影響光學(xué)顯微鏡成像的若干因素

1、影響光學(xué)顯微鏡成像的若干因素影響光學(xué)顯微鏡成像的若干因素影響光學(xué)顯微鏡成像的若干因素影響光學(xué)顯微鏡成像的若干因素 夫瑯和費圓孔衍射 艾里斑 點擴散函數(shù) 瑞利判據(jù) 夫瑯和費圓孔衍射 光波繞過障礙物傳播的現(xiàn)象稱為光的衍射。衍射后所形成的明暗相間的圖樣稱為衍射圖樣 在夫瑯和費圓孔衍射中，光源、觀察屏與障礙物之間的距離都是無限遠，障礙物為一直徑為R的圓孔（顯微鏡的物鏡可與該障礙物相當）夫瑯和費衍射圖樣的觀察 利用兩塊會聚透鏡，一塊放在障礙物前，將點光源發(fā)出的光變?yōu)槠叫泄?，另一塊放在障礙物后，使經(jīng)過障礙物后的衍射光在透鏡的焦平面上成像艾里斑 由圓孔衍射圖樣的第一暗環(huán)包圍的中央亮斑稱為艾里斑（Airy d

2、isc）。理論計算表明，艾里斑的光強占整個入射光強的84%。艾里斑的半徑為 其中f是透鏡L2的焦距， 是入射光的波長，R是圓孔的半徑?？梢钥吹?，孔徑R越小，或者波長越大，衍射現(xiàn)象越明顯R2f22. 1r 圓孔衍射現(xiàn)象是顯微鏡成像過程中不可避免的現(xiàn)象，它對顯微鏡的分辨率將產(chǎn)生重大的影響 點擴散函數(shù) 從理想情況看，點光源通過一個無缺陷的光學(xué)系統(tǒng)后應(yīng)在像平面獲得對應(yīng)的點像，但是由于圓孔衍射現(xiàn)象的存在，點光源在焦平面上的成像實際為一個光斑。 為了能夠?qū)嶋H光學(xué)系統(tǒng)的性質(zhì)做出正確描述，將一個直徑為無限小的理論點光源通過光學(xué)系統(tǒng)后的成像性質(zhì)用點擴散函數(shù)（point spread functionpoint

3、 spread function，PSFPSF）表示點擴散函數(shù) 一般而言，點擴展函數(shù)是不可能精確得到的。由于光學(xué)系統(tǒng)的聚焦不良、樣品與光學(xué)系統(tǒng)之間的相對運動等引起的圖像模糊是影響系統(tǒng)成像質(zhì)量的主要原因，因此根據(jù)圖像降質(zhì)（退化）物理過程的先驗知識，可以估計出成像系統(tǒng)的點擴展函數(shù)點擴散函數(shù) 因為一個成像系統(tǒng)對函數(shù)的沖擊響應(yīng)能夠反映該系統(tǒng)具有的衍射、像差以及一切造成光能量擴散的固有性質(zhì)，所以輸入為函數(shù)時系統(tǒng)的輸出函數(shù)即為成像系統(tǒng)的點擴散函數(shù)瑞利判據(jù) 點擴散函數(shù)對光學(xué)系統(tǒng)的分辨率有著重要的影響 利用顯微鏡觀察樣品，其圖像可以看成有許多不同亮度、不同位置物點的像所組成。每個物點所成的像實際上是一定大小的

4、艾里斑，物點靠得太近，物點所成的像彼此重疊，樣品的細節(jié)變得模糊不清 衍射現(xiàn)象限制了光學(xué)系統(tǒng)分辨細節(jié)的能力瑞利判據(jù) 物理學(xué)家瑞利（Rayleign）指出，A衍射圖樣的中央最大光強度與B衍射圖樣的第一最小光強度重合所確定的兩物點間的距離就是光學(xué)系統(tǒng)所能分辨的兩物點間的極限距離。稱這個極限距離為瑞利判據(jù) A.N61. 0Z瑞利判據(jù)瑞利判據(jù) 隨著兩物點距離的縮小，光學(xué)系統(tǒng)由于衍射現(xiàn)象以及總光強的疊加最終不能分辨出相應(yīng)的物點光學(xué)顯微鏡成像的數(shù)學(xué)模型將顯微鏡中圖像的形成看作是一個線性過程，在這個過程中，樣品上的每一點與物鏡的點擴散函數(shù)進行卷積，從而獲得一幅觀察圖像。 顯微鏡成像的數(shù)字模型 其中 表示觀察圖

5、像， 表示理想圖像， 表示顯微鏡系統(tǒng)的點擴散函數(shù)。 )z, y, x( s)z, y, x(o)z, y, x( i) z , y, x( i)z, y, x(o)z, y, x( s圖像復(fù)原 由觀察圖像復(fù)原理想圖像，在數(shù)學(xué)上來說是一個逆向問題。如果顯微鏡系統(tǒng)的點擴散函數(shù)PSF是已知的話，則可以通過逆向運算，復(fù)原理想圖像去卷積 去模糊法（deblurring）最近鄰域法 圖像復(fù)原法（image restoration）約束迭代法反向濾波法 去卷積圖像約束迭代法（constrained iterative） 首先實現(xiàn)對理想圖像的最初估計，一般是原始圖像自身。用估計圖像和點擴散函數(shù)進行卷積，獲得模糊的估計圖像 將該圖像與最初的原始圖像進行比較。比較結(jié)果用于確定誤差尺度，它將描述模糊的估計圖像與原始圖像的相似程度 利用誤差尺度，在減少誤差的前提下修改估計圖像。約束迭代法（constrained iterative） 用修改后的估計圖像與點擴散函數(shù)進行卷積，計算新的誤差尺度 隨著算法的進行，每一次確定的誤差標準并非最小，進行新的估計圖像的再模糊過程，重新計算誤差尺度 整個迭代