臨床常見細(xì)菌的耐藥性

1、細(xì)菌耐藥監(jiān)測重要性及臨床常見細(xì)菌的耐藥性魏蓮花 根據(jù)資料編輯整理20世紀(jì)后期?？咕幬锏陌l(fā)現(xiàn)和應(yīng)用控制了大多數(shù)由細(xì)菌引起的感染，明顯降低了與感染相關(guān)的死亡率。但細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)和傳播使得某些抗菌藥物逐漸失去其抗菌活性?？咕幬锬退幮缘娜蚧退幘甑膫鞑?，要求我們必須進(jìn)行全球范圍的細(xì)菌耐藥性監(jiān)測和研究工作。一、 細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)（一） 國內(nèi)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng) 國內(nèi)大型監(jiān)測系統(tǒng)包括經(jīng)上海復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗菌藥物研究所汪復(fù)教授為代表，有 14家醫(yī)院參加的CHINET監(jiān)測網(wǎng)；以北京大學(xué)臨床藥理李家泰教授和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院陳民鈞教授分別代表中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測研究組和醫(yī)院

2、內(nèi)病原菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)，是國內(nèi)跨地區(qū)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)網(wǎng)絡(luò)，分別涵蓋全國9個城市13家大型醫(yī)院和10個城市32家醫(yī)院；衛(wèi)生部于2006年組織建立了衛(wèi)生部細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)，參加單位已遍及全國29個省、市、自治區(qū)。我省于2009年成立了甘肅省細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)，目前有40家醫(yī)院參加。以上監(jiān)測網(wǎng)目的就是通過不同地區(qū)、不同級別的醫(yī)院細(xì)菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)收集和分析，闡明我國不同層次醫(yī)院臨床細(xì)菌分離株耐藥性差異。（二） 國際細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng) 1994衛(wèi)生組織總部傳染疾病監(jiān)測控制處理負(fù)責(zé)指導(dǎo)、協(xié)調(diào)各國的細(xì)菌耐藥性監(jiān)測工作。世界衛(wèi)生組織細(xì)菌耐藥性監(jiān)測合作中心主任Thomas OBrien教授啟動了旨在收集全球細(xì)

3、菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)的WHONET系統(tǒng)?，F(xiàn)國內(nèi)、外多數(shù)監(jiān)測網(wǎng)使用的分析軟件屬該系統(tǒng)。此外，約有315個醫(yī)院和400多個實驗室分別參加了美國醫(yī)院感染監(jiān)測系統(tǒng)（NNIS）和歐洲耐藥性監(jiān)測網(wǎng)（EARSS）。二、常見細(xì)菌耐藥性抗菌藥物的不合理應(yīng)用導(dǎo)致耐藥菌株引起的感染日趨增多。當(dāng)前，細(xì)菌耐藥性的監(jiān)測/檢測重點包括：（1）耐甲氧西林的葡萄球菌（MRS）；（2）耐萬古霉素的多重耐藥的腸球菌(VRE)；（3）耐-內(nèi)酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類的多重耐藥和肺炎鏈球菌(PRSP)；（4）產(chǎn)超廣譜-內(nèi)酰胺酶(ESBLS)及AmpC酶的革蘭陰性桿菌；（5）非發(fā)酵糖菌群的多重耐藥問題等。（6）耐碳?xì)涿瓜╊愃幬锏哪c桿菌科細(xì)菌(CRE

4、)。（一） 耐甲氧西林葡萄球菌 青霉素結(jié)合蛋白是細(xì)菌細(xì)胞壁全成過程中維持其生理功能不可缺少的酶蛋白系。-內(nèi)酰胺類抗菌藥物通過與細(xì)菌主要PBPs結(jié)合，使細(xì)菌胞壁全志過程中的交叉連接不能形成，由此影響?zhàn)る牡暮铣桑率辜?xì)胞不能合成細(xì)胞壁而溶菌死亡。耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（MRSA）是由結(jié)構(gòu)基因mecA編碼產(chǎn)生青霉素結(jié)合蛋白PBP-2a。我國醫(yī)院MRSA占金葡菌的40%-90%，高發(fā)區(qū)在燒傷病房、外科病房重癥監(jiān)護(hù)病房，多見于皮膚組織、傷口感染，帶機呼吸的下呼吸道感染、心內(nèi)膜炎、菌血癥等。 紙片法檢測葡萄球菌對甲氧西林的敏感性是用1ug的苯唑西林紙片，由于常出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，因此，2004年

5、美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）建議用30ug的頭孢西丁紙片替苯唑西林檢測mecA介導(dǎo)的葡萄球菌耐藥。（注：2011年CLSI更新為同時用頭孢西丁和苯唑西林進(jìn)行MRS檢測），結(jié)果應(yīng)報苯唑西林耐藥，而不是頭孢西丁耐藥。判定標(biāo)準(zhǔn)為金葡菌頭孢西丁抑菌環(huán)直徑小于等于19mm為苯唑西林耐藥；20mm苯唑西林敏感。凝固酶陰性葡萄球菌頭孢西丁抑菌環(huán)直徑24mm為苯唑西林耐藥；25mm為苯唑西林敏感。 有效控制耐甲西林葡萄球菌感染的流行，準(zhǔn)確地檢測是關(guān)鍵。常規(guī)藥敏試驗易受酸堿度、溫度、鹽濃度等因素的影響。聚合酶反應(yīng)（PCR）和DNA探針雜交檢測mecA基因具有特異、準(zhǔn)確的優(yōu)點。尤其是臨界耐藥菌株（MI

6、C 0.5-8.0ug/ml）中，用普通藥敏試驗方法容易出現(xiàn)錯誤，更需采用PCR和DNA探針雜交先等分子生物學(xué)方法進(jìn)行檢測。Francois等采用多重定量PCR技術(shù)，可直接對臨床標(biāo)本進(jìn)行MRSA和表皮葡萄球菌的快速檢測。首先采用免疫磁珠法收集金黃色葡萄球菌并提取細(xì)菌的DNA，然后采用多重定量PCR對金黃色葡萄球菌DNA下列片段同時進(jìn)行擴增：mecA和femA基因以及表皮葡萄球菌的femA基因每次可檢測30份標(biāo)本，它與最佳的細(xì)菌培養(yǎng)鑒定技術(shù)相比，該方法敏感性很好，且整個檢測過程可在6h內(nèi)完成。 自1996年第一株對萬古霉素中介的金黃色葡萄球菌（VISA）由日本報道以來，萬古霉素敏感降低的金葡菌備

7、受關(guān)注。2002年7月美國疾病控制中心確證并分布了世界第一例真正的萬古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌（VISA），此后又有兩例VRSA的報道。國內(nèi)文獻(xiàn)曾報道異質(zhì)性VISA。Wilcox等對英國的3713株金黃色葡萄球菌（其中39%MRSA）的調(diào)查表明，僅6株（0.16%）為異性VISA。目前VISA在臨床上的檢出率并不高，這一耐藥現(xiàn)象尚不是當(dāng)前金黃色葡萄球菌的主要耐藥問題，其重要性體現(xiàn)在耐藥發(fā)展趨勢上。用紙片擴散法來鑒定糖肽類抗體素中介或耐藥的葡萄球存在敏感和特異性問題，原因是中介株中紙片擴散法可能會在敏感的判定范圍內(nèi)。自動化藥敏鑒定儀如MicroScan、VITEK及WITEK 2也不能對萬古霉素

8、耐藥金葡菌的MIC進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，其萬古霉素的MIC常在敏感范圍內(nèi)。因此，含6 ug/ml萬古霉素腦心浸液篩選平板，肉湯和瓊脂MIC法，濃度梯度法仍然檢測萬古霉素非敏感葡萄球菌的推薦方法。（二） 腸球菌 腸球菌對萬古霉素耐藥主要有5種表型VanA、VanB、VanC、VanD和VanE，分別由不同的耐藥基因簇編碼，除VanC為天然耐藥外，其余均為獲得性耐藥。VanA對萬古霉素和替考拉寧呈高水平耐藥；VanB對萬古霉素呈不同程度耐藥，對替考拉寧敏感；VanC對兩種抗菌藥物呈低水平耐藥。耐萬古霉素腸球菌實驗室檢測主要有紙片擴散法、瓊脂篩選法和分子生物學(xué)等方法。紙片擴散法在檢測VanC型腸球

9、菌時容易漏檢，分子生物學(xué)方法如PCR方法靈敏度較高。有文獻(xiàn)介紹用多重PCR檢出10株對萬古霉素耐藥或中介腸球菌，其中4株基因型為VanC1，3株為VanC2，VanA型1株。國內(nèi)腸球菌對青霉素和氨基糖苷類抗菌藥物修飾滅活。腸球菌中的氨基糖苷鈍化酶主要為雙功能酶AAC（6）-APH（2），表達(dá)這種雙功能鈍化酶的基因為aac（6）-le-ph（2）-la另一種基因為aph（2）-ld也與氨基糖苷高度耐藥性有關(guān)。（三） 耐青霉肺炎鏈球菌（PRSP）和耐氨芐西林的流感嗜血桿菌 自1967年第一株P(guān)RSP發(fā)現(xiàn)對青霉素不敏感的肺炎鏈球菌以來，在世界范圍內(nèi)有關(guān)PRSP流行、傳播的報道不斷增多。Mu

10、hlemann等對呼吸道感染兒童鼻咽部肺炎鏈球菌的攜帶狀況調(diào)查結(jié)果顯示，從急性中耳炎或肺炎門診患兒（17歲）的鼻咽拭子分離培養(yǎng)出1176株肺炎鏈球菌，平均攜帶率為43%?；貧w分析結(jié)果顯示，年齡（2歲）和近期抗菌藥物使用史是PRSP攜帶的危險因素。 北京、上海、廣州和西安四地區(qū)654株肺炎鏈菌耐藥性監(jiān)測的數(shù)據(jù)顯示，不同地區(qū)青霉素非敏感率在14%-60%，且上海和廣州地區(qū)的較北京和西安高。王輝等20022003年對北京、上海、沈陽、杭州和武漢地區(qū)社區(qū)獲得性感染肺炎鏈球菌耐藥率調(diào)查表明，不同地區(qū)間肺炎鏈球菌對青霉素的非敏感率存在較大差異。此外，上述資料表明，這國肺炎鏈球菌對青霉素的耐藥性在逐年上升。

11、但肺炎鏈球菌臨床分離株對阿莫西林/克拉維酸及三代頭孢菌素較好的敏感性。PRSP多重耐藥主要以紅霉素、四環(huán)素、復(fù)方磺胺甲惡唑及氯霉素為主。我國肺炎鏈球菌對紅霉素耐藥率很高，高耐株（MIC256ug/ml）占耐藥菌株的80%-90%。 肺炎鏈球菌對大環(huán)內(nèi)脂類的耐藥主要是由于（1）核糖體靶位點的改變；（2）主動外排機制增強；（3）產(chǎn)生修飾酶。Erm基因編碼23SRNA甲基化酶而使核糖體靶位點改變，此機制可以引起大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素類、鏈陽菌素B的交叉耐藥。即MLSB表型。而由mefE基因型編碼主動外排系統(tǒng)介導(dǎo)的耐藥，只對14、15環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥，對16環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類，林可霉素類、鏈陽菌素B敏感。北美

12、以mefE基因介導(dǎo)的耐藥表型較為常見。而在西班牙和意大利，最為常見的耐藥表型為MLSB。核糖體突變（erm基因編碼）是國內(nèi)肺炎鏈球菌耐紅霉素的主要機制，與歐洲地區(qū)的結(jié)果相似。 北京、上海、廣州和西安等地兒童進(jìn)行的流感嗜血桿菌攜帶和耐藥性調(diào)查表明，氨芐西林的耐藥率處于較低水平（4.8%-9.7%）。頭孢克洛的耐藥率（1.9%）低于氯毒素耐藥率（5.7%-11.5）。上海地區(qū)2000-2002年964株流感嗜血桿菌中，-內(nèi)酰胺酶陽性有增長趨勢（2000年為13.0%、2001年為17.2%、2000年為20.0%）。雖然對臨床單純流感嗜血桿菌的感染氨芐西林具有很好的療效，但該菌的耐藥性發(fā)展趨勢值得

13、注意。（四） 產(chǎn)超廣譜-內(nèi)酰胺酶擴AmpC酶的革蘭陰性桿菌 我國各地區(qū)及醫(yī)院產(chǎn)超廣譜內(nèi)酰胺酶（ESBLs）大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌分離不同，一般在15%-35%左右。不同國家和地區(qū)由于抗菌藥物使用的種類和數(shù)量的不同，與之相應(yīng)的ESBLs流行類型也不同。德國的主要流行類型為SHV-2和TEM-52，法國為TEM-24、TEM-3和SHV-4，美國主要為TEM-2、10和26，亞洲韓國為SHV-12、SHV-2a和TEM-52，我國臺灣省主要為CTX-M-3、SHV-12和SHV-5。 CTX-M型ESBLs產(chǎn)酶株的菌譜及地域分布極為廣泛，是導(dǎo)致某些地區(qū)ESBLs產(chǎn)酶株傳播或流行的主要基

14、因型。國內(nèi)醫(yī)院感染ESBLs產(chǎn)酶株的分子流行病學(xué)研究表明，CTX-M型酶最為常見的基因型。CTX-M對頭孢噻肟具有高水解活性，而對頭孢他啶水解力弱，為等電點（pI）高的ESBLs。朱戌冬等21對80株肺炎克雷伯菌臨床株進(jìn)行了ESBLs檢測、pI試驗和分子遺傳學(xué)的酶型分析，發(fā)現(xiàn)了一種CTM-M酶。鑒定為CTX-M-3，pI為88，對頭孢他啶活性僅為MIC2ug/ml。我國ESBL主要為CTX-M，與我國頭孢噻肟的用量多于其他三代頭孢菌素有關(guān)。北京協(xié)和醫(yī)院1995-1999年，頭孢噻肟的用量從19增加到102，而頭孢他啶僅從9增加到15，可以推測產(chǎn)CTX-M的ESBL菌株的出現(xiàn)與此有關(guān)。魏澤慶等對

15、6株臨床分離的肺炎克雷伯菌進(jìn)行濃度梯度法藥敏試驗、結(jié)合試驗、-內(nèi)酰胺酶等電聚焦電泳、脈沖場凝膠電泳及PCR產(chǎn)物克隆測序，鑒定為一種新型CTX-M-22酶。陸堅等在378株革蘭陰性菌中，產(chǎn)ESBLs菌株為64株。其中產(chǎn)CTX-M-3酶的有13株，占20%。CTX-M-3、CTX-M-9、CTX-，-15、CTX-M-17和CTX-M-21型酶定位在1型整合子或轉(zhuǎn)痤子等可轉(zhuǎn)移基因元件上，并可能通過轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)在不同細(xì)菌間播散。 SHV起源的ESBLs主要位于肺炎克雷伯菌，其突變位點主要在238、240、179及35等。其中238位點的突變提高了酶對頭孢噻肟的水解，而240的突變提高了酶對頭孢他啶的水

16、解力。臨床攜帶SHV型ESBLs菌株有的對頭孢噻肟耐藥較強（SHV-2、3），有的對頭孢他啶耐藥較強（SHV-6、8），有的兩者均耐藥（SHV-4、5）。文獻(xiàn)報道4株產(chǎn)SHV-12的肺炎克雷伯菌，其耐藥表型為頭孢他啶耐藥，對頭孢噻肟或耐藥或中介。上述研究表明，國內(nèi)臨床分離菌中所產(chǎn)生-內(nèi)酰胺的復(fù)雜性和多樣性，同時也可能是導(dǎo)致臨床菌株耐藥水平高、耐藥譜擴大的原因之一。 AmpC酶：通常認(rèn)為，陰溝腸桿菌對三代頭孢菌素的碉藥主要是由高產(chǎn)AmpC酶介導(dǎo)，由ESBL介導(dǎo)的耐藥居于次要的地位。佘丹陽等在106株陰溝腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，單純高產(chǎn)AmpC酶占16.0%（17/106），單純產(chǎn)ESBL占10.4%（11

17、/106），高產(chǎn)AmpC酶全并產(chǎn)ESBL的占13.2%（14/106）。因此，高產(chǎn)AmpC酶和產(chǎn)ESBL介導(dǎo)的耐藥幾乎處于同樣重要的意義。野生狀態(tài)下，大多數(shù)陰溝腸桿菌只能誘導(dǎo)性產(chǎn)生AmpC酶，ampD基因的突變可以使細(xì)菌獲持續(xù)高產(chǎn)AmpC酶的能力。在陰溝腸桿菌中，這種去阻遏突變的發(fā)生頻率高達(dá)10-5-10-8，-內(nèi)酰胺類抗菌藥物對這種去阻遏突變的選擇作用是導(dǎo)致高產(chǎn)AmpC酶菌株迅速蔓延的主要原因之一。 由于檢測方法的不同，各地區(qū)對產(chǎn)AmpC酶的陰溝桿菌報道不同。有文獻(xiàn)在144株陰溝腸桿菌中檢出有120株AmpC基因陽性（83.3%）。在120株AmpC基因陽性菌株中，36株為高水平表達(dá)（30.

18、0%），誘導(dǎo)表達(dá)為45株（37.5%），未表達(dá)或低水平表達(dá)39株（32.5%）。有56株合并產(chǎn)生ESBLs，占46.7%。AmpC酶是染色體介導(dǎo)的頭孢菌素酶，通常情況下，這種酶低水平表達(dá)，但在-內(nèi)酰胺抗菌藥物存在的情況下，產(chǎn)酶量會大大增加，因此又稱誘導(dǎo)酶，細(xì)菌產(chǎn)AmpC酶的量常與細(xì)菌種類及ampG。大部分腸菌科細(xì)菌均存在染色體介導(dǎo)的ampD基因，且在腸桿菌科細(xì)菌中具有高度同源性。 細(xì)菌耐藥性的演化大致可分為自身遺傳物質(zhì)的突變和接受外源性耐藥基因兩種。肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌均具有容納外源性遺傳物質(zhì)的特性，作為醫(yī)院感染重要的病原菌，繼ESBL后又出現(xiàn)質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC型酶，使耐藥問題日益復(fù)雜。北

19、京協(xié)和醫(yī)院在16株產(chǎn)AmpC酶的大腸埃菌和肺炎克雷伯菌中，發(fā)現(xiàn)1株可通過接合試驗將耐藥基因傳遞給受體菌，這是國內(nèi)首次報道的在大腸埃菌中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒型AmpC酶。NCCLS尚未提供AmpC酶的檢測方法，臨床實驗室通常根據(jù)耐藥表型（二、三代頭孢菌素耐藥、雙紙片協(xié)同試驗陰性、對四代頭孢菌素敏感）綜合判斷。藥敏試驗中需包含頭霉素類和含酶抑制劑的復(fù)合制劑是許多學(xué)者的共識。 碳青霉烯酶：是指所有明顯水解亞胺培南或美洛培南等碳青霉烯類的一類內(nèi)酰胺酶，分別屬于Ambler分子分類中的A類、B類、D類酶。其中A類為KPC酶，B類為金屬酶，在Bush分群中為第三組，可由染色體、質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子介導(dǎo)，由后者編碼的獲得性金屬

20、酶可見于銅綠膿假單胞菌、鮑曼不動桿菌和腸桿菌科細(xì)菌；A類和D類為絲氨酯酶，屬于Bush分群中的2f和2d亞組。A類酶見于一些腸桿菌科細(xì)菌，D類酶僅見于不動桿菌。常見的金屬酶基因型有IMP、VIM、LI等，其酶的檢測方法一般采用PCR方法，由于早期報道的PCR引物序列發(fā)現(xiàn)的基因型別較少，但應(yīng)根據(jù)新發(fā)現(xiàn)的型別調(diào)整PCR引物序列，并對PCR引物進(jìn)行測序方可確認(rèn)亞型型別。 紙片檢測產(chǎn)酶株方法：菌株粗酶提取物，用三維試驗法進(jìn)行酶型檢測。以產(chǎn)AmpC酶和ESBL（如ATCC 700603）菌株作為陽性對照。抑制劑為克拉維酸、鄰氯西林和EDTA。抑制劑與酶粗提取物以1：9比例混合加入三維試驗的槽內(nèi)，經(jīng)352

21、4h培養(yǎng)后，觀察結(jié)果。若加抑制劑槽的周圍矢狀菌苔消失，即為抑制試驗為陽性，即該菌產(chǎn)AmpC酶。若克拉給維酸試驗為陽性，即該菌產(chǎn)ESBL；若鄰氯西林單獨加入時抑酶試驗為陽性，反之為陰性，即該菌產(chǎn)AmpC酶。若克拉維酸或鄰氯西林單獨加入時抑酶試驗為陰性，同時加入為陽性時，這說明該菌同時產(chǎn)AmpC酶和ESBL兩種酶，當(dāng)同時加入克拉維酸和鄰氯西林抑酶試驗仍為陰性，該菌可能產(chǎn)生耐抑制劑的-內(nèi)酰胺酶，若能水解亞胺培南且可被EDTA所抑制即為金屬-內(nèi)酰胺酶。紙片法檢測金屬-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生：將500mmol/L EDTA 10ul分別加到頭孢他啶和亞胺培南紙片上，按紙片擴散法檢測菌株頭孢他啶、頭孢他啶/EDTA、亞胺培南，亞胺培南/EDTA的抑菌環(huán)直徑，EDTA能使相應(yīng)抗菌藥物的抑菌環(huán)直徑擴大為5mm者，判為金屬-內(nèi)酰胺酶陽性，瑞典AB Biodisk公