第5章蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析

1、 人體基因數(shù)目僅比低等生物線蟲多兩倍。人體基因數(shù)目僅比低等生物線蟲多兩倍。如此少的基因是如何創(chuàng)造出人體如此復(fù)雜如此少的基因是如何創(chuàng)造出人體如此復(fù)雜的生命活動？的生命活動？ 人體基因的主要功能是通過蛋白質(zhì)來實現(xiàn)人體基因的主要功能是通過蛋白質(zhì)來實現(xiàn)的，的，蛋白質(zhì)扮演著構(gòu)筑生命大廈的主要角蛋白質(zhì)扮演著構(gòu)筑生命大廈的主要角色。色。人體中大約有人體中大約有1010萬種蛋白質(zhì)。萬種蛋白質(zhì)。 測定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的意義測定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的意義vX-X-射線晶體衍射法：射線晶體衍射法：85.3% 85.3% v核磁共振波譜：核磁共振波譜：14.7%14.7%v電鏡三維重構(gòu)、各種光譜技術(shù)、顯微電鏡三維重構(gòu)、各種光譜技術(shù)、

2、顯微 技術(shù)和計算機(jī)模擬技術(shù)和計算機(jī)模擬 l 1895年年11月月8日日 ,德國物德國物理學(xué)家，理學(xué)家，50歲的倫琴在歲的倫琴在自己的實驗室中偶然發(fā)自己的實驗室中偶然發(fā)現(xiàn)現(xiàn) 一種從陰極射線管一種從陰極射線管中輻射出的新型射線，中輻射出的新型射線，由于對管子發(fā)出的由于對管子發(fā)出的“東東西西”性質(zhì)不確定，倫琴性質(zhì)不確定，倫琴就把這種射線命名為就把這種射線命名為“X射線射線” 。圖片出處: http:/ 倫琴實驗室倫琴實驗室人類第一張人類第一張X光照片光照片圖片出處:http:/ 倫琴妻子之手倫琴妻子之手 1896年年1月月23日倫日倫琴將這一重大發(fā)現(xiàn)在維琴將這一重大發(fā)現(xiàn)在維爾茲堡物理醫(yī)學(xué)會上報爾茲堡

3、物理醫(yī)學(xué)會上報告。告。Kolliker教授提議教授提議將該射線命名為將該射線命名為“倫琴倫琴射線射線”,但倫琴卻說：但倫琴卻說：“我還沒有徹底解釋這我還沒有徹底解釋這種射線的發(fā)生現(xiàn)象，還種射線的發(fā)生現(xiàn)象，還是稱它為是稱它為X射線最恰射線最恰當(dāng)。當(dāng)?！?威廉威廉康拉德康拉德倫琴倫琴 Wilhelm Conrad Rntgenl1901年第一屆諾貝爾物理學(xué)獎評選時，年第一屆諾貝爾物理學(xué)獎評選時，29封推薦信中就有封推薦信中就有17封集中推薦他。倫封集中推薦他。倫琴最終獲得了第一次諾貝爾物理學(xué)獎金琴最終獲得了第一次諾貝爾物理學(xué)獎金圖片出處http:/ X射線本質(zhì)射線本質(zhì) X射線是一種短波長射線是一種

4、短波長(0.00510nm)、高能量高能量(2.5105 1.2102eV)的電磁波。的電磁波。它是原子內(nèi)層電子在高速運動電子流沖它是原子內(nèi)層電子在高速運動電子流沖擊下，產(chǎn)生躍遷而發(fā)射的電磁輻射。擊下，產(chǎn)生躍遷而發(fā)射的電磁輻射。l 一般由高速電子撞擊金屬產(chǎn)生。如圖所示，是一種產(chǎn)生一般由高速電子撞擊金屬產(chǎn)生。如圖所示，是一種產(chǎn)生X射線的真空管，射線的真空管，K是發(fā)射電子的熱陰極，是發(fā)射電子的熱陰極，A是由鉬、鎢或是由鉬、鎢或銅等金屬制成的陽極。兩極之間加有數(shù)萬伏特的高電壓，銅等金屬制成的陽極。兩極之間加有數(shù)萬伏特的高電壓，使電子流加速，向陽極使電子流加速，向陽極A撞擊而產(chǎn)生撞擊而產(chǎn)生X射線。射線

5、。AX射線衍射射線衍射l1912年年Max von Laue發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)X射線具有衍射線具有衍射的現(xiàn)象。（射的現(xiàn)象。（1914年的諾貝爾物理學(xué)獎）年的諾貝爾物理學(xué)獎）圖片出處圖片出處: :http:/ 勞厄的實驗裝置勞厄的實驗裝置 圖片出處圖片出處:http:/ l X射線衍射分析所依賴的基本原理是射線衍射分析所依賴的基本原理是X射線衍射現(xiàn)象射線衍射現(xiàn)象l X射線衍射現(xiàn)象射線衍射現(xiàn)象利用利用X射線的波長和晶體中原子的大小及射線的波長和晶體中原子的大小及原子間距同數(shù)量級的特性來分析晶體結(jié)構(gòu)。原子間距同數(shù)量級的特性來分析晶體結(jié)構(gòu)。 l 當(dāng)當(dāng)X射線入射到樣品晶體分子上時，分子上的每個原子使射線入射到樣品

6、晶體分子上時，分子上的每個原子使X射線發(fā)生散射，這些散射波之間相互疊加形成衍射圖形。射線發(fā)生散射，這些散射波之間相互疊加形成衍射圖形。 l 衍射圖形能給出樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)的許多資料，如原子間的衍射圖形能給出樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)的許多資料，如原子間的距離距離、鍵角鍵角，分子的，分子的立體結(jié)構(gòu)立體結(jié)構(gòu)、絕對構(gòu)型絕對構(gòu)型、原子和分子、原子和分子的的堆積堆積、有序或無序的、有序或無序的排列排列等。等。 X X射線通過紅寶石晶體射線通過紅寶石晶體( (a)a)和硅單晶體和硅單晶體( (b)b)所拍攝的勞厄斑所拍攝的勞厄斑圖片出處圖片出處:http:/ 勞倫斯勞倫斯布拉格布拉格( Lawrence Bragg) 因在

7、用因在用X射線研究晶體結(jié)構(gòu)方面所作出的杰出貢射線研究晶體結(jié)構(gòu)方面所作出的杰出貢獻(xiàn)獻(xiàn) ,亨利亨利布拉格布拉格（William Henry Bragg）和和勞倫勞倫斯斯布拉格布拉格（William Lawrence Bragg）父子分享了父子分享了1915年的諾貝爾物理學(xué)獎。年的諾貝爾物理學(xué)獎。圖片出處圖片出處50/nobel/nobel1.htm 圖片出處圖片出處/physics/laureates/1915/wl-bragg-bio.html l 20世紀(jì)世紀(jì)60年代解析一個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可以獲年代解析一個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可以獲

8、得諾貝爾獎；得諾貝爾獎；l 20世紀(jì)世紀(jì)70年代解析一個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)則可成年代解析一個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)則可成 為轟動世界的新聞；為轟動世界的新聞； l 20世紀(jì)世紀(jì)80年代解析一個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)則可申請到教授的職位；年代解析一個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)則可申請到教授的職位；l 20世紀(jì)世紀(jì)90年代解析一個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)通常可以獲得博士學(xué)位；年代解析一個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)通常可以獲得博士學(xué)位；l 今天，一個博士研究生也許就可解析多個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，但如今天，一個博士研究生也許就可解析多個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，但如果沒有深入研究其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，往往不能畢業(yè)。果沒有深入研究其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，往往不能畢業(yè)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的發(fā)展蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的發(fā)展

9、饒子和院士饒子和院士HIV基質(zhì)蛋白基質(zhì)蛋白 SARS射線衍射用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測定射線衍射用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測定l1954年年伯納爾伯納爾(Bernal)獲得第一張胃蛋白獲得第一張胃蛋白酶晶體衍射圖片。酶晶體衍射圖片。l1957年年肯特羅肯特羅(Kendrew)完成肌紅蛋白完成肌紅蛋白的的0.6 nm分辨率的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分辨率的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)圖片出處:http:/www.drg.de/data/wuerdigungen/Nobelpreise/RoenNobel.htm 圖片出處:http:/www2.mrcmb.cam.ac.uk/archive/gal/source/kendrew.html

10、 肌紅蛋白的三維結(jié)構(gòu)肌紅蛋白的三維結(jié)構(gòu) 肌紅蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型肌紅蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型圖片出處:http:/ http:/ www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/ archive/Kendrew62.html 1959年年佩魯茨佩魯茨(Perute)完成血完成血紅蛋白紅蛋白0.55分辨分辨率的晶體結(jié)構(gòu)率的晶體結(jié)構(gòu)圖片出處:http:/www.hsgq.pudong- (1962) 血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu) 模型模型圖片出處http:/ 血紅蛋白分子就是由二個由血紅蛋白分子就是由二個由141個氨基酸殘基組成的個氨基酸殘基組成的亞基和二個由亞基和二個由146個氨基酸個氨基酸殘基組

11、成的殘基組成的亞基按特定的接觸和排列組成的一個球狀蛋白質(zhì)分子，每個亞基中亞基按特定的接觸和排列組成的一個球狀蛋白質(zhì)分子，每個亞基中各有一個含亞鐵離子的血紅素輔基。四個亞基間靠氫鍵和八個鹽鍵維系著血紅蛋各有一個含亞鐵離子的血紅素輔基。四個亞基間靠氫鍵和八個鹽鍵維系著血紅蛋白分子嚴(yán)密的空間構(gòu)象。白分子嚴(yán)密的空間構(gòu)象。 由于測定出蛋白質(zhì)的精細(xì)結(jié)構(gòu)由于測定出蛋白質(zhì)的精細(xì)結(jié)構(gòu), ,兩位英國科兩位英國科學(xué)家學(xué)家M.F.M.F.佩魯茨佩魯茨和和J.C.J.C.肯德魯肯德魯獲得獲得19621962年的諾年的諾貝爾化學(xué)獎。貝爾化學(xué)獎。圖片出處：圖片出處： 1997年年,核小體八組蛋白結(jié)構(gòu)核小體八組蛋白結(jié)構(gòu) 20

12、04年年,菠菜捕光復(fù)合物菠菜捕光復(fù)合物L(fēng)HC-II2005年，線粒體膜蛋白復(fù)合物年，線粒體膜蛋白復(fù)合物2精細(xì)結(jié)構(gòu)精細(xì)結(jié)構(gòu)X射線衍射測定蛋白和核酸精細(xì)結(jié)構(gòu)，為射線衍射測定蛋白和核酸精細(xì)結(jié)構(gòu)，為新藥設(shè)計新藥設(shè)計提供了全新方向提供了全新方向中國科學(xué)家研制抗癌新藥首獲瑞典愛明諾夫獎施一公抗癌抗乙肝病毒新藥施一公抗癌抗乙肝病毒新藥Birinapant，進(jìn)入臨床二期，進(jìn)入臨床二期蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)X X射線晶體結(jié)構(gòu)測定程序射線晶體結(jié)構(gòu)測定程序 l 1、樣品制備、樣品制備 l 2、蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長、蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長 l 3、衍射數(shù)據(jù)收集和處理、衍射數(shù)據(jù)收集和處理 l 4、位相求解、位相求解 l 5、模型建

13、立和修正、模型建立和修正 1、樣品制備、樣品制備 l大量表達(dá)、分離和純化目標(biāo)蛋白大量表達(dá)、分離和純化目標(biāo)蛋白 一般要求純度大于一般要求純度大于97%，濃度達(dá)到濃度達(dá)到5mg/ml以上。以上。2、蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長、蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長 蛋白質(zhì)結(jié)晶原理蛋白質(zhì)結(jié)晶原理 與小分子結(jié)晶一樣，蛋白質(zhì)在溶液中處于與小分子結(jié)晶一樣，蛋白質(zhì)在溶液中處于過飽和狀態(tài)時，分子間可以規(guī)則的方式堆過飽和狀態(tài)時，分子間可以規(guī)則的方式堆積起來形成晶體析出積起來形成晶體析出 蛋白質(zhì)晶體生長的影響因素蛋白質(zhì)晶體生長的影響因素l 物理因素物理因素：溫度溫度、重力、重力、壓力壓力、震動、時間、電場磁場、震動、時間、電場磁場、介質(zhì)

14、的電解質(zhì)性質(zhì)和粘度、均相或非均相成核等介質(zhì)的電解質(zhì)性質(zhì)和粘度、均相或非均相成核等 l 化學(xué)因素化學(xué)因素：pH值、沉淀劑值、沉淀劑類型和濃度、添加劑、離子種類型和濃度、添加劑、離子種類、離子強(qiáng)度、類、離子強(qiáng)度、過飽和度過飽和度、氧化還原環(huán)境、蛋白質(zhì)濃度等、氧化還原環(huán)境、蛋白質(zhì)濃度等 l 生化因素生化因素：蛋白質(zhì)純度蛋白質(zhì)純度、配合體、抑制劑、化學(xué)修飾、遺、配合體、抑制劑、化學(xué)修飾、遺傳修飾、蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài)、蛋白質(zhì)水解、蛋白質(zhì)自身的傳修飾、蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài)、蛋白質(zhì)水解、蛋白質(zhì)自身的對稱性、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和對稱性、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和等電點等電點等等 蛋白質(zhì)結(jié)晶方法蛋白質(zhì)結(jié)晶方法 （1）批量結(jié)晶法（）

15、批量結(jié)晶法（Batch crystallization） （2）透析法）透析法( Dialysis ) （3） 液相擴(kuò)散法液相擴(kuò)散法(Liquid diffusion) （4） 氣相擴(kuò)散法（氣相擴(kuò)散法（Vapour diffusion） （5） 蛋白質(zhì)結(jié)晶新方法蛋白質(zhì)結(jié)晶新方法 （1）批量結(jié)晶法（）批量結(jié)晶法（Batch crystallization）l通過在待測結(jié)晶蛋白質(zhì)溶液的通過在待測結(jié)晶蛋白質(zhì)溶液的體積、濃度體積、濃度和和組成固定組成固定的條件下，直接將的條件下，直接將不同量的飽不同量的飽和沉淀劑和沉淀劑加入未飽和的蛋白質(zhì)溶液以產(chǎn)生加入未飽和的蛋白質(zhì)溶液以產(chǎn)生一個濃度梯度而使蛋白質(zhì)在不

16、同的過飽和一個濃度梯度而使蛋白質(zhì)在不同的過飽和溶液中結(jié)晶。溶液中結(jié)晶。 （2）透析法）透析法( Dialysis ) l利用利用半透膜半透膜允許小分子透過而大分子不能允許小分子透過而大分子不能透過的性質(zhì)來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的沉淀劑濃透過的性質(zhì)來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的沉淀劑濃度、度、pH或離子強(qiáng)度，從而使蛋白質(zhì)溶液緩或離子強(qiáng)度，從而使蛋白質(zhì)溶液緩慢形成過飽和狀態(tài)以形成晶核。慢形成過飽和狀態(tài)以形成晶核。該法是培該法是培養(yǎng)蛋白質(zhì)晶體的常用方法。養(yǎng)蛋白質(zhì)晶體的常用方法。（3） 液相擴(kuò)散法液相擴(kuò)散法(Liquid diffusion) l利用利用液相平衡原理液相平衡原理而設(shè)計的。由于蛋白質(zhì)在而設(shè)計的。由于蛋白質(zhì)在

17、不同溶液中的溶解度不同，把待結(jié)晶蛋白質(zhì)不同溶液中的溶解度不同，把待結(jié)晶蛋白質(zhì)溶液緩慢加入溶液緩慢加入溶解性差異大的溶劑溶解性差異大的溶劑中，在界中，在界面處形成沉淀劑濃度梯度在局部達(dá)到瞬間過面處形成沉淀劑濃度梯度在局部達(dá)到瞬間過飽和，從而促使晶核形成。飽和，從而促使晶核形成。（4） 氣相擴(kuò)散法（氣相擴(kuò)散法（Vapour diffusion）l把待結(jié)晶蛋白質(zhì)、把待結(jié)晶蛋白質(zhì)、高于高于此蛋白質(zhì)結(jié)晶所需此蛋白質(zhì)結(jié)晶所需鹽濃度的溶液和鹽濃度的溶液和低于低于這種濃度的鹽溶液放這種濃度的鹽溶液放在一個密閉體系內(nèi)，兩種濃度不同的溶液在一個密閉體系內(nèi)，兩種濃度不同的溶液由于發(fā)生由于發(fā)生蒸汽擴(kuò)散蒸汽擴(kuò)散最后達(dá)到

18、平衡，隨著溶最后達(dá)到平衡，隨著溶液中沉淀劑濃度的增加蛋白質(zhì)溶解性降低液中沉淀劑濃度的增加蛋白質(zhì)溶解性降低，從而蛋白質(zhì)達(dá)到過飽和而析出晶體。，從而蛋白質(zhì)達(dá)到過飽和而析出晶體。（5） 結(jié)晶新方法結(jié)晶新方法Nucleant 生物玻璃生物玻璃晶體初步鑒定晶體初步鑒定偏光顯微鏡觀察、染色、電泳等偏光顯微鏡觀察、染色、電泳等3、衍射數(shù)據(jù)收集和處理、衍射數(shù)據(jù)收集和處理l第三代同步輻射光源的應(yīng)用使得用第三代同步輻射光源的應(yīng)用使得用20-40 um大小的晶體解析高分辨率結(jié)構(gòu)已經(jīng)成為大小的晶體解析高分辨率結(jié)構(gòu)已經(jīng)成為現(xiàn)實現(xiàn)實APS（USA）; ESRF（France）; SPring-8（Japan）上海同步輻射

19、中心上海同步輻射中心同步輻射光源同步輻射光源晶體收集和儲存晶體收集和儲存液氮氣冷技術(shù)4、位相求解、位相求解 1. 分子置換法分子置換法(MR)2. 多對同晶型置換法多對同晶型置換法(MIR)3. 多波長反常散射法多波長反常散射法(MAD)實驗中經(jīng)常聯(lián)合使用實驗中經(jīng)常聯(lián)合使用分子置換法分子置換法(MR)l分子置換法就是把已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子分子置換法就是把已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子放到待測蛋白質(zhì)晶體的晶胞中建立起初始放到待測蛋白質(zhì)晶體的晶胞中建立起初始結(jié)構(gòu)模型并借助此模型計算待測蛋白質(zhì)晶結(jié)構(gòu)模型并借助此模型計算待測蛋白質(zhì)晶體各個衍射點的相角的方法。體各個衍射點的相角的方法。 多對同晶型置換法多對同晶型

20、置換法(MIR)l在蛋白質(zhì)晶體中引入在蛋白質(zhì)晶體中引入散射能力強(qiáng)的重金屬散射能力強(qiáng)的重金屬原子原子如如Pb和和Hg等作為標(biāo)志原子，制備出重等作為標(biāo)志原子，制備出重原子的衍生物，然后求出這些重原子在晶原子的衍生物，然后求出這些重原子在晶胞中的坐標(biāo)，根據(jù)坐標(biāo)計算出重原子散射胞中的坐標(biāo)，根據(jù)坐標(biāo)計算出重原子散射波在各個衍射點的相角，最后推測出蛋白波在各個衍射點的相角，最后推測出蛋白質(zhì)分子在各個衍射中的位相。質(zhì)分子在各個衍射中的位相。 多波長反常散射法多波長反常散射法(MAD)l利用利用同步輻射波長連續(xù)可變同步輻射波長連續(xù)可變的特點，使用的特點，使用一個重原子衍生物作為母體，用一個晶體一個重原子衍生物

21、作為母體，用一個晶體就可以收集到重原子反常散射吸收邊兩側(cè)就可以收集到重原子反常散射吸收邊兩側(cè)的多套數(shù)據(jù)，并解出結(jié)構(gòu)。的多套數(shù)據(jù)，并解出結(jié)構(gòu)。 5、模型建立和修正、模型建立和修正l晶體學(xué)晶體學(xué)R因子一般要求達(dá)到因子一般要求達(dá)到0.2以下以下l鍵長偏差大約為鍵長偏差大約為0.015l鍵角偏差約為鍵角偏差約為3l二面角構(gòu)象分布要求除了甘氨酸的二面角二面角構(gòu)象分布要求除了甘氨酸的二面角構(gòu)象是隨機(jī)的外，其他殘基的二面角構(gòu)象構(gòu)象是隨機(jī)的外，其他殘基的二面角構(gòu)象分布受到立體化學(xué)的限制分布受到立體化學(xué)的限制l X-Ray晶體衍射目前仍然是蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)測定的晶體衍射目前仍然是蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)測定的主要方法主要方

22、法l 優(yōu)點：優(yōu)點：分辨率高，能精確確定生物大分子中各原子分辨率高，能精確確定生物大分子中各原子的坐標(biāo)、鍵長、鍵角的坐標(biāo)、鍵長、鍵角,給出生物大分子的分子結(jié)構(gòu)和給出生物大分子的分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)型構(gòu)型,確定活性中心的位置和結(jié)構(gòu)確定活性中心的位置和結(jié)構(gòu) l 缺點：缺點：只能測定單晶，反映靜態(tài)結(jié)構(gòu)信息，無法測只能測定單晶，反映靜態(tài)結(jié)構(gòu)信息，無法測定溶液中的信息定溶液中的信息v 成為推廣速度和發(fā)展速度都居首位的一種結(jié)構(gòu)分析方法。成為推廣速度和發(fā)展速度都居首位的一種結(jié)構(gòu)分析方法。v 核磁共振可以方便地在溶液中研究分子結(jié)構(gòu)并且是核磁共振可以方便地在溶液中研究分子結(jié)構(gòu)并且是唯一唯一可以使試樣不經(jīng)受任何破壞的結(jié)構(gòu)分

23、析方法可以使試樣不經(jīng)受任何破壞的結(jié)構(gòu)分析方法。v目前核磁共振成象技術(shù)已能以活人為觀察對象，掃描身目前核磁共振成象技術(shù)已能以活人為觀察對象，掃描身體中任何器官或組織的任何一個斷面的核磁共振參數(shù)體中任何器官或組織的任何一個斷面的核磁共振參數(shù)，成成為一種引人注目的癌癥早期診斷技術(shù)。為一種引人注目的癌癥早期診斷技術(shù)。 NMRNMR核磁共振技術(shù)（核磁共振技術(shù)（NMR）v1946年美國年美國斯坦福大學(xué)斯坦福大學(xué)的的F.Bloch和哈佛大學(xué)的和哈佛大學(xué)的E.M.Purcell兩個研究小組首次獨立觀察到核磁共振現(xiàn)象，兩個研究小組首次獨立觀察到核磁共振現(xiàn)象，為此他們兩人獲為此他們兩人獲1952年諾貝爾物理獎。年

24、諾貝爾物理獎。v1983年年，瑞士科學(xué)家，瑞士科學(xué)家Kurt WKurt Wthrichthrich教授實驗室首次運用教授實驗室首次運用核磁共振方法解析了胰高血糖素（核磁共振方法解析了胰高血糖素（glucagonglucagon）多肽的溶液構(gòu)多肽的溶液構(gòu)象象. .發(fā)明了利用核磁共振發(fā)明了利用核磁共振( (NMR)NMR)技術(shù)測定溶液中生物大分子三維技術(shù)測定溶液中生物大分子三維結(jié)構(gòu)的方法獲得了結(jié)構(gòu)的方法獲得了20022002年度諾貝爾化學(xué)獎年度諾貝爾化學(xué)獎 v74歲的美國科學(xué)家保羅歲的美國科學(xué)家保羅勞特布爾和勞特布爾和70歲的英國科學(xué)家彼歲的英國科學(xué)家彼得得曼斯菲爾德為曼斯菲爾德為2003諾貝爾

25、醫(yī)學(xué)獎的得主諾貝爾醫(yī)學(xué)獎的得主 NMR基本原理基本原理核 磁 共 振核 磁 共 振 ( ( N u c l e a r N u c l e a r Magnetic Resonance)Magnetic Resonance)，就是處于某個靜磁場中的就是處于某個靜磁場中的自旋核系統(tǒng)受到相應(yīng)頻率自旋核系統(tǒng)受到相應(yīng)頻率的射頻磁場作用時的射頻磁場作用時 , ,共振共振吸收某一特定頻率的射頻吸收某一特定頻率的射頻輻射的物理過程。輻射的物理過程。 核磁共振波譜儀核磁共振波譜儀核磁共振波譜核磁共振波譜是測量原子核對是測量原子核對射頻輻射射頻輻射( (約約4 4 600MHz)600MHz)的吸收，的吸收，這

26、種吸收只有在高磁場中才能這種吸收只有在高磁場中才能產(chǎn)生。產(chǎn)生。15核磁共振波譜儀核磁共振波譜儀 核磁共振波譜儀核磁共振波譜儀1永久磁鐵永久磁鐵：提供外磁場，：提供外磁場，要求穩(wěn)定性好，均勻，不要求穩(wěn)定性好，均勻，不均勻性小于六千萬分之一。均勻性小于六千萬分之一。掃場線圈。掃場線圈。2 射頻振蕩器射頻振蕩器：線圈垂：線圈垂直于外磁場，發(fā)射一定頻直于外磁場，發(fā)射一定頻率的電磁輻射信號。率的電磁輻射信號。60MHz或或100MHz。3 射頻信號接受器射頻信號接受器（檢測（檢測器）：當(dāng)質(zhì)子的進(jìn)動頻率與器）：當(dāng)質(zhì)子的進(jìn)動頻率與輻射頻率相匹配時，發(fā)生能輻射頻率相匹配時，發(fā)生能級躍遷，吸收能量，在感應(yīng)級躍遷

27、，吸收能量，在感應(yīng)線圈中產(chǎn)生毫伏級信號。線圈中產(chǎn)生毫伏級信號。4樣品管：外徑樣品管：外徑5mm的玻的玻璃管璃管,測量過程中旋轉(zhuǎn)測量過程中旋轉(zhuǎn), 磁場磁場作用均勻。作用均勻。如果一個人知道了一間房子的所有尺寸，就可以畫出房如果一個人知道了一間房子的所有尺寸，就可以畫出房子的三維圖形。同樣，如圖所示，通過測量蛋白質(zhì)中的子的三維圖形。同樣，如圖所示，通過測量蛋白質(zhì)中的大量的短距離，就可以畫出其結(jié)構(gòu)的三維圖像。大量的短距離，就可以畫出其結(jié)構(gòu)的三維圖像。l 瑞士科學(xué)家?guī)鞝柼厝鹗靠茖W(xué)家?guī)鞝柼鼐S特里希則發(fā)明了維特里希則發(fā)明了“利用核磁共振技術(shù)測定溶利用核磁共振技術(shù)測定溶液中生物大分子三維結(jié)構(gòu)法液中生物大分子

28、三維結(jié)構(gòu)法”。這種方法的優(yōu)點是可對溶液中的蛋。這種方法的優(yōu)點是可對溶液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析白質(zhì)進(jìn)行分析, ,進(jìn)而可對活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析進(jìn)而可對活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析, ,能獲得能獲得“活活”蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu), ,其意義非常重大。其意義非常重大。l 這種方法的這種方法的原理原理可以用測繪房屋的結(jié)構(gòu)來比喻首先選定一座房屋的可以用測繪房屋的結(jié)構(gòu)來比喻首先選定一座房屋的所有拐角作為測量對象所有拐角作為測量對象, ,然后測量所有相鄰拐角間的距離和方位然后測量所有相鄰拐角間的距離和方位, ,據(jù)據(jù)此就可以推知房屋的結(jié)構(gòu)。維特里希選擇生物大分子中的此就可以推知房屋的結(jié)構(gòu)。維特里希選擇生物大分子中

29、的質(zhì)子質(zhì)子( (氫原氫原子核子核) ) 作為測量對象作為測量對象, ,連續(xù)測定所有相鄰的連續(xù)測定所有相鄰的2 2個質(zhì)子之間的距離和方個質(zhì)子之間的距離和方位位, ,這些數(shù)據(jù)經(jīng)計算機(jī)處理后就可形成生物大分子的三維結(jié)構(gòu)圖。這些數(shù)據(jù)經(jīng)計算機(jī)處理后就可形成生物大分子的三維結(jié)構(gòu)圖。核磁共振法中幾個常用的參數(shù)核磁共振法中幾個常用的參數(shù)l化學(xué)位移化學(xué)位移 l耦合常數(shù)耦合常數(shù) lNOE（核歐沃豪斯效應(yīng)）信號強(qiáng)度（核歐沃豪斯效應(yīng)）信號強(qiáng)度 l譜峰面積譜峰面積 l弛豫時間弛豫時間 1.化學(xué)位移化學(xué)位移 l 值越大，表示屏蔽作用越小，吸收峰出現(xiàn)在值越大，表示屏蔽作用越小，吸收峰出現(xiàn)在低場；低場； 值越小，表示屏蔽作用

30、越大，吸收峰值越小，表示屏蔽作用越大，吸收峰出現(xiàn)在高場。出現(xiàn)在高場。2.耦合常數(shù)耦合常數(shù) 核與核之間核與核之間以價電子為媒介相互耦合引起譜以價電子為媒介相互耦合引起譜線分裂的現(xiàn)象稱為自旋裂分。由于自旋裂分線分裂的現(xiàn)象稱為自旋裂分。由于自旋裂分形成的多重峰中相鄰兩峰之間的距離被稱為形成的多重峰中相鄰兩峰之間的距離被稱為自旋自旋耦合常數(shù)自旋自旋耦合常數(shù),用用J表示。耦合常數(shù)用表示。耦合常數(shù)用來表征兩核之間來表征兩核之間耦合作用的大小耦合作用的大小。 J耦合常數(shù)大小主要與連接兩個核的化學(xué)鍵耦合常數(shù)大小主要與連接兩個核的化學(xué)鍵數(shù)目有關(guān)，與影響標(biāo)量耦合核之間電子云分?jǐn)?shù)目有關(guān)，與影響標(biāo)量耦合核之間電子云分

31、布的因素有關(guān)。布的因素有關(guān)。 3.NOE信號強(qiáng)度信號強(qiáng)度 l當(dāng)分子內(nèi)有兩個空間距離小于當(dāng)分子內(nèi)有兩個空間距離小于0.5nm的原子的原子核時，如果用雙共振法照射其中一個核，核時，如果用雙共振法照射其中一個核，使干擾場的強(qiáng)度增加到剛使被干擾的譜線使干擾場的強(qiáng)度增加到剛使被干擾的譜線達(dá)到飽和，則另一個靠近的原子核的共振達(dá)到飽和，則另一個靠近的原子核的共振信號就會增加，這種現(xiàn)象稱信號就會增加，這種現(xiàn)象稱核歐沃豪斯效核歐沃豪斯效應(yīng)應(yīng) （NOE）。）。 4.譜峰面積譜峰面積 l譜峰面積和分子中同一化學(xué)環(huán)境的原子核譜峰面積和分子中同一化學(xué)環(huán)境的原子核數(shù)目的多少成正比，因此峰面積的積分值數(shù)目的多少成正比，因此

32、峰面積的積分值可用來做定量分析的基礎(chǔ)?？捎脕碜龆糠治龅幕A(chǔ)。 5.弛豫時間弛豫時間 l原子核從激化的狀態(tài)回復(fù)到平衡排列狀態(tài)原子核從激化的狀態(tài)回復(fù)到平衡排列狀態(tài)的過程叫弛豫過程。它所需的時間叫的過程叫弛豫過程。它所需的時間叫弛豫弛豫時間時間。 l 自旋晶格弛豫：自旋晶格弛豫：處于高能態(tài)的氫核，把能量轉(zhuǎn)給處于高能態(tài)的氫核，把能量轉(zhuǎn)給周圍的分子，回到低能態(tài)。周圍的分子，回到低能態(tài)。 l 自旋自旋-自旋弛豫自旋弛豫 ：兩個進(jìn)動頻率相同，進(jìn)動取向兩個進(jìn)動頻率相同，進(jìn)動取向不同的磁性核，在一定距離內(nèi)時，它們相互交換不同的磁性核，在一定距離內(nèi)時，它們相互交換能量，改變進(jìn)動方向。能量，改變進(jìn)動方向。 二維核

33、磁共振二維核磁共振(2DNMR） NMR可獲得分子內(nèi)各核的化學(xué)環(huán)境、核間的耦合關(guān)系、可獲得分子內(nèi)各核的化學(xué)環(huán)境、核間的耦合關(guān)系、空間構(gòu)象等信息，但是當(dāng)分子較大的時候，由于裂分譜空間構(gòu)象等信息，但是當(dāng)分子較大的時候，由于裂分譜線間的重疊，因此在測定了同一種核的一維譜之后，需線間的重疊，因此在測定了同一種核的一維譜之后，需要了解兩種或三種不同核之間的聯(lián)系關(guān)系，如要了解兩種或三種不同核之間的聯(lián)系關(guān)系，如C-H，N-H等就需要用到等就需要用到2DNMR，它是它是2個頻率變量的函數(shù)，吸收個頻率變量的函數(shù)，吸收峰對峰對2個頻率變量作圖。個頻率變量作圖。1H-1H COSY、 1H-15N HSQC 多維核

34、磁共振多維核磁共振v1H，13C，15N核之間的化學(xué)鍵連接來得到核磁共振核之間的化學(xué)鍵連接來得到核磁共振相關(guān)信號。相關(guān)信號。 CBCANH、HNCO、HCCH-COSY v核磁共振本身不能展示樣體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。要得到內(nèi)部核磁共振本身不能展示樣體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。要得到內(nèi)部的圖像，就要將的圖像，就要將不同梯度不同梯度的磁場加以結(jié)合，即改變穿過的磁場加以結(jié)合，即改變穿過樣本的磁場強(qiáng)度。這樣就有無數(shù)二維的圖像，彼此重疊樣本的磁場強(qiáng)度。這樣就有無數(shù)二維的圖像，彼此重疊后就得到樣本內(nèi)部空間的三維圖像后就得到樣本內(nèi)部空間的三維圖像 核磁共振技術(shù)的應(yīng)用核磁共振技術(shù)的應(yīng)用l早期早期核磁共振主要用于對核磁共振主要用于對

35、核結(jié)構(gòu)和性質(zhì)核結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的的研究，如測量核磁矩、電四極距、及核自研究，如測量核磁矩、電四極距、及核自旋等旋等l后來后來廣泛應(yīng)用于廣泛應(yīng)用于分子分子組成和結(jié)構(gòu)分析，組成和結(jié)構(gòu)分析，生生物物組織與組織與活體活體組織分析，病理分析、醫(yī)療組織分析，病理分析、醫(yī)療診斷、產(chǎn)品無損監(jiān)測等方面診斷、產(chǎn)品無損監(jiān)測等方面19851985年年, ,維特里希等人公布了第一次利用維特里希等人公布了第一次利用NMR NMR 法測定的溶法測定的溶液中蛋白質(zhì)液中蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑IIA ( proteinase IIA ( proteinase inhibitor IIA) inhibitor IIA) 的結(jié)構(gòu)的

36、結(jié)構(gòu) NMR圖譜得到的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)圖譜得到的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)from：廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院：廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 NMR的非破壞性使得的非破壞性使得NMR譜圖可以確定完整譜圖可以確定完整生物大分子中某成分的存在和濃度從而與生物大分子中某成分的存在和濃度從而與X-Ray晶晶體衍射互為補充體衍射互為補充.核磁共振成像核磁共振成像 基本原理：基本原理：是將人體置于特殊的磁場中，用無線是將人體置于特殊的磁場中，用無線電射頻脈沖激發(fā)人體內(nèi)氫原子核，引起氫原子核電射頻脈沖激發(fā)人體內(nèi)氫原子核，引起氫原子核共振，并吸收能量。在停止射頻脈沖后，氫原子共振，并吸收能量。在停止射頻脈沖后，氫原子核按特定頻率發(fā)出射電

37、信號，并將吸收的能量釋核按特定頻率發(fā)出射電信號，并將吸收的能量釋放出來，被體外的接受器收錄，經(jīng)電子計算機(jī)處放出來，被體外的接受器收錄，經(jīng)電子計算機(jī)處理獲得圖像理獲得圖像.核磁共振測深核磁共振測深核磁共振測深是核磁共振測深是MRI技術(shù)在地質(zhì)勘探領(lǐng)域的技術(shù)在地質(zhì)勘探領(lǐng)域的延伸，通過對地層中水分布信息的探測，可以延伸，通過對地層中水分布信息的探測，可以確定某一地層下是否有地下水存在，地下水位確定某一地層下是否有地下水存在，地下水位的高度、含水層的含水量和孔隙率等地層結(jié)構(gòu)的高度、含水層的含水量和孔隙率等地層結(jié)構(gòu)信息。信息。 優(yōu)優(yōu) 缺缺 點點v優(yōu)點優(yōu)點：可以在水溶液或：可以在水溶液或有機(jī)相中研究生物大分

38、子有機(jī)相中研究生物大分子結(jié)構(gòu)，研究溶液條件的改結(jié)構(gòu)，研究溶液條件的改變對生物大分子三維結(jié)構(gòu)變對生物大分子三維結(jié)構(gòu)的影響以及生物大分子內(nèi)的影響以及生物大分子內(nèi)部動力學(xué)的特點部動力學(xué)的特點v缺點缺點：分辨率不高。目：分辨率不高。目前，前，NMR只能用于測定只能用于測定小分子和中型蛋白質(zhì)的小分子和中型蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)from：廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院：廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院NMR法測定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本實驗步驟法測定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本實驗步驟:1 、樣品制備，一般應(yīng)采用樣品制備，一般應(yīng)采用液態(tài)液態(tài)樣品樣品，CCl4溶解溶解2 、一維一維NMR實驗實驗3 、二維二維NMR實驗實驗4、三維三維NMR實驗實驗5 、

39、有的還要做四維有的還要做四維NMR實驗實驗vNMR法一般只能解析相對較小的蛋白質(zhì)，法一般只能解析相對較小的蛋白質(zhì)，X-射射 線晶體衍射法適用于研究各種大小的蛋白質(zhì)。線晶體衍射法適用于研究各種大小的蛋白質(zhì)。v有些蛋白質(zhì)水溶性很差，卻很容易培養(yǎng)成晶體，有些蛋白質(zhì)水溶性很差，卻很容易培養(yǎng)成晶體，另一些蛋白質(zhì)則水溶性很好，培養(yǎng)成晶體很困難。另一些蛋白質(zhì)則水溶性很好，培養(yǎng)成晶體很困難。 n X射線晶體衍射技術(shù)和核磁共振技術(shù)是當(dāng)前蛋白射線晶體衍射技術(shù)和核磁共振技術(shù)是當(dāng)前蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測定的主要方法，質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測定的主要方法，但它們都存在一些但它們都存在一些不足。不足。n X射線晶體衍射技術(shù)射線晶體衍射技術(shù)

40、要求蛋白質(zhì)是晶體存在狀態(tài)，要求蛋白質(zhì)是晶體存在狀態(tài)，而對一些柔性的、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物大分子蛋白質(zhì)而對一些柔性的、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物大分子蛋白質(zhì)來說，比較難以得到所需的晶體結(jié)構(gòu)。來說，比較難以得到所需的晶體結(jié)構(gòu)。n 核磁共振技術(shù)核磁共振技術(shù)能測出溶液狀態(tài)下分子量較小蛋白能測出溶液狀態(tài)下分子量較小蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，但對分子量較大的蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)處理質(zhì)的結(jié)構(gòu)，但對分子量較大的蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)處理顯得比較復(fù)雜。顯得比較復(fù)雜。l因此，因此，下面下面介紹一些其他測定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)介紹一些其他測定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法的方法：現(xiàn)代光譜技術(shù)現(xiàn)代光譜技術(shù)三維電鏡衍射技術(shù)三維電鏡衍射技術(shù)動力學(xué)全精研究技術(shù)動力學(xué)全精研究技術(shù)一、現(xiàn)代光譜技術(shù)

41、一、現(xiàn)代光譜技術(shù)l除傳統(tǒng)的紫外除傳統(tǒng)的紫外-可見差光譜法和熒光光可見差光譜法和熒光光譜法外，譜法外，圓二色譜圓二色譜、激光拉曼光譜激光拉曼光譜以以及及質(zhì)譜質(zhì)譜也在測定蛋白質(zhì)溶液構(gòu)象方面也在測定蛋白質(zhì)溶液構(gòu)象方面發(fā)揮著重要的作用。發(fā)揮著重要的作用。圓二色譜圓二色譜（Circular Dichroism，CD）l 圓二色譜是研究圓二色譜是研究稀溶液稀溶液中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種簡單中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種簡單、快速而又較準(zhǔn)確的方法。、快速而又較準(zhǔn)確的方法。l 圓二色譜是利用不對稱分子對圓二色譜是利用不對稱分子對左、右圓偏振光左、右圓偏振光吸吸光率的不同來分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。光率的不同來分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。l 19

42、69年，年，Greenfield用圓二色光譜數(shù)據(jù)估計了蛋白用圓二色光譜數(shù)據(jù)估計了蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。此后，關(guān)于利用圓二色譜研究蛋質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。此后，關(guān)于利用圓二色譜研究蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的報道逐漸增多。白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的報道逐漸增多。平面偏振光、圓偏振光和橢圓偏振光平面偏振光、圓偏振光和橢圓偏振光l 平面偏振光平面偏振光：指振動方向在同一平面內(nèi)的電磁波指振動方向在同一平面內(nèi)的電磁波。l 圓偏振光圓偏振光：當(dāng)兩束當(dāng)兩束振幅相等振幅相等、互相垂直的互相垂直的偏振光位偏振光位相相差相相差1/4波長波長(90)時，其合成矢量繞光傳播方向時，其合成矢量繞光傳播方向旋轉(zhuǎn)前進(jìn)，朝著光源方向觀察時，電場矢量旋轉(zhuǎn)前進(jìn)，朝

43、著光源方向觀察時，電場矢量E末端末端軌跡為圓形，所以稱之為軌跡為圓形，所以稱之為圓偏振光圓偏振光。電場矢量方向。電場矢量方向順時針方向旋轉(zhuǎn)的稱為順時針方向旋轉(zhuǎn)的稱為右圓偏振光右圓偏振光，逆時針方向旋，逆時針方向旋轉(zhuǎn)的則稱轉(zhuǎn)的則稱左圓偏振光左圓偏振光。l橢圓偏振光橢圓偏振光：振幅不等的左、右圓偏振光合成振幅不等的左、右圓偏振光合成圓二色性和圓二色譜圓二色性和圓二色譜l 圓二色性圓二色性：當(dāng)左、右圓偏振光進(jìn)入物質(zhì)時，光學(xué)當(dāng)左、右圓偏振光進(jìn)入物質(zhì)時，光學(xué)活性物質(zhì)分子對它們的吸收不一樣，它們的差值活性物質(zhì)分子對它們的吸收不一樣，它們的差值就是圓二色性就是圓二色性光學(xué)活性物質(zhì)分子對左、右圓偏振光的吸收不

44、一光學(xué)活性物質(zhì)分子對左、右圓偏振光的吸收不一樣，這種吸收差造成矢量振幅差，從介質(zhì)出來的樣，這種吸收差造成矢量振幅差，從介質(zhì)出來的光成為橢圓偏振光，用光成為橢圓偏振光，用橢圓度橢圓度或或吸收差吸收差表示表示l 圓二色譜圓二色譜：指指橢圓度橢圓度(或比橢圓度等或比橢圓度等)與與波長波長的關(guān)的關(guān)系，它在本質(zhì)上與旋光色散譜是一樣的。系，它在本質(zhì)上與旋光色散譜是一樣的。圓二色譜的應(yīng)用圓二色譜的應(yīng)用l在分子生物學(xué)中，圓二色儀主要應(yīng)用于測在分子生物學(xué)中，圓二色儀主要應(yīng)用于測定定生物大分子的空間結(jié)構(gòu)生物大分子的空間結(jié)構(gòu)。生物大分子很多是不對稱的，即生物大分子很多是不對稱的，即光學(xué)活性分子光學(xué)活性分子，通過圓二

45、色譜測定和計算能夠了解生物大分子在通過圓二色譜測定和計算能夠了解生物大分子在溶液狀態(tài)下的二級結(jié)構(gòu)溶液狀態(tài)下的二級結(jié)構(gòu)。l 蛋白質(zhì)或多肽是由氨蛋白質(zhì)或多肽是由氨基酸通過肽鍵連接而基酸通過肽鍵連接而成的具有特定結(jié)構(gòu)的成的具有特定結(jié)構(gòu)的生物大分子，主要的生物大分子，主要的光學(xué)活性生色基團(tuán)是光學(xué)活性生色基團(tuán)是肽鏈骨架中的肽鏈骨架中的肽鍵、肽鍵、芳香氨基酸殘基芳香氨基酸殘基及及二二硫鍵硫鍵，另外，有的蛋，另外，有的蛋白質(zhì)白質(zhì)輔基輔基對蛋白質(zhì)的對蛋白質(zhì)的圓二色性有影響。圓二色性有影響。肽鍵的不對稱性使得它總有光活性肽鍵的不對稱性使得它總有光活性l 蛋白質(zhì)的圓二色性主要由活性生色基團(tuán)及折疊蛋白質(zhì)的圓二色性主

46、要由活性生色基團(tuán)及折疊結(jié)構(gòu)兩方面圓二色性的總和。根據(jù)電子躍遷能級能結(jié)構(gòu)兩方面圓二色性的總和。根據(jù)電子躍遷能級能量的大小，蛋白質(zhì)的量的大小，蛋白質(zhì)的CD光譜分為三個波長范圍光譜分為三個波長范圍: 1）250nm以下的以下的遠(yuǎn)紫外光譜區(qū)遠(yuǎn)紫外光譜區(qū)，圓二色性主要由肽，圓二色性主要由肽鍵的鍵的n*電子躍遷引起；遠(yuǎn)紫外電子躍遷引起；遠(yuǎn)紫外CD主要應(yīng)用于蛋主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的解析二級結(jié)構(gòu)的解析 2）250300nm的的近紫外光譜區(qū)近紫外光譜區(qū)，主要由側(cè)鏈芳香，主要由側(cè)鏈芳香基團(tuán)的基團(tuán)的*電子躍遷引起；近紫外電子躍遷引起；近紫外CD主要揭示蛋主要揭示蛋白質(zhì)的白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)信息三級結(jié)構(gòu)信息 3 3

47、）300300700nm700nm的的紫外紫外- -可見光光譜區(qū)可見光光譜區(qū)，主要由蛋白，主要由蛋白質(zhì)輔基等外在生色基團(tuán)引起。紫外質(zhì)輔基等外在生色基團(tuán)引起。紫外- -可見光可見光CDCD主要主要用于用于輔基的偶合分析輔基的偶合分析。 l 肽鍵肽鍵是高度有規(guī)律排列是高度有規(guī)律排列的，其排列的方向性決的，其排列的方向性決定了肽鍵能級躍遷的分定了肽鍵能級躍遷的分裂情況。具有不同二級裂情況。具有不同二級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或多肽所結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或多肽所產(chǎn)生產(chǎn)生CD譜帶的位置、譜帶的位置、吸收的強(qiáng)弱都不相同。吸收的強(qiáng)弱都不相同。因此，根據(jù)所測得蛋白因此，根據(jù)所測得蛋白質(zhì)或多肽的遠(yuǎn)紫外質(zhì)或多肽的遠(yuǎn)紫外CD譜，能反映

48、出蛋白質(zhì)或譜，能反映出蛋白質(zhì)或多肽鏈二級結(jié)構(gòu)的信息多肽鏈二級結(jié)構(gòu)的信息，從而揭示蛋白質(zhì)或多，從而揭示蛋白質(zhì)或多肽的二級結(jié)構(gòu)。肽的二級結(jié)構(gòu)。 -螺旋螺旋結(jié)構(gòu)在靠近結(jié)構(gòu)在靠近192nm有一正的譜帶，在有一正的譜帶，在222和和208nm處表現(xiàn)出兩個負(fù)的特征肩峰譜帶；處表現(xiàn)出兩個負(fù)的特征肩峰譜帶；-折疊折疊的的CD光譜在光譜在216nm有一負(fù)譜帶，在有一負(fù)譜帶，在185200nm有一正譜帶；有一正譜帶；-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)角在在206nm附近有一正附近有一正CD譜帶，而左手螺旋譜帶，而左手螺旋P2結(jié)構(gòu)在相應(yīng)的位結(jié)構(gòu)在相應(yīng)的位置有負(fù)的置有負(fù)的CD譜帶，如上圖和表所示。譜帶，如上圖和表所示。 - band(nm)+

49、 band(nm)-螺旋螺旋222，208192-折疊折疊216195-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)角220-230(弱弱)，180-190（強(qiáng)）（強(qiáng)）205左手螺旋左手螺旋P2結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)190210-230（弱）（弱）無規(guī)則卷曲無規(guī)則卷曲200212 CD數(shù)據(jù)擬合計算蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)的方法基本原理是假設(shè)蛋白質(zhì)在波長處的CD信號()是蛋白質(zhì)中或多肽各種二級結(jié)構(gòu)組分及由芳香基團(tuán)引起的噪音的線性加，()= fi()i + noise。()i是第i個二級結(jié)構(gòu)成分的CD信號值，fi為第i個二級結(jié)構(gòu)成分的含量分?jǐn)?shù)，fi規(guī)定值為1；通過已知蛋白（或稱參考蛋白）二級結(jié)構(gòu)的圓二色數(shù)據(jù)庫，曲線擬合未知蛋白或多肽的圓二色數(shù)據(jù)，估算未知蛋

50、白或多肽的二級結(jié)構(gòu)。 蛋白質(zhì)或多肽的二級結(jié)構(gòu)擬合計算方法中，主要采用多聚氨基酸為參考多肽。Greenfield 等采用多聚L-lys 作參考多肽，建立-螺旋、-折疊及無規(guī)卷曲等二級結(jié)構(gòu)參考CD 光譜曲線，采用單一波長法（208nm）計算出-螺旋含量后，然后假設(shè)不同的-折疊含量（X）值，并假設(shè)CD 值是-螺旋含量(XH)、-折疊含量(X)無規(guī)卷曲(XR)三者貢獻(xiàn)值的加和，即： XH+X+XR=1 通過計算得到不同波長的()，得出計算曲線。假設(shè)一些不同的X值，分別求出它們相應(yīng)的計算曲線，找出與實驗曲線最接近的曲線，相應(yīng)于該最接近曲線的X及XR即認(rèn)為是該蛋白質(zhì)的相應(yīng)結(jié)構(gòu)含量。 Example fit

51、: myoglobin(肌紅蛋白肌紅蛋白)l In this case: qt = xaqa + xbqb + xcqcl fits best with xa = 80%, xb= 0%xc = 20% l agrees well with structure 78% helix, 22% coil激光拉曼光譜激光拉曼光譜l激光拉曼光譜法是研究激光拉曼光譜法是研究生物大分子生物大分子結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)、動力學(xué)及功能的重要手段，它在物理、化動力學(xué)及功能的重要手段，它在物理、化學(xué)、醫(yī)學(xué)及生物學(xué)等領(lǐng)域都有著十分重要學(xué)、醫(yī)學(xué)及生物學(xué)等領(lǐng)域都有著十分重要的應(yīng)用價值。的應(yīng)用價值。l在在蛋白質(zhì)等結(jié)構(gòu)研究蛋白質(zhì)等結(jié)構(gòu)

52、研究方面，拉曼光譜分析方面，拉曼光譜分析可以提供大量的信息，促進(jìn)蛋白質(zhì)等生物可以提供大量的信息，促進(jìn)蛋白質(zhì)等生物大分子研究進(jìn)展。大分子研究進(jìn)展。l 1928年，印度物理學(xué)家年，印度物理學(xué)家拉曼拉曼(Raman)發(fā)現(xiàn)了拉曼光譜，同發(fā)現(xiàn)了拉曼光譜，同時期的蘇聯(lián)物理學(xué)家時期的蘇聯(lián)物理學(xué)家蘭斯伯格蘭斯伯格(G. Landsberg)也獨立地發(fā)也獨立地發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象。從那時起，拉曼光譜逐漸發(fā)展成為一個分現(xiàn)了這一現(xiàn)象。從那時起，拉曼光譜逐漸發(fā)展成為一個分析物質(zhì)結(jié)構(gòu)的有力工具。析物質(zhì)結(jié)構(gòu)的有力工具。l 然而由于拉曼光譜技術(shù)強(qiáng)度很弱，時間較長，測定有色物然而由于拉曼光譜技術(shù)強(qiáng)度很弱，時間較長，測定有色物質(zhì)和發(fā)

53、光樣品存在困難等缺陷質(zhì)和發(fā)光樣品存在困難等缺陷,給其應(yīng)用帶來了很大困難給其應(yīng)用帶來了很大困難,故故在后來很長一段時間內(nèi)發(fā)展比較緩慢，曾一度有被紅外光在后來很長一段時間內(nèi)發(fā)展比較緩慢，曾一度有被紅外光譜取代的趨勢。譜取代的趨勢。l 直到直到1960年年激光激光出現(xiàn)以后，由于激光具有高亮度、單色性出現(xiàn)以后，由于激光具有高亮度、單色性和方向性好以及高偏振度等特點，非常適合作為拉曼光譜和方向性好以及高偏振度等特點，非常適合作為拉曼光譜的激發(fā)光源，因而迅速為科研工作者所利用。的激發(fā)光源，因而迅速為科研工作者所利用。質(zhì)譜質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)l 自美國科學(xué)家自美國科學(xué)家John

54、B.Fenn和日本學(xué)者和日本學(xué)者田中耕一田中耕一(Koichi. Tanaka)發(fā)明了對生物大分子進(jìn)行確認(rèn)和結(jié)構(gòu)分析的質(zhì)譜發(fā)明了對生物大分子進(jìn)行確認(rèn)和結(jié)構(gòu)分析的質(zhì)譜分析法以來，隨著生命科學(xué)及生物技術(shù)的迅速發(fā)展，生物分析法以來，隨著生命科學(xué)及生物技術(shù)的迅速發(fā)展，生物質(zhì)譜目前已成為有機(jī)質(zhì)譜中最活躍、最富生命力的前沿研質(zhì)譜目前已成為有機(jī)質(zhì)譜中最活躍、最富生命力的前沿研究領(lǐng)域之一。究領(lǐng)域之一。l 生物質(zhì)譜的發(fā)展使人類生物質(zhì)譜的發(fā)展使人類基因組計劃基因組計劃及其及其后基因組計劃后基因組計劃得以得以提前完成，對其實施也起著重要的推動作用。提前完成，對其實施也起著重要的推動作用。l 質(zhì)譜分析法在研究質(zhì)譜分析

55、法在研究生物大分子生物大分子特別是蛋白質(zhì)方面已發(fā)展成特別是蛋白質(zhì)方面已發(fā)展成為主要的技術(shù)手段之一，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究中占據(jù)著十為主要的技術(shù)手段之一，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究中占據(jù)著十分重要的地位。分重要的地位。質(zhì)譜分析基本原理質(zhì)譜分析基本原理l 質(zhì)譜分析是將樣品轉(zhuǎn)化為運動的氣態(tài)帶電離子，質(zhì)譜分析是將樣品轉(zhuǎn)化為運動的氣態(tài)帶電離子，于磁場中按質(zhì)荷比于磁場中按質(zhì)荷比(m/z)大小分離并記錄的分析方大小分離并記錄的分析方法。法。l 其過程可簡單描述為：其過程可簡單描述為： 離子源轟擊樣品離子源轟擊樣品帶電荷的碎片離子帶電荷的碎片離子電場加速電場加速(zeU)獲得動能獲得動能(mv2)磁場分離磁場分離檢測器記

56、錄檢測器記錄 其中，其中，z為電荷數(shù)，為電荷數(shù)，e為電子電荷，為電子電荷，U為加速電壓，為加速電壓，m為碎為碎片質(zhì)量，片質(zhì)量，v為電子運動速度。為電子運動速度。質(zhì)譜分析質(zhì)譜分析(MS)的特點的特點l MS用于生物大分子的研究具有以下優(yōu)點用于生物大分子的研究具有以下優(yōu)點:高靈敏度高靈敏度易操作性易操作性準(zhǔn)確性準(zhǔn)確性快速性快速性很好的普適性很好的普適性 高靈敏度高靈敏度能為亞微克級試樣提供信息，可以有效地與色譜能為亞微克級試樣提供信息，可以有效地與色譜聯(lián)用，適用于復(fù)雜體系中聯(lián)用，適用于復(fù)雜體系中痕量物質(zhì)痕量物質(zhì)的鑒定或結(jié)構(gòu)測定。的鑒定或結(jié)構(gòu)測定。質(zhì)譜分析的方法質(zhì)譜分析的方法l 近年來出現(xiàn)的較成功地

57、用于生物大分子質(zhì)譜分析近年來出現(xiàn)的較成功地用于生物大分子質(zhì)譜分析的軟電離技術(shù)主要有下列幾種：的軟電離技術(shù)主要有下列幾種：電噴霧電離質(zhì)譜電噴霧電離質(zhì)譜基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜快原子轟擊質(zhì)譜快原子轟擊質(zhì)譜 離子噴霧電離質(zhì)譜離子噴霧電離質(zhì)譜 大氣壓電離質(zhì)譜大氣壓電離質(zhì)譜在這些技術(shù)中，以前面三種近年來研究得最多，在這些技術(shù)中，以前面三種近年來研究得最多，應(yīng)用得也最廣泛。應(yīng)用得也最廣泛。蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析l 質(zhì)譜分析目前主要測定質(zhì)譜分析目前主要測定一級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)，包括分子量、，包括分子量、肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數(shù)目和位置。肽肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數(shù)目和

58、位置。肽和蛋白的質(zhì)譜測序具有速度快、用量少、易操作和蛋白的質(zhì)譜測序具有速度快、用量少、易操作等優(yōu)點，使它非常適合現(xiàn)代科研工作的要求。等優(yōu)點，使它非常適合現(xiàn)代科研工作的要求。l 蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析原理原理為：通過為：通過電離源電離源將蛋白質(zhì)分將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為子轉(zhuǎn)化為氣相離子氣相離子,然后利用質(zhì)譜分析儀的然后利用質(zhì)譜分析儀的電場電場、磁場磁場將具有特定質(zhì)量與電荷比值將具有特定質(zhì)量與電荷比值(M/Z值值)的的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)離子離子分離開來分離開來,經(jīng)過離子檢測器收集分離的離子經(jīng)過離子檢測器收集分離的離子,確定離子的確定離子的M/Z值值，分析鑒定未知蛋白質(zhì)。，分析鑒定未知蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的質(zhì)譜

59、分析方法蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析方法l MS用于多肽和蛋白質(zhì)測序可分為三種方法：用于多肽和蛋白質(zhì)測序可分為三種方法：第一種方法稱為第一種方法稱為蛋白圖譜蛋白圖譜(protein mapping),它它是使用特異性的是使用特異性的酶解酶解或或化學(xué)水解化學(xué)水解的方法將的方法將蛋白蛋白切切成小的片段，然后用質(zhì)譜檢測各產(chǎn)物肽的分子量成小的片段，然后用質(zhì)譜檢測各產(chǎn)物肽的分子量,將所得肽譜數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)庫將所得肽譜數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)庫,搜索與之相對應(yīng)的已搜索與之相對應(yīng)的已知蛋白知蛋白,從而獲取待測蛋白序列；從而獲取待測蛋白序列；l 第二種方法是利用待測分子在電離及飛行過程中第二種方法是利用待測分子在電離及飛行過程中產(chǎn)生的

60、亞穩(wěn)離子，通過分析相鄰?fù)M類型峰的質(zhì)產(chǎn)生的亞穩(wěn)離子，通過分析相鄰?fù)M類型峰的質(zhì)量差，識別相應(yīng)的量差，識別相應(yīng)的氨基酸殘基氨基酸殘基；l 第三種方法稱為第三種方法稱為梯狀測序梯狀測序(ladder sequencing)，是用化學(xué)探針或酶解使蛋白或肽從端或端逐是用化學(xué)探針或酶解使蛋白或肽從端或端逐一降解下氨基酸殘基，形成相互間差一個氨基酸一降解下氨基酸殘基，形成相互間差一個氨基酸殘基的殘基的系列肽系列肽，再經(jīng)質(zhì)譜檢測，由相鄰峰的質(zhì)量，再經(jīng)質(zhì)譜檢測，由相鄰峰的質(zhì)量差可知相應(yīng)氨基酸殘基。差可知相應(yīng)氨基酸殘基。質(zhì)譜中主要出現(xiàn)的離子有四種，即質(zhì)譜中主要出現(xiàn)的離子有四種，即分子離分子離子、碎片離子、同位素