植物組織培養(yǎng)第4章 植物組織培養(yǎng)中常見問題及解決辦法

1、第四章第四章 植物組織培養(yǎng)中常見問植物組織培養(yǎng)中常見問題及解決辦法題及解決辦法本章教學(xué)目的、要求本章教學(xué)目的、要求 ： 理解并掌握植物組培易發(fā)問題、其產(chǎn)理解并掌握植物組培易發(fā)問題、其產(chǎn)生的原因及調(diào)控方法，并能夠采取有效生的原因及調(diào)控方法，并能夠采取有效措施解決污染、褐變和玻璃化等常見問措施解決污染、褐變和玻璃化等常見問題題 教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)：教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)： 植物組培易發(fā)問題產(chǎn)生的原因及調(diào)控植物組培易發(fā)問題產(chǎn)生的原因及調(diào)控方法方法 主要內(nèi)容：主要內(nèi)容：第一節(jié)第一節(jié) 污染原因和防治措施污染原因和防治措施第二節(jié)第二節(jié) 外植體的褐變及其防治外植體的褐變及其防治第三節(jié)第三節(jié) 試管植物的玻璃化現(xiàn)象及其試管

2、植物的玻璃化現(xiàn)象及其 防治措施防治措施第四節(jié)第四節(jié) 其他問題及對策其他問題及對策第二節(jié)第二節(jié) 外植體的褐變及其防治外植體的褐變及其防治發(fā)生的時間：初代培養(yǎng)外植體發(fā)生的時間：初代培養(yǎng)外植體一、原理一、原理：目前認(rèn)為植物組織培養(yǎng)中的褐變主要是由酶促褐變引起的，培養(yǎng)目前認(rèn)為植物組織培養(yǎng)中的褐變主要是由酶促褐變引起的，培養(yǎng)材料變褐主要是由傷口處分泌的酚類化合物引起的。酶促褐變?nèi)绮牧献兒种饕怯蓚谔幏置诘姆宇惢衔镆鸬?。酶促褐變?nèi)缤话愕拿复俜磻?yīng)，其發(fā)生必須具備三個條件，即酶、底物和氧。同一般的酶促反應(yīng)，其發(fā)生必須具備三個條件，即酶、底物和氧。酚類很不穩(wěn)定，在溢出過程中與多酚氧化酶接觸，在酚類很不穩(wěn)

3、定，在溢出過程中與多酚氧化酶接觸，在多酚氧化酶的催化下，迅速氧化成褐色的醌類物質(zhì)和多酚氧化酶的催化下，迅速氧化成褐色的醌類物質(zhì)和水，醌類物質(zhì)又會在酪氨酸酶等的作用下，與外植體水，醌類物質(zhì)又會在酪氨酸酶等的作用下，與外植體組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，進(jìn)一步引起其他酶系統(tǒng)失組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，進(jìn)一步引起其他酶系統(tǒng)失活。從而導(dǎo)致組織代謝活動紊亂，生長停滯，最終衰活。從而導(dǎo)致組織代謝活動紊亂，生長停滯，最終衰老死亡。此外，由于組織的老化病變也會使多酚氧化老死亡。此外，由于組織的老化病變也會使多酚氧化酶激活而引起褐變。酶激活而引起褐變。 在正常發(fā)育的植物組織中在正常發(fā)育的植物組織中,底物、氧氣、底物、氧

4、氣、多酚多酚氧化酶氧化酶(PPO)同時存在并不發(fā)生褐變，是因為在正同時存在并不發(fā)生褐變，是因為在正常的組織細(xì)胞內(nèi)由于常的組織細(xì)胞內(nèi)由于多酚類物質(zhì)分布在細(xì)胞的液泡多酚類物質(zhì)分布在細(xì)胞的液泡內(nèi)內(nèi)，而，而PPO則分布在各種質(zhì)體或細(xì)胞質(zhì)中則分布在各種質(zhì)體或細(xì)胞質(zhì)中，這種區(qū)，這種區(qū)域性分布使底物與域性分布使底物與PPO不能接觸。而當(dāng)細(xì)胞膜的結(jié)不能接觸。而當(dāng)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化和破壞時，則為酶創(chuàng)造了與構(gòu)發(fā)生變化和破壞時，則為酶創(chuàng)造了與PPO接觸的接觸的條件，在氧存在的情況下使酚類物質(zhì)氧化成醌，進(jìn)條件，在氧存在的情況下使酚類物質(zhì)氧化成醌，進(jìn)行一系列的脫水、聚合反應(yīng)，最后形成黑褐色物質(zhì)，行一系列的脫水、聚合反

5、應(yīng)，最后形成黑褐色物質(zhì)，從而引起褐變。從而引起褐變。二、褐變的主要原因二、褐變的主要原因植物品種間的差異植物品種間的差異 基因基因生理狀態(tài)生理狀態(tài) 成年幼齡成年幼齡培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基成分 高無機(jī)鹽、細(xì)胞分裂素高無機(jī)鹽、細(xì)胞分裂素培養(yǎng)條件不當(dāng)培養(yǎng)條件不當(dāng) 強(qiáng)光照、高溫度、培養(yǎng)時間強(qiáng)光照、高溫度、培養(yǎng)時間 過長過長三、減輕褐變現(xiàn)象發(fā)生的方法三、減輕褐變現(xiàn)象發(fā)生的方法選擇合適的外植體選擇合適的外植體 最好選擇生長處于旺盛的外植體，這最好選擇生長處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。合適的培養(yǎng)條件合適的培養(yǎng)條件 降低無機(jī)鹽成分、植物生長物質(zhì)水平和降低無機(jī)鹽成分、植物生長

6、物質(zhì)水平和溫度，暗培養(yǎng)，低溫過度等；溫度，暗培養(yǎng)，低溫過度等；使用抗氧化劑使用抗氧化劑 在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸、在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸、PVP（聚乙烯吡咯烷酮）等抗氧化劑能夠較為有效地避免或聚乙烯吡咯烷酮）等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。使用吸附劑活性炭使用吸附劑活性炭 0.1%-0.5%的活性炭對防止褐變也有的活性炭對防止褐變也有較為明顯的效果。較為明顯的效果。連續(xù)轉(zhuǎn)移連續(xù)轉(zhuǎn)移 對容易褐變的材料可間隔對容易褐變的材料可間隔1224h的培養(yǎng)后，再的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過

7、連續(xù)處理7-l0d后，褐變現(xiàn)象后，褐變現(xiàn)象便會得到控制或大為減輕。便會得到控制或大為減輕。 第三節(jié)第三節(jié) 試管植物的玻璃化現(xiàn)象及其防治措施試管植物的玻璃化現(xiàn)象及其防治措施玻璃化現(xiàn)象：玻璃化現(xiàn)象：常發(fā)生在常發(fā)生在繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng) 當(dāng)植物材料不斷地進(jìn)行離體繁殖時，有些培養(yǎng)物的當(dāng)植物材料不斷地進(jìn)行離體繁殖時，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會呈半透明水漬狀的現(xiàn)象。嫩莖、葉片往往會呈半透明水漬狀的現(xiàn)象。玻璃化試管苗的生理失調(diào)癥：玻璃化試管苗的生理失調(diào)癥： 莖、葉表面無蠟質(zhì)，體內(nèi)的極性化合物水平較高，莖、葉表面無蠟質(zhì)，體內(nèi)的極性化合物水平較高，細(xì)胞持水力差，植株蒸騰作用強(qiáng)，無法進(jìn)行正常移栽。細(xì)胞持水力差，植株

8、蒸騰作用強(qiáng)，無法進(jìn)行正常移栽。原因：原因： 不同種類、品種間，試管苗的玻璃化程度也有所差不同種類、品種間，試管苗的玻璃化程度也有所差異；濕度大；光照強(qiáng)度過低；培養(yǎng)基細(xì)胞分裂素水平較異；濕度大；光照強(qiáng)度過低；培養(yǎng)基細(xì)胞分裂素水平較高。高。玻璃化玻璃化具體解決的方法為：具體解決的方法為：1、培養(yǎng)基成分：、培養(yǎng)基成分：增加培養(yǎng)基中的溶質(zhì)水平，增加培養(yǎng)基中的溶質(zhì)水平，以降低培養(yǎng)基的水勢；減少培養(yǎng)基中含氮化合以降低培養(yǎng)基的水勢；減少培養(yǎng)基中含氮化合物的用量；物的用量；2、培養(yǎng)條件：、培養(yǎng)條件：增加光照；增加容器通風(fēng)，最增加光照；增加容器通風(fēng)，最好進(jìn)行好進(jìn)行CO2施肥，這對減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)施肥，這對減

9、輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象有明顯的作用；降低培養(yǎng)溫度，進(jìn)行變溫培象有明顯的作用；降低培養(yǎng)溫度，進(jìn)行變溫培養(yǎng)，有助于減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生養(yǎng)，有助于減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生3、生長調(diào)節(jié)劑：、生長調(diào)節(jié)劑：降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素含量，可以考慮加入適量脫落酸。含量，可以考慮加入適量脫落酸。 -第四節(jié)第四節(jié) 其他問題及對策其他問題及對策遺傳穩(wěn)定性問題遺傳穩(wěn)定性問題，即保持原有良種特性問題。雖然遺傳穩(wěn)定性問題，即保持原有良種特性問題。雖然植物組織培養(yǎng)中可獲得大量形態(tài)、生理特性不變的植物組織培養(yǎng)中可獲得大量形態(tài)、生理特性不變的植株，但通過愈傷組織或懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)的苗木，經(jīng)植株，但通過愈傷

10、組織或懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)的苗木，經(jīng)常會出現(xiàn)一些體細(xì)胞變異個體，雖然其中有些是有常會出現(xiàn)一些體細(xì)胞變異個體，雖然其中有些是有益變異但更多的是不良變異諸如觀賞植物不開花、益變異但更多的是不良變異諸如觀賞植物不開花、花小或花色不正；果樹植物不結(jié)果、抗性下降或果花小或花色不正；果樹植物不結(jié)果、抗性下降或果小、產(chǎn)量低、品質(zhì)差等問題，在生產(chǎn)上造成很大損小、產(chǎn)量低、品質(zhì)差等問題，在生產(chǎn)上造成很大損失，并容易引起經(jīng)濟(jì)糾繪，如香蕉試管苗中的不良失，并容易引起經(jīng)濟(jì)糾繪，如香蕉試管苗中的不良變異表現(xiàn)植株矮小、不結(jié)果，給果農(nóng)造成損失。變異表現(xiàn)植株矮小、不結(jié)果，給果農(nóng)造成損失。 體細(xì)胞無性系變異的頻率相當(dāng)高，且不能逆轉(zhuǎn)，有的

11、高達(dá)體細(xì)胞無性系變異的頻率相當(dāng)高，且不能逆轉(zhuǎn)，有的高達(dá)40%60%，如非，如非洲堇的個別品種、玉簪等，有的高達(dá)洲堇的個別品種、玉簪等，有的高達(dá)100%，如馬鈴薯、菠蘿等。，如馬鈴薯、菠蘿等。 （一） 影響遺傳穩(wěn)定性的因素 1、基因型 基因型不同，發(fā)生變異的頻率也不同。在玉簪中，雜色葉培養(yǎng)的變異頻率為43%，而且綠色葉僅為1.2%。甘蔗品系H37-1933和H50-7209中得到的再生植株分別有12.1%和34.8%變異香龍血樹愈傷組織培養(yǎng)再生植株全部發(fā)生變異嵌合體植株通過組培，其嵌合性更大。單倍體和多倍體變異大于二倍體。2、繼代次數(shù) 根據(jù)報道，試管苗的繼代培養(yǎng)次數(shù)和時間影響植物穩(wěn)定性，是造成變

12、異的關(guān)鍵因素。一般隨繼代次數(shù)和時間的增加，變異頻率不斷提高。 3、發(fā)生方式、發(fā)生方式 ：以莖尖、莖段等發(fā)生不定芽的方式繁：以莖尖、莖段等發(fā)生不定芽的方式繁殖不易發(fā)生變異或變異率極低。甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)通過節(jié)殖不易發(fā)生變異或變異率極低。甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)通過節(jié)培法繁殖名貴葡萄品種，經(jīng)培法繁殖名貴葡萄品種，經(jīng)5年年8年繼代培養(yǎng)，其變年繼代培養(yǎng)，其變異頻率與常規(guī)方法相同，在數(shù)成株中僅發(fā)現(xiàn)一株變異異頻率與常規(guī)方法相同，在數(shù)成株中僅發(fā)現(xiàn)一株變異此外用菊花莖尖、腋芽培養(yǎng)，變異較低，而從花瓣誘此外用菊花莖尖、腋芽培養(yǎng)，變異較低，而從花瓣誘導(dǎo)的變異較高。由花椰菜根誘導(dǎo)的不定芽和再生植株導(dǎo)的變異較高。由花椰菜根誘導(dǎo)的不定芽

13、和再生植株中有不少變異，而從頂端分生組織（花菜）產(chǎn)生的中有不少變異，而從頂端分生組織（花菜）產(chǎn)生的4000個再生植株基本沒有變異。通過愈傷組織和懸浮個再生植株基本沒有變異。通過愈傷組織和懸浮培養(yǎng)分化不定芽的方式獲得再生植株變異率較高。通培養(yǎng)分化不定芽的方式獲得再生植株變異率較高。通過分化胚狀途徑再生植株變異較少，通過莖尖或分生過分化胚狀途徑再生植株變異較少，通過莖尖或分生組織培養(yǎng)增殖側(cè)芽可以保持基因型基本不變。在高濃組織培養(yǎng)增殖側(cè)芽可以保持基因型基本不變。在高濃度的激素作用下，細(xì)胞分裂和生長加快，不正常分裂度的激素作用下，細(xì)胞分裂和生長加快，不正常分裂頻率增高，再生植株變異也增多。頻率增高，再

14、生植株變異也增多。 （二）提高遺傳穩(wěn)定性，減少變異的措施 在進(jìn)行植物快速微繁時，應(yīng)盡量采用不易發(fā)生體細(xì)在進(jìn)行植物快速微繁時，應(yīng)盡量采用不易發(fā)生體細(xì)胞變異的增殖途徑，以減少或避免植物個體或細(xì)胞發(fā)胞變異的增殖途徑，以減少或避免植物個體或細(xì)胞發(fā)生變異，如采用生長點(diǎn)、腋芽生枝、胚狀體繁殖方式，生變異，如采用生長點(diǎn)、腋芽生枝、胚狀體繁殖方式，可有效地減少變異縮短繼代時間，限制繼代次數(shù)，每可有效地減少變異縮短繼代時間，限制繼代次數(shù)，每隔一定繼代次數(shù)后，從新開始接外植體進(jìn)行新的繼代隔一定繼代次數(shù)后，從新開始接外植體進(jìn)行新的繼代培養(yǎng)；取幼年的外植體材料；采用適當(dāng)?shù)纳L調(diào)節(jié)物培養(yǎng)；取幼年的外植體材料；采用適當(dāng)?shù)?/p>

15、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)種類和較低的濃度；減少或不使用培養(yǎng)基中容易引質(zhì)種類和較低的濃度；減少或不使用培養(yǎng)基中容易引起誘變的化學(xué)物質(zhì)；定期檢測、及時剔除生理、形態(tài)起誘變的化學(xué)物質(zhì)；定期檢測、及時剔除生理、形態(tài)異常苗，并進(jìn)行多年跟蹤檢測，調(diào)查再生植株開花結(jié)異常苗，并進(jìn)行多年跟蹤檢測，調(diào)查再生植株開花結(jié)實特性，以確定其生物學(xué)性狀和經(jīng)濟(jì)性狀是否穩(wěn)定。實特性，以確定其生物學(xué)性狀和經(jīng)濟(jì)性狀是否穩(wěn)定。補(bǔ)充內(nèi)容：補(bǔ)充內(nèi)容：花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng)1、花藥培養(yǎng)的一般操作、花藥培養(yǎng)的一般操作 材料選?。翰牧线x?。簡魏酥?、晚期花粉為宜單核中、晚期花粉為宜一般在接種前預(yù)先用醋酸洋紅、一般在接種前預(yù)先用醋酸洋紅、IKI溶液等染溶液等染色壓

16、片鏡檢，確定花粉發(fā)育的時期。色壓片鏡檢，確定花粉發(fā)育的時期。（煙草：花雷和花冠大約與萼片等長（煙草：花雷和花冠大約與萼片等長禾谷類作物：孕穗期，剝出的花藥呈淡綠色。禾谷類作物：孕穗期，剝出的花藥呈淡綠色。材料預(yù)處理材料預(yù)處理：低溫、高溫、生長素及其它方法處理提高愈傷組織和苗分化頻率低溫預(yù)處理按作物不同而不同消毒：消毒：花雷或幼穗的表面消毒用70%酒精次氯酸鈉1020分鐘或0.1%升汞710分鐘。操作熟練僅用70%酒精表面消毒后即取花藥接種接種：接種：培養(yǎng)：培養(yǎng)：2、花藥培養(yǎng)時花粉發(fā)育途徑、花藥培養(yǎng)時花粉發(fā)育途徑離體條件下，改變了花粉原來的生活環(huán)境，花粉的正常發(fā)育途徑受到抑制有四種發(fā)育方式：有四種發(fā)育方式：（1）營養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育途徑（）營養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育途徑（A型）型）花粉經(jīng)第一次有絲分裂形成不均等營養(yǎng)核和生殖核，生殖核一般不分裂或分裂幾次就退化，營養(yǎng)核經(jīng)多次分裂而形成