綜述：無縫克隆與基因融合(中文版)

1、無縫克隆與基因融合基因融合技術是基因功能研究的關鍵工具。準確拼接的雜合分子，沒有任何無關的序列，使我們可以對分子進行精確的研究。本篇綜述介紹了無縫融合基因和蛋白的應用，以及獲得這些雜交分子的方法前言隨著各種基因組測序項目的完成，人們越來越關注基因產物的功能分析?；蛉诤霞夹g在基因功能研究的許多方面具有重要的作用，包括基因和蛋白標記，報告基因的研究，結構域互換研究，突變研究和基因敲除或者插入實驗。傳統(tǒng)的基因融合技術涉及到type II 限制酶消化和DNA連接反應（所謂的剪切/粘貼反應），曾被用來作為構建雜交基因的標準方法。然而，這種方法常常會在接合處留下操作的序列，例如酶切位點。這些多余的序列可

2、以改變DNA元件的間隔，在接合處引入多余的氨基酸殘基，可能對融合蛋白的結構和功能產生不需要的影響，因此影響對融合基因精確的研究。這篇綜述討論了精確融合基因的應用之處，概括了實現(xiàn)無縫基因融合的方法。無縫基因融合及其應用無縫克隆和基因融合就是將兩個或者更多DNA片段精確結合在一起，在DNA片段的接合處沒有任何不需要的序列。這是獲得雜交基因的理想情況。以下強調幾個例子，以表明無縫基因融合的重要性。啟動子和外顯子研究基因啟動子含有許多調控元件。轉錄因子與它們結合并互相影響來調控轉錄。啟動子刪除分析使我們鑒定到這些功能元件，獲得關于基因調控機制的重要信息。然而，因為不同調控元件之間的間隔常常是非常重要的

3、，通常需要長度不變的linker來維持這些元件的間隔和螺旋面。基因啟動子的linker掃描分析需要無縫DNA融合或者序列替換技術。分子演化方法例如外顯子和DNA轉移來獲得具有需要生化和/或生理特征的蛋白也需要不同功能元件的無縫拼接。在真核細胞中，通過內含子介導的RNA拼接可以構建嵌合體基因和/或蛋白。在這些實驗中RNA底物的合成和/或外顯子標記核酶需要認真的設計，得到嵌合體前體基因。只要雜合基因形成正確，無縫融合就可以通過拼接實現(xiàn)。蛋白質功能研究和蛋白質工程蛋白質由有功能結構域構成。為了闡述一個蛋白某個結構域的功能，需要構建該結構域刪除或者被相似結構域替換的突變體。這種結構域刪除或者互換實驗將

4、在很大程度上得益于相關元件的無縫融合，來消除有操作序列所帶來的潛在的負面影響。更加概括地說，不同結構域的無縫融合對于蛋白質工程是非常重要的，包括獲得新的雜交分子和抗體改造。對于抗體改造，互補決定區(qū)嫁接（CDR-grafting）和定點突變是經(jīng)常要做的。嵌合體蛋白也可以通過內含肽介導的蛋白拼接和連接獲得。只要含有內含肽的前體蛋白沒有多余的序列，精確蛋白融合就可以實現(xiàn)。蛋白質表達標簽和融合伴侶的使用促進了蛋白質的表達。它們賦予蛋白的可溶性和穩(wěn)定性并促進接下來的目的蛋白的親和純化。在目的蛋白的活性不受到融合伴侶或者標簽影響的情況下，整個融合蛋白可以直接用到接下來的研究中。對于酶學研究和測定，通常是這

5、種情況。然而，在許多情況下，移除融合蛋白是必要的，這可以通過改造的蛋白酶酶切位點來完成。這個過程需要蛋白酶切位點和目的蛋白之間無縫的連接。為了進行功能研究，在一些情況下攜帶一個短標簽（比如his標簽）的融合蛋白被成功地結晶，移除這個標簽是不必要的。然而，如果帶有標簽的蛋白無法結晶，就難以估量標簽的影響，標簽的切除通常是必要的。在表達成熟和有活性蛋白的過程中，常常需要表達蛋白氨基酸序列與原來的一樣。例如RANTES（調控激活，正常的T表達和分泌）蛋白，interleukin-18（IL-18），IL-1和hirudin 蛋白的表達。在這些蛋白的N端加上甲硫氨酸殘基嚴重地降低了這些蛋白的活性。對于

6、RANTES，Met-RANTES被發(fā)現(xiàn)是天然RANTES的拮抗劑。如果要在大腸桿菌中表達完整N端蛋白，一個實用的方法就是將蛋白與N端標簽融合表達并純化。純化和重折疊（如果需要）之后，通過專一改造的蛋白酶酶切位點將標簽和不需要的序列切除。這個過程需要蛋白酶切位點和目的蛋白之間的無縫拼接。腸激酶，Xa因子和泛素特異性蛋白酶（Ubps）是常用的酶，這些酶可以切開識別序列的C端。煙草蝕刻病毒蛋白酶對于酶切位點下游的氨基酸殘基要求比較寬松，也可以用來去除融合標簽。ubiquitin/Ubp可能是第一個用來在體內和體外獲得完整N端蛋白蛋白的系統(tǒng)。在大腸桿菌中表達成熟的人類Apo A-I蛋白，Mogile

7、vsky和同事發(fā)現(xiàn)泛素標簽系統(tǒng)是最直接的方法之一?；蚪M操縱在模式生物中目的基因的敲除和敲入技術是體內分析基因功能的有力工具。這個過程常常包括整個開放閱讀框或者一部分編碼特殊結構結構域的基因的刪除，在一些情況下利用一個等位基因突變體或者同源基因序列的替換。這些研究需要產生敲出和敲入的載體，在其中所有的功能元件包括側翼序列，需要同源重組精確地連接到一起。無縫基因融合技術將會顯著地促進載體構建。Link及其同事利用重疊PCR技術獲得基因精確刪除的載體，用以在大腸桿菌基因組中進行功能研究。為了進行動物病毒繁榮分子和病理學研究和疫苗載體開發(fā)，經(jīng)常需要合成整個病毒基因組或者改造雜交病毒載體。利用無縫基因

8、融合技術看，Tount和同事用PCR片段成功地拼接了31.5Kb的重組病毒基因。無縫基因融合技術在PCR技術發(fā)明之前，DNA片段的無縫融合是通過復雜的程序完成的，涉及到利用細菌的基于噬菌體M113的定點突變，多核苷酸引物，linker和核酸外切酶，質粒在大腸桿菌中擴增。在一些情況下需要利用RecA依賴的同源重組。這些過程需要仔細的設計載體，需要復雜的程序。由于傳統(tǒng)方法的局限，僅僅有幾例利用這些方法進行無縫基因融合。一個例子就是利用一組突變載體進行基因啟動子的link掃描分析，另一個就是酵母中蛋白穩(wěn)定性分析。隨著PCR技術的出現(xiàn)，無縫基因融合有了很大的發(fā)展。已經(jīng)發(fā)展了幾種無縫基因融合的方法，許多

9、其他方法經(jīng)過修飾也可以用于此目的。這些方法將在下面討論并列舉在表1中。PCR常常是用來進行精確的DNA操控或者修飾DNA元件的末端用來進行合適的基因融合。利用這些創(chuàng)新的方法，我們操控DNA序列的水平達到了一個前所未有的水平。例如，在研究P1氨基酸殘基對腸激酶酶切融合蛋白的影響中，通過一種PCR和連接不依賴克隆的無縫基因融合技術構建了20個GSTEKXcalmodulin融合基因（其中X代表20個氨基酸的一種，GST是谷胱甘肽-S轉移酶）。重疊PCR在PCR技術發(fā)明之后就出現(xiàn)了重疊PCR技術。重疊PCr是一種非常有效的過程，不依賴與任和限制性酶切位點，在片段都可以擴增的前體下，任何兩個片段都可以

10、在任何確定的位點自由地結合到一起。利用相同的原則，多個DNA片段可以無縫拼接到一起，并成功地獲得了20 kB的重組融合基因。重疊PCR已經(jīng)被用以無縫的方式來進行點突變，插入，刪除和替換到一個基因的任何位置。PCR獲得的融合基因隨后可以克隆到合適的載體以進行下游應用。需要主意的是，重疊PCR的一個特例是基因合成，互相重疊的多核苷酸被用來作為PCR模板進行基因拼接。如果沒有合適的模板DNA進行PCR擴增，或/和雜交基因相對較短（500 bp），就可以采用這種方法。定點突變定點突變，包括點突變，插入，刪除和替換，是在包含一個目的基因的環(huán)形質粒模板上進行。刪除，插入或者替換突變通常是通過PCR完成。反

11、相PCR利用兩個方向相反的引物去擴增質粒，得到質粒任何位點點突變，刪除和插入的突變體。然而，PCR步驟會潛在地在質粒中引入錯誤序列。這個問題可以通過QuickChangee mutagenesis technology解決。如圖2所示，該方法依賴于兩條完全互補的突變引物和Pfu DNA聚合酶。因為引物彼此是完全互補的而且Pfu沒有鏈替換活性，在熱循環(huán)過程中，突變的雙鏈是以原始DNA為模板線性擴增的。因此，這種設計避免了DNA合成過程中錯誤的擴增。QuickChange技術及其改進技術可以用來在模板DNA的任何位點進行DNA插入，刪除或者序列替換，甚至可以同時將多個片段插入模板中。II S型內切

12、酶的應用IIS型限制性內切酶是一類可以從酶切位點外部將DNA切開的酶，例如SapI,BsaI a和FokI。它們被用來得到PCR片段的粘性末端，進行基因和病毒基因組的拼接。對于一些通用的基因，例如用于蛋白表達的純化標簽（例如麥芽糖結合蛋白），這個基因通常先插入表達載體。然后，這個載體可以作為受體，將不同的片段通過無縫克隆插入該載體。Stratagene 的pCal.n.EK載體是一個大腸桿菌表達載體，包含T7/lacOCBPEKMCS表達序列（CBP：鈣結合肽。MCS：開放閱讀框）。利用typeIIS內切酶Eam1104可以將目的基因DRF無縫地融合到CBP-EK的下游。CBP-EK-ORF融

13、合蛋白表達和純化后，用腸激酶切除CBP-EK多肽，可以得到完整的目的重組蛋白。在IMPACTM載體pTYB和pTWIN中，利用SapI可以使目的蛋白的ORF與內含肽無縫融合，以進行蛋白表達和隨后的蛋白拼接。IIS型限制性酶切位點也被用來構建目的載體以進行無縫克隆，使一個DNA片段與載體中已存在的DNA片段無縫融合。這是通過在質粒上的反向PCR實現(xiàn)的，引物包含IIS型限制位點。然后進行限制性酶切，得到帶有所需要粘性末端的載體。值得一提的是，基于IIS型限制性內切酶的方法需要同時消化載體和待插入的DNA片段。如果在DNA片段內部含有某種IIS型內切酶的酶切位點，可以將該位點甲基化，來抑制酶將片段從

14、中間切開?；蛘邠Q一種IIS型內切酶。片段和載體可以如圖3a所示拼接在一起。連接非依賴克隆（LIC）為了克服傳統(tǒng)構建雜交基因的剪切/粘貼方法的限制，人們開發(fā)了LIC克隆，不依賴與限制性內切酶和連接，將PCR片段克隆到載體中。該方法依賴于具有3-5外切酶活性的DNA聚合酶（T4或者Pfu聚合酶）,在DNA片段5端產生12個堿基的單鏈。因為其獨特的特征，LIC已經(jīng)被用來無縫連接編碼蛋白結構域的ORF，進行蛋白質的表達。利用含有核糖核苷的嵌合引物進行PCR，用其他試劑比如尿嘧啶DNA糖苷酶或者rare-earth metal ions處理PCR產物，也可以得到粘性末端。Jarrell及其同事采用包含三

15、個連續(xù)的核糖核苷或者一個2-O-甲基化核糖核苷來終止DNA在互補鏈的合成，在PCR過程中得到單鏈末端。應為這種方法簡單，可以促進高通量克隆實驗。In-FusionTM PCR克隆系統(tǒng)可以將末端含有與載體片段末端有15bp同源序列的片段克隆到任何線性化載體。然而，這種酶的成分還沒有公開。因為末端對于這種反省是非常重要的，載體片段需要特殊的處理，來實現(xiàn)插入片段與載體中已存在的ORF無縫融合。載體片段可以通過反向PCR制備或者用IIS型限制性內切酶處理，去除不需要的序列。In-FusionTM是迄今為止最為直接的PCR克隆系統(tǒng)，它將會促進PCR克隆的自動化。體內重組同源重組可以使含有同源區(qū)域的分子中

16、的遺傳序列相互交換。因為同源重組的位點可以自由地選擇，利用同源重組可以進行基因的無縫操作。這個過程曾被用于等位基因的替換，研究大腸桿菌和酵母細胞中基因的功能。這通常是一個兩步同源重組的過程。首先將帶有正選擇標記和負選擇標記的環(huán)形質粒整合到染色體或者附加型載體目的ORF的特異位點上。重組子通過正選擇標記篩選。接下來，通過負選擇標記反向選擇，用另外一個包含修飾ORF的片段替換選擇的片段。在這個過程中，基因是以無縫的方式在染色體上操作的。在酵母中，基因的在質粒上的操作是通過一步缺口修復完成，只需要30 bp的同源臂。使用PCR技術，用來進行缺口修復實驗的雜交載體可以利用刪除，插入和序列替換構建。酵母

17、-大腸桿菌-哺乳動物穿梭載體，被用來在釀酒酵母中構建無縫融合基因，然后在大腸桿菌回收質粒。大腸桿菌中的同源重組有三種機制：RecA依賴, RecA非依賴和Red/ET依賴。RecA結合到單鏈DNA片段，促進單鏈侵入并在同源序列見交換。RecA-介導的重組需要很長的同源區(qū)域（1 Kb），引發(fā)率較低。它被用來構建腺病毒重組基因組，在兩步等位替換實驗中修飾細菌人工染色體（BACs）和票P1衍生人工染色體（PACs）上的基因。RecA非依賴通路存在與recA細菌中，需要兩個重組片段的末端有12 bp的同源序列。兩個片段共轉化，得到環(huán)形質粒。然而，反應的具體機制還不清楚，而且克隆效率較低。在一個片段中加

18、入復制起點和選擇標記可以提高克隆效率。這個策略曾被用來高通量構建一些列的蛋白半胱氨酸突變體。Red/ET系統(tǒng)只需要線性載體和線性片段之間有30-50 bp的同源序列，就可以在大腸桿菌中有效地重組。該技術依賴噬菌體的于Red/Red蛋白或者Rac噬菌體的RecE/RecT蛋白，其中Red和RecE是5-3核酸外切酶，Red和RecT是單鏈DNA退火蛋白。在recBC sbcA突變菌株中，RecBCD外切酶的活性被抑制而隱蔽的Rac原噬菌體表達的RedE/RedT蛋白由sbcA突變激活，使線性片段之間的同源重組變?yōu)榭赡?。在recBC+菌株中，線性片段之間的同源重組可以通過RedE/RedT蛋白和R

19、ed基因產物的過表達實現(xiàn)。RecA-非依賴系統(tǒng)和Red/ET系統(tǒng)在功能上與酵母細胞的缺口修復系統(tǒng)相仿。帶有短臂的DNA片段可以利用PCR擴增，直接用于體內重組。這些大腸桿菌的缺口修復方式被用來構建表達載體，從復雜的來源中克隆基因以及染色體上的等位替換。結束語對于所有應用，無縫克隆和基因融合都是構建雜交DNA分子的理想情況。正如這里所討論的，在許多情況下，保證構建的載體中沒有多余的序列，對于直接的數(shù)據(jù)解釋是至關重要的。在某些情況下，多余的核苷酸或者氨基酸殘基的存在不會有影響，不殘留操作序列只會保證一個完美的設計。然而，盡管操作序列可能不會影響雜交分子的應用（比如酶學測試），但可能對于其他應用帶來

20、麻煩（例如結晶）。因此，構建完整的分子不僅提高數(shù)據(jù)質量也降低數(shù)據(jù)解釋的模糊性。然而，無縫克隆和基因融合也并不是沒有代價的。一些方法需要對插入片段和/或載體進行特殊的改造或者準備。例如，LIC載體的末端必須沒有多余的核苷酸殘基。所有提到的方法都依賴于PCR得到正確末端的片段和/或載體，實現(xiàn)無縫基因融合或克隆。盡管20世紀80年代后期，PCR的保真性還很差。隨著高保真DNA聚合酶（如Pfu DNA聚合酶）的使用，這個問題不再那么重要了。盡管如此，融合基因還是需要測序確認。另外，因為融合連接處沒有操作序列，融合基因或者它的一部分不能快速地轉移到其他載體上，這與“剪切/粘貼”位點特異性重組（Gatew

21、ayTM系統(tǒng)和CreatorTM系統(tǒng)）的方法有很大差別。如果可能的話，無縫系統(tǒng)和靈活的轉移系統(tǒng)應該結合起來。例如，雜交基因可以先通過重疊PCR無縫地拼接在一起，然后亞克隆到Gateway 入口載體，促進雜交ORF輕易地轉移到其他目的載體中。隨著雜交基因的無縫融合精確性的提高和轉移系統(tǒng)靈活性的提高，我們操控基因和DNA元件的能力有了很大的提高。這些技術將會在各個水平上促進載體的構建促進基因功能的研究，包括在動物模型或者細胞中進行基因敲除和敲入研究，突變體構建以及等位替換研究，異源蛋白表達和測試研究。Box1 無縫基因融合研究例1.突變掃描。突變掃描實驗是用來鑒定極影啟動子中國的順式調控元件或者研

22、究蛋白結構與功能的關鍵氨基酸殘基。對于一個基因啟動子，需要做linker掃描分析。構建一組DNA載體，用一個具體的linker片段替換啟動子的每個片段，來恢復原來的間隔。對于蛋白質，常常需要做丙氨酸掃描，構建一組突變體，每個帶電荷的氨基酸突變?yōu)楸彼帷Ｒ郧?，突變掃描載體的構建是一個費力的過程，需要泳道外切酶，linker和連接酶或者基于細菌噬菌體M13 定點突變。隨著PCR的出現(xiàn)，突變體可以輕松地利用overlap PCR或者體內重組獲得。例2.泛素標簽系統(tǒng)及其應用。泛素是一個高度保守的真核蛋白，含有76個氨基酸，天然中表達為多聚泛素。然后，在體內多聚泛素的C端泛素部分被泛素處理蛋白酶家族精確

23、地切割。泛素蛋白酶（Ubps）高度的專一性和獨特的切割方式使得泛素-Ubps成為一個在真核和原核細胞中基因表達的理想的標簽系統(tǒng)。為了研究在酵母中N端氨基酸對蛋白穩(wěn)定性的影響，Varshavsky及其同事建立了一組ubiquitin-X-gal無縫融合基因，其中X是二十種氨基酸中的一種。在酵母中，新生的的融合蛋白在體內去泛素化，使帶有不同N端殘基的X-gal蛋白暴露出來。在酵母中對這些X-gal蛋白穩(wěn)定性的研究 ，使我們發(fā)現(xiàn)了在體內N端對蛋白質穩(wěn)定性的影響。共翻譯處理也可以使蛋白在真核細胞中表達。在原核細胞中，因為缺少泛素蛋白酶，泛素融合蛋白并不是在體內加工的。融合蛋白純化之后，泛素標簽可以用純

24、化的Ubp進行體外切除。同樣，酵母的泛素樣修飾物（SUMO），SMT3，被用來作為大腸桿菌中蛋白表達的融合標簽。這個標簽可以在體外用SUMO水解酶（泛素樣蛋白酶1）去除。ubiquitin-Ubp蛋白是一個獨特的系統(tǒng)，可以表達帶有完整N末端的蛋白，前提是Ubiqitin-ORF是無縫的融合。例3.病毒基因組拼接。為了拼接一個31.5kb的全長的感染cDNA，Yount和同時利用一種無縫基因融合方法，使用了PCR和Type IIS限制性內切酶。為此 ，使用 末端帶有Esp3I酶切位點的引物，病毒基因組通過PCR擴增為7個相鄰的片段。Esp3I消化出去了PCR片段末端任何不需要的核苷酸殘基，留下了

25、專一的4堿基單鏈，與相鄰片段互補。逐步的連接反應得到全長病毒基因組定向的拼接。表1.無縫基因融合的方法克隆方法應用優(yōu)點缺點基因合成任意合成雜交基因或者新基因。得到含有任何所需變化的DNA片段設計融合基因的精確性在堿基水平。對任何ORF可以進行密碼子優(yōu)化 對于500bp的雜交基因適用。對于更長的片段效率降低。重疊PCR多個DNA片段的拼接定向DNA拼接，有效，不依賴與酶切位點需要多個PCR反應。雜交產物越長，PCR引入的錯誤的風險越高。對于1Kb）的同源序列。效率較低，通常需要選擇和/或反向選擇。RecA非依賴的重組大腸桿菌中點突變，刪除，插入。Linker掃描突變。點突變，刪除，插入。通常使用

26、DH5和JM109（recA 菌株）。只需要12 bp的同源臂。作用機制不清楚。在單獨的片段存在復制起點和選擇性標記，才最有效。Red/ET重組點突變，刪除，插入。從復雜產物中亞克隆基因。大腸桿菌的等位替換。需要30-50 bp的同源臂。載體片段可以通過反向PCR制備需要recBC sbcA突變菌株，例如JC8679或者過表達RedE/RedT/Red的recBC+突變菌株。酵母中缺口修復酵母中基因融合和亞克隆需要30bp同源臂，載體片段可以通過反向PCR制備骨架中需要酵母的復制七點和選擇性標記圖 1.重疊PCR。圖中所示DNA片段X和Y的無縫融合。兩個DNA片段分別由PCR擴增。引物P2和P

27、3的5端有15 pb是彼此互補的。PCR產物作為模版利用P1和P3進行第二次PCR擴增.P2和P3的互補部分可以是片段X或者片段Y的一部分。注意為了促進PCR的擴增效率，所有引物的Tm值應該相近，在55oC-75oC。圖2. QuickChangeTM定點突變進行無縫DNA操縱。圖表顯示構建突變體的步驟。 (a)，插入（b）或者刪除（c）。在所有情況下，都會泳道兩條互補的突變引物（或者長引物，圖b），在它們突變位點兩端都有15 bp的同源序列。利用Pfu聚合酶擴增之后，不需要的甲基化模板DNA和半甲基化的雜交體被限制性內切酶DpnI切割成片段。轉化之后，目的突變環(huán)形二聚體在大腸桿菌中恢復。質粒骨架包含復制起點（ori）和一個