細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí).

1、細(xì)胞培養(yǎng)王愛(ài)云王愛(ài)云參考書 司徒鎮(zhèn)強(qiáng)司徒鎮(zhèn)強(qiáng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念 傳代傳代 細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)一定時(shí)間后，被分開(kāi)接種到細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)一定時(shí)間后，被分開(kāi)接種到新的培養(yǎng)器皿中。新的培養(yǎng)器皿中。 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng) 取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞在取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。傳代之前稱為原代培養(yǎng)。 u細(xì)胞培養(yǎng)：使用單個(gè)細(xì)胞懸液細(xì)胞培養(yǎng)：使用單個(gè)細(xì)胞懸液u組織培養(yǎng)：使用組織塊（組織培養(yǎng)：使用組織塊（O.51立方毫米）立方毫米）或薄片（厚或薄片（厚0.2 毫米）毫米）u器官培養(yǎng)：使用器官原基或器官的一部分器官培養(yǎng)：使

2、用器官原基或器官的一部分或整個(gè)器宮或整個(gè)器宮原代培養(yǎng)細(xì)胞的生命歸宿原代培養(yǎng)細(xì)胞的生命歸宿p原代培養(yǎng)期原代培養(yǎng)期p傳代期傳代期p衰退期衰退期n有限細(xì)胞系，無(wú)限細(xì)胞系有限細(xì)胞系，無(wú)限細(xì)胞系 n細(xì)胞系細(xì)胞系 cell linen細(xì)胞株細(xì)胞株 cell strain （就是從細(xì)胞系篩選出（就是從細(xì)胞系篩選出來(lái)的，有特殊屬性的來(lái)的，有特殊屬性的 ）細(xì)胞來(lái)源細(xì)胞來(lái)源國(guó)內(nèi)細(xì)胞庫(kù)國(guó)內(nèi)細(xì)胞庫(kù):1. 武漢細(xì)胞庫(kù)武漢細(xì)胞庫(kù)/fzlbc/cell.doc2.昆明細(xì)胞庫(kù)昆明細(xì)胞庫(kù)http:/ http:/ http:/ http:/www.biotech.ist.unige.it/

3、cldb/labs.html 培養(yǎng)細(xì)胞的特性培養(yǎng)細(xì)胞的特性 培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式貼附生長(zhǎng)貼附生長(zhǎng)： 必須貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)。見(jiàn)于各種實(shí)體瘤必須貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)。見(jiàn)于各種實(shí)體瘤細(xì)胞細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)懸浮生長(zhǎng)： 于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)，不需要貼附于支持物表面。于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)，不需要貼附于支持物表面。見(jiàn)于各種見(jiàn)于各種造血系統(tǒng)造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)過(guò)程p 游離期游離期p 貼壁期貼壁期p 潛伏期潛伏期p 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期p 停止期（平臺(tái)期）停止期（平臺(tái)期）游離期游離期： 細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮

4、 狀態(tài)也稱懸浮期。狀態(tài)也稱懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。 10分鐘分鐘4小時(shí)小時(shí)貼壁期貼壁期： 細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細(xì)胞株平均在細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘分鐘一一4小時(shí)貼壁。小時(shí)貼壁。 底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等 血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長(zhǎng)基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因糖蛋白（生長(zhǎng)基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞

5、再與吸附有促貼壁因子的附著。著。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長(zhǎng)基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長(zhǎng)基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）潛伏期潛伏期 此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，而無(wú)細(xì)胞分裂。此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，而無(wú)細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為細(xì)胞株潛伏期一般為624小時(shí)。小時(shí)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期： 細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。停止期停止期（平臺(tái)期）：（平臺(tái)期）： 細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂分裂 機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的

6、條件1 細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要2 細(xì)胞的生存環(huán)境細(xì)胞的生存環(huán)境 溫度溫度: 37 O2 CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 滲透壓滲透壓 3 無(wú)污染無(wú)污染 4 無(wú)毒無(wú)毒實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用品實(shí)驗(yàn)用品 超凈工作臺(tái)，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，超凈工作臺(tái)，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸酸缸 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱 倒置顯微鏡倒置顯微鏡 酶標(biāo)儀、微孔板震蕩器酶標(biāo)儀、微孔板震蕩器 液氮液氮罐罐 自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀 耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動(dòng)吸引器，培養(yǎng)板，耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動(dòng)吸引器，培養(yǎng)板，

7、凍存管凍存管u壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣u電熱干燥箱：干熱消毒（電熱干燥箱：干熱消毒（160 ，2小時(shí)）。主要用干玻璃小時(shí)）。主要用干玻璃u器皿消毒器皿消毒 u濾器：過(guò)濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、濾器：過(guò)濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、 u酶液等均采用濾過(guò)法除菌酶液等均采用濾過(guò)法除菌 u超凈工作臺(tái)：為細(xì)胞操作提供無(wú)菌環(huán)境超凈工作臺(tái)：為細(xì)胞操作提供無(wú)菌環(huán)境u紫外燈紫外燈 ：紫外線消毒。：紫外線消毒。 主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺(tái)、塑料主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺(tái)、塑料u培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒超凈臺(tái)超凈

8、臺(tái)n超凈工作臺(tái)的工作原理是超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過(guò)高利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過(guò)高效濾器除去空氣中的塵埃顆效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐空氣徐徐通過(guò)工作臺(tái)面，使徐通過(guò)工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無(wú)菌環(huán)境。工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無(wú)菌環(huán)境。 三洋滅菌器三洋滅菌器濾器濾器COCO2 2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱uCO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ，5CO2 。u使用使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題：培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題： 用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。以保證通氣。 保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈

9、。定期消毒保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒(90 ，14 h)。 箱內(nèi)火菌蒸餾水箱內(nèi)火菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。自動(dòng)雙重純水蒸餾器自動(dòng)雙重純水蒸餾器純水儀純水儀微孔板震蕩器微孔板震蕩器酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀培 養(yǎng) 板培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿移液管，移液槍移液管，移液槍 常用玻璃器皿清洗常用玻璃器皿清洗 浸泡（自來(lái)水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡浸泡（自來(lái)水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小時(shí)）、小時(shí)）、 流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50烘干烘干清潔液的配制清潔液的配制2 細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制細(xì)胞培養(yǎng)用液

10、的配制水：新鮮配置的三蒸水或去離子水水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無(wú)平衡鹽溶液：無(wú)Ca2+、Mg2+的緩沖液的緩沖液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至加水至1000 ml 消化液消化液： 胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。胞分離。 胰蛋白酶液濃度胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過(guò)一定限越高，作用越強(qiáng)，但超過(guò)一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。度會(huì)損傷細(xì)胞。

11、 胰蛋白酶是一種黃白色胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無(wú)粉末，用無(wú)Ca2+Ca2+、Mg2+Mg2+的的PBSPBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.250.25。用濾。用濾器過(guò)濾除菌。器過(guò)濾除菌。 胰蛋白酶液消化時(shí)間：胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-102-10分鐘。分鐘。 用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天然培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和

12、牛胚浸液）。天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來(lái)源受限。缺點(diǎn)：來(lái)源受限。 成分復(fù)雜，成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。 易發(fā)生支原體污染易發(fā)生支原體污染 培養(yǎng)基培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。等。 合成培養(yǎng)基主

13、要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。無(wú)機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。 成本低成本低 缺點(diǎn)缺點(diǎn)： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。要。 人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。的天然培養(yǎng)基（如血清）。 血清中含有血清中含有：多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球

14、蛋白、鐵蛋白等）多種金屬離子；多種金屬離子； 激素；激素；促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。各種生長(zhǎng)因子各種生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)移蛋白轉(zhuǎn)移蛋白不明成分不明成分 一般說(shuō)來(lái)含一般說(shuō)來(lái)含5小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加不死但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加 10血清血清 對(duì)于血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對(duì)血清中的對(duì)于血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對(duì)血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚復(fù)雜成分至今尚未完全清楚 血清中不僅存在促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，同對(duì)也存在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子血清中不

15、僅存在促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，同對(duì)也存在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。 在生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要在生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞u無(wú)血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充各無(wú)血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充各種必需因子，如種必需因子，如激素、生長(zhǎng)因子激素、生長(zhǎng)因子 、結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白 、貼壁和貼壁和擴(kuò)展因子擴(kuò)展因子 等

16、。等。u無(wú)血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充成分組成。無(wú)血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充成分組成。u1975年，年，Sato首次成功地用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體首次成功地用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細(xì)胞株，近細(xì)胞株，近20多年來(lái)已報(bào)道了幾十種細(xì)胞系在無(wú)血清培多年來(lái)已報(bào)道了幾十種細(xì)胞系在無(wú)血清培養(yǎng)基中成功地生長(zhǎng)和增殖。養(yǎng)基中成功地生長(zhǎng)和增殖。u無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少了細(xì)胞污染，簡(jiǎn)化了提純和鑒定重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少了細(xì)胞污染，簡(jiǎn)化了提純和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序。各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序。向無(wú)清培養(yǎng)液中能促進(jìn)

17、細(xì)胞系生長(zhǎng)的補(bǔ)加物都是獨(dú)特的。適用于向無(wú)清培養(yǎng)液中能促進(jìn)細(xì)胞系生長(zhǎng)的補(bǔ)加物都是獨(dú)特的。適用于某種細(xì)胞株的培養(yǎng)液，很可能不適合另一種細(xì)胞株的生長(zhǎng)。即使某種細(xì)胞株的培養(yǎng)液，很可能不適合另一種細(xì)胞株的生長(zhǎng)。即使同源組織的不同細(xì)胞株，所需同源組織的不同細(xì)胞株，所需補(bǔ)加物補(bǔ)加物也不同。也不同。 無(wú)血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。無(wú)血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。 目前，絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用時(shí)還需添加血清目前，絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用時(shí)還需添加血清 u血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。u常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血常用血清有胎牛血清、新生牛血清、

18、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以清、馬血清等，其中以胎牛血清胎牛血清質(zhì)量最好。質(zhì)量最好。u優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污染。支原體、病毒污染。u血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56 ，30 分鐘分鐘u血清的消毒：過(guò)濾除菌血清的消毒：過(guò)濾除菌抗生素的使用抗生素的使用： 在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗生素，以抑制可在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗生素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)。能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)。 通常是通常是青霉素和鏈霉素青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青

19、霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升霉素最終使用濃度為每毫升100單位。單位。 慶大霉素：每毫升慶大霉素：每毫升100單位單位方便、廣譜、穩(wěn)定方便、廣譜、穩(wěn)定完全培養(yǎng)基的組成完全培養(yǎng)基的組成u基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基 8095u血清血清 520u碳酸氫鈉碳酸氫鈉 2.0 g/Lu青、鏈霉素青、鏈霉素 各各100U毫升毫升培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制 RPMI-1640培養(yǎng)粉培養(yǎng)粉 1袋袋 碳酸氫鈉碳酸氫鈉 2.0 g 青、鏈霉素青、鏈霉素 各各100單位毫升單位毫升 加三蒸水加三蒸水 至至 1000ml, 過(guò)濾除菌。過(guò)濾除菌。 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH值至值至7.2 加血清（終濃度加血清（終濃度 10） 細(xì)胞傳代方法

20、細(xì)胞傳代方法 根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的恃點(diǎn)，傳代方法有根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的恃點(diǎn)，傳代方法有3種。種。1 懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 離心法傳代：離心（離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。混勻傳代。 直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除l2一一23，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。 2 半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）細(xì)胞） 此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)

21、現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。3 貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 采用酶消化法傳代。常用的消化液有采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。的胰蛋白酶液。貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法1 吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液2 加入加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)）以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)）靜置靜置2-10 min（顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)）。（顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)）。3 吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。4 用吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞

22、，形成細(xì)胞懸液。用吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。5 吸取吸取1/101/40細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。6 加適量新鮮培養(yǎng)液于接種于細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。加適量新鮮培養(yǎng)液于接種于細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。7 將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)u血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞uCoulter計(jì)數(shù)儀：非人工計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)儀：非人工計(jì)數(shù)4 4個(gè)個(gè)1616格總數(shù)格總數(shù)4 4104個(gè)個(gè)/ml培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定細(xì)胞活力測(cè)定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的細(xì)胞活力測(cè)定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一

23、。技術(shù)手段之一。 任何培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)任何培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。臺(tái)盼藍(lán)法臺(tái)盼藍(lán)法 活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，用活細(xì)胞占活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，用活細(xì)胞占細(xì)胞中細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力的百分比表示細(xì)胞活力 已淘汰已淘汰四唑鹽（四唑鹽（MTTMTT）比色法）比色法 四唑鹽四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)商品名為噻唑藍(lán)， 四吐鹽比色法的原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四四吐鹽比色法的原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑唑鹽還鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formaza

24、n)，并沉淀在細(xì)胞，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。二甲亞砜（中，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值值 MTTMTT法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞新藥篩選、細(xì)胞毒牲試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)毒牲試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。等。操作步驟操作步驟 （1）單細(xì)胞懸液接種于）單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；孔培養(yǎng)板；103-104細(xì)胞細(xì)胞/孔，每孔培孔，每孔培養(yǎng)基總量養(yǎng)基總量20

25、0微升（微升（96孔培養(yǎng)板每孔容積孔培養(yǎng)板每孔容積370微升），微升），37、5CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間（根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時(shí)間）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間（根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時(shí)間） （2）加入）加入2毫克毫升的毫克毫升的MTT液（液（50微升孔）；繼續(xù)培養(yǎng)微升孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。小時(shí)。 （3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（液（150微升孔），將微升孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解。分鐘，使結(jié)晶物溶解。 （4）酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔）酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值（檢測(cè)波長(zhǎng)值（檢測(cè)波長(zhǎng)570nm）。記錄結(jié)果。）。記錄結(jié)果。細(xì)胞凍

26、存和復(fù)蘇細(xì)胞凍存和復(fù)蘇 細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。性變化。凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融 當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞大的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。慢凍程序慢凍程序 標(biāo)準(zhǔn)程序標(biāo)準(zhǔn)程序： 當(dāng)溫度在當(dāng)溫度在-25 以上時(shí)，以上時(shí)， 12 /min 當(dāng)溫度達(dá)當(dāng)溫度達(dá)-25 以下時(shí)，以下時(shí)， 510 /min 當(dāng)溫度達(dá)當(dāng)溫度達(dá)-100時(shí)，可迅速放入液氮中（時(shí)，可迅速放入液氮中（-196度）度） 細(xì)胞凍存器細(xì)胞凍存器 簡(jiǎn)易程序簡(jiǎn)易程序：