酵母細胞表面展示

1、酵母細胞表面展示技術(shù)及其在高通酵母細胞表面展示技術(shù)及其在高通量篩選中的應(yīng)用量篩選中的應(yīng)用 目錄 酵母細胞表面展示酵母細胞表面展示技術(shù)技術(shù)的概述的概述 酵母細胞表面展示酵母細胞表面展示技術(shù)在技術(shù)在高通量篩選中的應(yīng)用高通量篩選中的應(yīng)用酵母細胞表面展示技術(shù)概念酵母細胞表面展示技術(shù)基本原理酵母細胞表面展示技術(shù)常見系統(tǒng)酵母細胞表面展示技術(shù)酵母細胞表面展示技術(shù)的概述的概述酵母細胞表面展示技術(shù)的特點酵母細胞表面展示技術(shù)酵母細胞表面展示技術(shù)的的概述概述 酵母細胞表面展示技術(shù)(Surface Display)是一種真核蛋白表達系統(tǒng)。它是一類篩選蛋白質(zhì)突變體庫的高通量 篩選方法，在抗體蛋白的研究中應(yīng)用尤 其廣泛，

2、具有高效、靈敏等特點，在醫(yī) 藥、食品、生物燃料等多個工業(yè)領(lǐng)域都 有廣泛的應(yīng)用前景。 基本原理：是將外源靶蛋白基因與特定的載體基因序列融合后導入酵母細胞，用酵母細胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運機制將目的蛋白轉(zhuǎn)移至細胞表面并且固定在細胞膜上。與其它表面展示系統(tǒng)相比,酵母表面展示系統(tǒng)可克服真核蛋白在原核細胞表達時活性降低或失活的缺點。 最最常見的酵母表面展示表達系統(tǒng)常見的酵母表面展示表達系統(tǒng)包括包括: : 凝集素凝集素展示表達展示表達和和絮凝素展示絮凝素展示表達表達 是將外源基因與酵母編碼-凝集素C端編碼序列(含GPI錨定信號序列)連接后插入質(zhì)粒載體的信號肽下游,融合蛋白誘導表達后,信號肽引導嵌合蛋白向細胞外分泌,

3、由于融合蛋白C-末端存在含GPI錨定信號的凝集素多肽序列 ,可將蛋白錨定在酵母細胞壁中,從而將蛋白分子展示表達在酵母細胞表面。凝集素展示表達凝集素展示表達凝集素系統(tǒng)又分為-凝集素(Ag)系統(tǒng)和a-凝集素(Aga) 系統(tǒng)在-凝集素系統(tǒng)中，凝集素的 C 端可錨定在酵母細胞壁的葡聚糖上，外源蛋白作為N端與凝集素C端融合，在信號肽引導下分泌表達，從而實現(xiàn)了外源蛋白的展示表達。a-凝集素是 Agalp 和Aga2p亞單位通過二硫橋相連，其中 Agalp 通過-葡聚糖共價連接在細胞壁上，目的蛋白與Aga2p的N端融合表達后，再通過Agalp與酵母細胞壁的共價連接而展示在細胞表面。絮凝素展示表達系統(tǒng)利用絮凝

4、素基因與外源蛋白融合,并將融合蛋白展露表達在細胞表面，此系統(tǒng)又包括兩個子統(tǒng):GPI錨定系統(tǒng)錨定系統(tǒng)和絮凝結(jié)構(gòu)域錨定絮凝結(jié)構(gòu)域錨定系統(tǒng)系統(tǒng)。 GPIGPI錨定系統(tǒng)錨定系統(tǒng)是利用絮凝素FLo1p的 C -末端含有的GPI信號錨定外源蛋白,此系統(tǒng)與凝集素展示相似。 絮凝結(jié)構(gòu)域錨定系統(tǒng)絮凝結(jié)構(gòu)域錨定系統(tǒng)是利用 FLo1p的中間絮凝功能結(jié)構(gòu)域與外源蛋白融合，通過絮凝功能結(jié)構(gòu)域識別酵母細胞壁中的甘露聚糖鏈并非共價作用誘導細胞粘附、聚集成可逆性絮狀物。絮凝素展示表達絮凝素展示表達酵母表面展示技術(shù)的特點表達偏差小融合蛋白相對分子質(zhì)量范圍大篩選、純化、活性測定方便融合蛋白分子數(shù)量多特點酵母表面展示酵母表面展示系

5、統(tǒng)的應(yīng)用酒精發(fā)酵生物吸附高通量篩選 為了簡化纖維素乙醇生產(chǎn)工藝，實現(xiàn)纖維素利用與乙醇發(fā)酵的同步進行，莫春玲等通過酵母細胞表面展示技術(shù)，以釀酒酵母菌株 Saccharomyces cerevisiae Y5 為受體，通過絮凝素 (Flo1p) 錨定方式，將來自絲狀真菌里氏木霉 Trichoderma reesei 的內(nèi)切葡聚糖酶(EGII)、纖維二糖水解酶(CBHII)以及來自棘孢曲霉 Aspergillusaculeatus 的 -葡糖苷酶(BGLI) 展示在細胞表面，構(gòu)建同時表達 3 種纖維素酶的酵母菌群系統(tǒng)。 經(jīng)過免疫熒光驗證展示酶的細胞蛋白定位，酶活測定，乙醇發(fā)酵性能驗證，結(jié)果表明：展示

6、表達的3種纖維素酶具有良好的穩(wěn)定性和功能活性；乙醇發(fā)酵 該系統(tǒng)已經(jīng)得到成功開發(fā)，但是在這一領(lǐng)域里仍有許多亟待解決的問題，例如：展示在細胞表面的纖維素酶的活性與游離酶相比有所下降；成功展示的纖維素酶穩(wěn)定性有待提高。 即使如此，利用酵母表面展示技術(shù)表達纖維素酶的新型酵母菌群進行纖維素乙醇發(fā)酵效果還不是很理想，乙醇產(chǎn)率較低，難以滿足實際生產(chǎn)需求。在EGII、CBHII和BGLI協(xié)同作用下重組酵母菌株能夠水解溶脹磷酸纖維素 (Phosphoric acid swollen cellulose，簡稱 PASC)并產(chǎn)生乙醇，乙醇濃度達到最大值0.77 g/L，乙醇產(chǎn)量為 0.35 g/L，相當于理論值的6

7、8.6%。酵母細胞表面展示技術(shù)在高通量篩選酵母細胞表面展示技術(shù)在高通量篩選中的中的應(yīng)用應(yīng)用高通量篩選的概念1酵母細胞展示在HTS中的主要應(yīng)用3高通量篩選的技術(shù)過程2高通量篩選（HTS）又稱大規(guī)模集群式篩選，是由高容量化合物庫、自動化操作、高靈敏度檢測、高特異篩選模型、高效率數(shù)據(jù)處理5個子系統(tǒng)有機組合而成，是一種新型的篩選技術(shù)。高通量篩選的技術(shù)過程 1、樣品庫 2、初篩和復(fù)篩 3、活性化合物 4、深入篩選 5、獲得少量先導化合物 6、確證篩選藥物藥理學研究 7、侯選藥物 8、臨床前研究酵母展示在高通量篩選中的應(yīng)用藥物篩選 把酵母應(yīng)用于藥物篩選，最早始于利用酵母雙雜交技術(shù)來確定藥物靶點。 隨之發(fā)展

8、起來的基于靶點的藥物篩選至今已有大量成功先例。選擇的靶點基本上可分為四種類型：離子通道離子通道、核核受體受體、G 蛋白偶聯(lián)受體蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)和酶酶。直接活性篩選可通過酵母系統(tǒng)直接進行化合物活性篩選，這主要源于兩種情況: (1)在離子轉(zhuǎn)運缺陷的酵母菌株中重建人的離子通道，會產(chǎn)生補充生長的表型；(2)在酵母中表達離子通道蛋白可導致酵母生長缺陷。 在篩選離子通道抑制劑時，前種情況可篩選那些導致酵母生長受抑的化合物，而后種情況下則可篩選那些能使酵母細胞恢復(fù)生長的化合物。離子通道 Hahnenberger和Kurtz 建立了酵母展示的系統(tǒng)來篩選鉀離子通道、質(zhì)子通道和鈉/氫離子通道的抑制劑。其

9、中，流行性感冒質(zhì)子通道蛋白M2的表達能導致酵母生長缺陷，因此，理論上那些能使酵母恢復(fù)生長的化合物就是M2的抑制劑。據(jù)此，他們篩選得到了一個流行性感冒質(zhì)子通道蛋白的抑制劑。此外，在利用生長抑制的方法進行抑制劑篩選實驗中，由于那些具細胞毒性的化合物雖然不是離子通道抑制劑，也能阻礙酵母生長。為此，Hahnenberger和Kurtz設(shè)計了微生理測量計，能檢測出反映離子通道功能的pH變化，為假陽性的剔除提供了一個快速的二次檢驗方法。酵母雙雜交篩選由于離子通道蛋白是多亞基結(jié)構(gòu)，亞基間的作用一旦被破壞，離子通道的功能就會受到影響，因此，利用酵母雙雜交可篩選那些破壞亞基間相互作用的化合物，即該離子通道的抑制

10、劑。Young等成功篩選得到了能抑制N-型鈣離子通道3亞基和1B 亞基間相互作用的化合物，且這些化合物在隨后的功能性實驗中的確表現(xiàn)出了鈣離子通道抑制劑的活性。這些工作不僅成功地將酵母雙雜交應(yīng)用于藥物篩選，而且還把酵母雙雜交成功地引入到膜蛋白相互作用的研究中。 核受體Taniguchi等建立了一個酵母雙雜交系統(tǒng)來篩選人過氧化物酶體增殖劑激活受體(PPAR)的激動劑與半激動劑。G蛋白偶聯(lián)受體在此類篩選中，工程酵母中的酵母接合信息素受體Ste2p 為人的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)所取代，同時在可篩選的報告基因上游引入接合特有的啟動元件。這種工程酵母可用于高通量篩選人G 蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)的

11、半激動劑和激動劑。一般來說，酶通常不需要幾個蛋白共同作用來發(fā)揮其功能，且酶的結(jié)構(gòu)各異，因此，酶抑制劑的篩選比以上幾種蛋白要困難得多。酶通常被選的展示系統(tǒng)應(yīng)該滿足以下幾個條件：1. 表達偏差應(yīng)該是最小的，以便DNA庫的多樣性可代表正確折疊蛋白質(zhì)的多樣性。2. 要有定量篩選的標準。3. 被選系統(tǒng)必須能很好的區(qū)分僅有微弱親和力差別的突變體。定向進化為什么要通過酵母細胞展示進行高通量篩選1. 雖然噬菌體表面展示在抗原表位分析、抗體篩選、抗體酶和蛋白酶抑制劑研究 等方面得到廣泛、成功的應(yīng)用，但是噬菌體表面展示利用原核表達系統(tǒng)，不能展示需糖基化、二硫鍵異構(gòu)化等翻譯后修飾才表現(xiàn)功能活性的復(fù)雜真核蛋白 。2. 酵母表面展示系統(tǒng)彌補了噬菌體展示技術(shù)的此項不足 ,能使復(fù)雜真核蛋白得到展示, 同時又保留了噬菌體表面展示技術(shù)的便于篩選、 擴增等優(yōu)點 。1. 釀酒酵母的蛋白質(zhì)折疊和分泌機制與哺乳動物細胞非常相似，因而比原核細胞更能正確表達和展示人的蛋白質(zhì)。 2. 與噬菌體不同，酵母是個足夠大的顆粒，可用流式細胞儀進行篩選和分離，這就使得基于特異定量親和力改變的突變體分離成為可能。 3. 由于酵母展示的蛋白質(zhì)是緊密錨定在細胞壁上，可以耐