持原種優(yōu)良性狀的菌種培養(yǎng)物。菌種培養(yǎng)物。三、微生物菌種保藏的常用方法三、微生物菌種保藏的常用方法菌種保藏的方法有多種多樣，常用方法簡(jiǎn)介如下

18、：菌種保藏的方法有多種多樣，常用方法簡(jiǎn)介如下： 1 1、斜面低溫保藏法、斜面低溫保藏法 2 2、 液體石蠟封藏法液體石蠟封藏法 3 3、 沙土管保藏法沙土管保藏法 4 4、甘油低溫保存法、甘油低溫保存法 5 5、真空冷凍干燥保藏法、真空冷凍干燥保藏法 6 6、液氮超低溫保藏法、液氮超低溫保藏法1 1、斜面低溫保藏法、斜面低溫保藏法 4 4保存，保存，13月月2 2、 液體石蠟封藏法液體石蠟封藏法石蠟石蠟滅菌滅菌冷卻冷卻加入試管中加入試管中 3 3、 沙土管保藏法沙土管保藏法 1mol/L酸洗酸洗 1mol/L堿洗堿洗 蒸餾水洗蒸餾水洗 烘干烘干 過(guò)篩過(guò)篩 混合（混合（3：2或或1：1） 分裝沙

19、土管分裝沙土管 干接法：接孢子后，低溫抽真空干接法：接孢子后，低溫抽真空 濕接法：接孢子懸液后，低溫抽真空濕接法：接孢子懸液后，低溫抽真空取沙取沙取土取土（沙（沙:2040目）目）（土（土:4060目）目）4 4、 甘油低溫保藏法甘油低溫保藏法 等體積混合等體積混合 -20以下保存以下保存孢子懸液或菌體孢子懸液或菌體3040%甘油甘油 如果待保藏菌種生長(zhǎng)在斜面上，則可用含如果待保藏菌種生長(zhǎng)在斜面上，則可用含1010甘甘油的新配制液體培養(yǎng)基油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍收獲。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在速度一般控制在1-21-2minmin。若干細(xì)菌和真菌菌種可。若干細(xì)菌和

20、真菌菌種可通過(guò)此保藏方法保藏通過(guò)此保藏方法保藏5 5年而活力不受影響。年而活力不受影響。 通過(guò)在減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升通過(guò)在減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升華，使培養(yǎng)物干燥。此法是微生物菌種長(zhǎng)期保藏的華，使培養(yǎng)物干燥。此法是微生物菌種長(zhǎng)期保藏的最最為有效的方法之一。為有效的方法之一。 冷凍干燥過(guò)程中必須使用冷凍干燥過(guò)程中必須使用冷凍保護(hù)劑冷凍保護(hù)劑，目前國(guó)內(nèi)，目前國(guó)內(nèi)常用脫脂乳和蔗糖，國(guó)外尚有應(yīng)用動(dòng)物血清等的。常用脫脂乳和蔗糖，國(guó)外尚有應(yīng)用動(dòng)物血清等的。 大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏保藏10年年之之久而不喪失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株久而

21、不喪失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無(wú)需進(jìn)行冷凍無(wú)需進(jìn)行冷凍保藏，便于運(yùn)輸。保藏，便于運(yùn)輸。5、真空冷凍干燥保藏法、真空冷凍干燥保藏法 等體積混合等體積混合 分裝凍干分裝凍干管管 冷凍至冷凍至15 以下以下 抽真空抽真空 封口封口 低溫保存低溫保存脫脂牛奶脫脂牛奶孢子懸液（洗凈）孢子懸液（洗凈）凍干菌種的保藏與再生凍干菌種的保藏與再生1保藏：冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于保藏：冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于5下保藏。下保藏。較低的保藏溫度較低的保藏溫度(-20-70)對(duì)于培養(yǎng)物的對(duì)于培養(yǎng)物的長(zhǎng)期穩(wěn)定更好長(zhǎng)期穩(wěn)定更好。2復(fù)蘇：復(fù)蘇：(1)在超凈工作臺(tái)中用在超凈工作臺(tái)中用70酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂輪在安瓿酒精棉

22、球擦洗安瓿，然后用砂輪在安瓿中銼一道溝。中銼一道溝。(2)用無(wú)菌紗布或無(wú)菌毛巾包好安瓿，然后用手掰開(kāi)安瓿用無(wú)菌紗布或無(wú)菌毛巾包好安瓿，然后用手掰開(kāi)安瓿(3)在安瓿中加入在安瓿中加入0.51ml營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基，慢慢旋轉(zhuǎn)安瓿。然營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基，慢慢旋轉(zhuǎn)安瓿。然后將此轉(zhuǎn)接到一含有再生培養(yǎng)基的無(wú)菌試管中，或直接接種瓊脂斜后將此轉(zhuǎn)接到一含有再生培養(yǎng)基的無(wú)菌試管中，或直接接種瓊脂斜面或涂布平板。面或涂布平板。(4)在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀，可以將此直接振落入盛有在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀，可以將此直接振落入盛有l(wèi)2ml液體培養(yǎng)基的試管中，輕輕振蕩液體培養(yǎng)基的試管中，輕輕振蕩5l0min，然后用此

23、懸液，然后用此懸液接種適宜的再生培養(yǎng)基。接種適宜的再生培養(yǎng)基。6 6、液氮超低溫保藏法、液氮超低溫保藏法 10% 甘油懸液甘油懸液 降溫至降溫至0 緩慢降溫至緩慢降溫至 -35 放入液氮缸中放入液氮缸中 液相：液相： -196 （ 氣相：氣相： -150 ）孢子懸液、孢子懸液、 (一一)冷凍保護(hù)劑冷凍保護(hù)劑 在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護(hù)劑是護(hù)劑是二甲亞砜和甘油二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一，最終使用濃度一般為甘油般為甘油10、二甲亞砜、二甲亞砜5。所使用的。所使用的甘油一般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最甘油一般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過(guò)濾滅菌。好為過(guò)

24、濾滅菌。 (二二)液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟1待冷凍保藏菌種懸液的制備待冷凍保藏菌種懸液的制備(1)從生長(zhǎng)斜面制備菌懸液：每一斜面加入從生長(zhǎng)斜面制備菌懸液：每一斜面加入5ml含含10甘油的甘油的營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)；吹吸斜面制成孢子及菌體細(xì)胞懸液；營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)；吹吸斜面制成孢子及菌體細(xì)胞懸液；0.51ml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專(zhuān)用塑料瓶，分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專(zhuān)用塑料瓶，(2)從浸沒(méi)培養(yǎng)物制備菌懸液：在浸沒(méi)培養(yǎng)液中加入等體積從浸沒(méi)培養(yǎng)物制備菌懸液：在浸沒(méi)培養(yǎng)液中加入等體積20%無(wú)菌甘油；輕輕振蕩混勻培養(yǎng)液，如果菌體絮凝較緊，無(wú)菌甘油；輕輕振蕩混勻培養(yǎng)液，如果菌體絮凝較緊，

25、則需先用玻璃珠打散；則需先用玻璃珠打散；0.5-1ml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專(zhuān)分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專(zhuān)用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口；將所有封好的安瓿置用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口；將所有封好的安瓿置于于5冰箱中冰箱中3min，以使細(xì)胞和懸浮培養(yǎng)基之間達(dá)到平衡。，以使細(xì)胞和懸浮培養(yǎng)基之間達(dá)到平衡。 2控速冷凍控速冷凍(1)將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中，然后置于一較大的金屬容器將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中，然后置于一較大的金屬容器中；中；(2)將此金屬容器置于控速冷凍機(jī)的冷凍室中；將此金屬容器置于控速冷凍機(jī)的冷凍室中；(3)以以1-2/min的致冷速度降溫，直到溫度達(dá)到相對(duì)溫度之上幾的

26、致冷速度降溫，直到溫度達(dá)到相對(duì)溫度之上幾度的細(xì)胞凍結(jié)點(diǎn)度的細(xì)胞凍結(jié)點(diǎn)(通常為通常為-30)；(4)補(bǔ)加一定量的液氮至系統(tǒng)中，使細(xì)胞在凍結(jié)點(diǎn)時(shí)盡可能快地發(fā)生補(bǔ)加一定量的液氮至系統(tǒng)中，使細(xì)胞在凍結(jié)點(diǎn)時(shí)盡可能快地發(fā)生相變；相變；(5)細(xì)胞凍結(jié)后，將致冷速度降為細(xì)胞凍結(jié)后，將致冷速度降為1/min，直到溫度達(dá)，直到溫度達(dá)-50；(6)將安瓿迅速移入液氮罐中于液相將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196)或或 氣相氣相(-156)中中保存。如果無(wú)控速冷凍機(jī)，則一般可將安瓿或液氮瓶置于保存。如果無(wú)控速冷凍機(jī)，則一般可將安瓿或液氮瓶置于-70冰冰箱中冷凍箱中冷凍4h，然后迅速移入液氮罐中保存。，然后迅速移入液

27、氮罐中保存。(三三)復(fù)蘇復(fù)蘇 1從液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；從液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；2迅速將安瓿置于迅速將安瓿置于37-40水浴中，并輕輕搖動(dòng)以加速解凍；水浴中，并輕輕搖動(dòng)以加速解凍；3用巴氏吸管將安瓿中貯存培養(yǎng)物移接入含有用巴氏吸管將安瓿中貯存培養(yǎng)物移接入含有2ml無(wú)菌液體培養(yǎng)無(wú)菌液體培養(yǎng)基的試管中，用同一支吸管反復(fù)抽吸數(shù)次，然后取基的試管中，用同一支吸管反復(fù)抽吸數(shù)次，然后取0.1-0.2ml (約約4、8滴滴)轉(zhuǎn)接入瓊脂斜面上。轉(zhuǎn)接入瓊脂斜面上。常用菌種保藏方法的比較常用菌種保藏方法的比較方法方法原理原理適宜菌種適宜菌種保藏時(shí)間保藏時(shí)間特點(diǎn)特點(diǎn)冰箱低溫冰箱低溫（4 4）低溫低溫各大類(lèi)微生物各大類(lèi)微生物3-63-6個(gè)月個(gè)月簡(jiǎn)便簡(jiǎn)便石蠟油封藏石蠟油封藏低溫、缺氧低溫、缺氧各大類(lèi)微生物各大類(lèi)微生物1-21-2年年簡(jiǎn)便簡(jiǎn)便砂土保藏砂土保藏干燥、無(wú)營(yíng)干燥、無(wú)營(yíng)養(yǎng)養(yǎng)產(chǎn)芽孢細(xì)菌、產(chǎn)芽孢細(xì)菌、產(chǎn)孢子的放線產(chǎn)孢子的放線菌、霉菌菌、霉菌1-101-10年年簡(jiǎn)便有效簡(jiǎn)便有效冷凍干燥保冷凍干燥保藏藏干燥、低溫、干燥、低溫、無(wú)氧無(wú)氧各大類(lèi)微生物各大類(lèi)微生物5-155-15年以上年以上繁而高效繁而高效基因工程菌的保藏基因工程菌的保藏 由載體質(zhì)粒等攜帶的外源由載體質(zhì)粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不片段通常是遺傳不穩(wěn)定的、且穩(wěn)定的、且很易丟失其外源質(zhì)粒復(fù)制子很易丟失其外源