菌種的管理和保藏

1、 菌種的保藏和管理菌種的保藏和管理 杜平華 菌種保藏的重要性菌種保藏的重要性 菌種保藏是微生物檢驗(yàn)工作中的一項(xiàng)常規(guī)技術(shù)菌種保藏是微生物檢驗(yàn)工作中的一項(xiàng)常規(guī)技術(shù) 科學(xué)保藏和管理關(guān)系到檢驗(yàn)結(jié)果的正確性科學(xué)保藏和管理關(guān)系到檢驗(yàn)結(jié)果的正確性. . 菌種的菌種的20152015版指導(dǎo)原則版指導(dǎo)原則 原則：原則： 應(yīng)來(lái)自認(rèn)可的國(guó)內(nèi)或國(guó)外菌種保藏機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株，或使用與標(biāo)準(zhǔn)菌應(yīng)來(lái)自認(rèn)可的國(guó)內(nèi)或國(guó)外菌種保藏機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株，或使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有相關(guān)特性等效的商業(yè)派生菌株。株所有相關(guān)特性等效的商業(yè)派生菌株。 使用菌種來(lái)源使用菌種來(lái)源 菌種編號(hào)菌種編號(hào) 20152015版版 CMCC CMCC 中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心

2、中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心 CMCC CMCC（F F）真菌真菌 CMCCCMCC（B B）細(xì)菌細(xì)菌 協(xié)調(diào)案協(xié)調(diào)案 ATCC ATCC 美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏中心美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏中心 NCIMB NCIMB 英國(guó)食品工業(yè)與海洋菌種保藏中心英國(guó)食品工業(yè)與海洋菌種保藏中心 NBRC NBRC 日本技術(shù)評(píng)價(jià)研究所生物資源中心日本技術(shù)評(píng)價(jià)研究所生物資源中心 CIP CIP 法國(guó)巴斯德研究所菌種保藏中心法國(guó)巴斯德研究所菌種保藏中心 菌種保藏的中心任務(wù)菌種保藏的中心任務(wù)- - 廣泛收集。廣泛收集。 - - 選擇最適宜的保藏方法，保持菌種的生物學(xué)特性。選擇最適宜的保藏方法，保持菌種的生物學(xué)特性。 常用菌種的保藏常用菌種

3、的保藏菌種保藏的原則菌種保藏的原則 根據(jù)微生物菌種的生理、生化特性，盡量降低微生物細(xì)胞的代謝根據(jù)微生物菌種的生理、生化特性，盡量降低微生物細(xì)胞的代謝強(qiáng)度，處于休眠狀態(tài)，以減低菌種的變異率。強(qiáng)度，處于休眠狀態(tài)，以減低菌種的變異率。 常用菌種的保藏常用菌種的保藏20152015指導(dǎo)原則指導(dǎo)原則試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過(guò)試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過(guò)5 5代（從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌代（從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第種為第0 0代）。代）。采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。冷凍保藏：冷凍保藏：在低溫下保藏

4、，一般在低于在低溫下保藏，一般在低于-30-30或或-70-70，是有效的長(zhǎng)期儲(chǔ)藏方法。，是有效的長(zhǎng)期儲(chǔ)藏方法。凍干法保藏凍干法保藏：是一種長(zhǎng)期保藏菌種的方法法。：是一種長(zhǎng)期保藏菌種的方法法。冷藏：冷藏：在在2 288保藏，是短期儲(chǔ)藏方法。保藏，是短期儲(chǔ)藏方法。 菌種的保藏菌種的保藏低溫、干燥、缺氧、缺乏營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境條件都可以抑制微生物的代謝和生長(zhǎng)繁低溫、干燥、缺氧、缺乏營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境條件都可以抑制微生物的代謝和生長(zhǎng)繁殖，因此低溫、干燥和真空是菌種保藏的重要手段。殖，因此低溫、干燥和真空是菌種保藏的重要手段。 菌種的保藏 工作菌株不可代替標(biāo)準(zhǔn)菌株，標(biāo)準(zhǔn)菌株的商業(yè)衍生物僅可用作 工作菌株。 菌種的保藏

5、 不同的微生物，應(yīng)根據(jù)其生物特征來(lái)選擇最適宜的保藏方法： 挑選特征典型的純菌菌落 確定保藏的合適菌體形態(tài) 選擇最適宜的方法保藏 定期檢查 菌種的保藏 液氮超低溫保藏法 超低溫廣泛數(shù)十年復(fù)雜、需要專(zhuān)門(mén)設(shè)備，有效冷凍真空干燥保藏法 干燥、缺氧、低溫 廣泛510年以上復(fù)雜、需要專(zhuān)門(mén)設(shè)備和方法，有效干燥（沙土、牛奶）保藏法 干燥、無(wú)營(yíng)養(yǎng) 產(chǎn)孢微生物110年較簡(jiǎn)便，需制備沙土管，有效液體石蠟保藏法低溫、缺氧廣泛1年以上簡(jiǎn)便瓊脂斜面低溫保藏法 低溫 4 廣泛短時(shí)間簡(jiǎn)便液體冷液體冷凍保藏凍保藏法法 液體培養(yǎng)基 低溫 廣泛半年以上簡(jiǎn)便一定比例甘油 低溫、缺氧 廣泛數(shù)十年以上簡(jiǎn)便瓷珠冷凍保藏法 低溫 廣泛1年以

6、上簡(jiǎn)便 瓊脂斜面低溫保藏法 液體冷凍保藏法液體冷凍保藏法 1%蛋白胨 、甘油 ,滅菌,接種、培養(yǎng)18-24小時(shí). 保存條件 -80可保存數(shù)年. 菌種的傳代和使用 工作菌種傳代次數(shù)不得超過(guò)5代。 1代 是指將活的培養(yǎng)物接種到新鮮培養(yǎng)基中，任何亞培養(yǎng)的形式均被認(rèn)為是轉(zhuǎn)種或傳代一次。 基本操作技術(shù) 細(xì)菌的接種、分離和培養(yǎng) 接種：將微生物的培養(yǎng)物接種到培養(yǎng)基上的一種操作技術(shù)。 接種： 斜面培養(yǎng)基 半固體培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基 平板培養(yǎng)基分離技術(shù)分離技術(shù) 將細(xì)菌分離成單個(gè)細(xì)胞，使其獨(dú)立分裂繁殖形成單個(gè)菌落的操作技術(shù)。 方法 平板劃線(xiàn) - 分段劃線(xiàn)、連續(xù)劃線(xiàn) 涂布分離法 傾注分離法等 培養(yǎng)培養(yǎng)接種后的培養(yǎng)基，

7、根據(jù)不同微生物生長(zhǎng)條件的要求，培養(yǎng)基放在適宜 微生物生長(zhǎng)的環(huán)境中溫度、濕度、氧氣等），使其生長(zhǎng)繁殖的過(guò)程。 需氣菌培養(yǎng)法: 嗜溫性微生物：1545。 嗜熱性微生物：45以上。 嗜冷性微生物：15以下。 培養(yǎng)后微生物的生長(zhǎng)判斷固體培養(yǎng)基 有菌落生長(zhǎng)或沿穿刺線(xiàn)擴(kuò)散生長(zhǎng)。液體培養(yǎng)基 渾濁、菌膜、沉淀等。 菌種的傳代和使用凍干菌種（0代） 增菌培養(yǎng) 蘇醒（1代） 增菌培養(yǎng) 復(fù)壯（2代） 分裝冷凍保存 斜面培養(yǎng)基 劃線(xiàn)傳代（3代） 使用 分裝冷凍保存 斜面培養(yǎng)基 劃線(xiàn)傳代（4代） 使用 分裝冷凍保存 斜面培養(yǎng)基 劃線(xiàn)傳代（5代） 使用 分裝冷凍保存。斜面培養(yǎng)物1 3環(huán) 適宜液體培養(yǎng)基510ml，培養(yǎng)18

8、24h 取適 當(dāng)量，用滅菌生理鹽水稀釋后比濁（或預(yù)實(shí)驗(yàn)） 按比濁結(jié)果或預(yù)實(shí)驗(yàn)將菌液稀釋到相應(yīng)倍數(shù) 平板計(jì)數(shù)(取上述稀釋液1ml加入平皿中加入 規(guī)定培養(yǎng)基、培養(yǎng)、點(diǎn)計(jì)菌落數(shù) 實(shí)驗(yàn)、陽(yáng)性對(duì)照 平板計(jì)數(shù)也可和試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行 菌液的制備和使用 修訂前 修訂后營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基。 胰酪大豆胨瓊脂或胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基；沙氏葡萄糖瓊脂或沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基；馬鈴薯葡萄糖瓊脂 。 菌液制備用培養(yǎng)基2015修訂內(nèi)容 菌株 培養(yǎng)基 培養(yǎng)溫度()培養(yǎng)時(shí)間( h )枯草芽孢桿菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌胰酪大豆胨瓊脂或胰酪大豆胨肉湯。沙氏葡萄糖瓊脂或沙氏沙氏葡萄糖瓊脂

9、或馬鈴薯葡萄糖瓊脂葡萄糖肉湯303520252025182423天57天，或直到獲得豐富的孢子 菌液制備用培養(yǎng)基2015修訂內(nèi)容 修訂前 修訂后 0.9氯化鈉溶液 pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液。 菌液制備用稀釋液2015修定內(nèi)容 菌液菌液貯存貯存20152015修定內(nèi)容修定內(nèi)容 修訂前 修訂后 菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用；若保存在2-8，可在24小時(shí)內(nèi)使用。 穩(wěn)定的黑曲孢子懸液可保存在2-8，在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)使用。 菌種的鑒定與復(fù)壯 菌種的衰退 由自發(fā)突變的作用而引起某些優(yōu)良特性變?nèi)趸蛳У默F(xiàn)象。 控制菌種的衰退方法 - 控制傳代次數(shù) 降低突變

10、幾率，采用良好的傳代保藏方法。- 創(chuàng)造適宜的培養(yǎng)條件： - 用不同類(lèi)型的細(xì)胞進(jìn)行傳代 - 采用有效的保藏方法 定期檢查 菌種的復(fù)壯采用分離純化的方法。-形 態(tài) 特 征 、 生 理 生 化 特 征 、 代 謝 產(chǎn) 物 、 血 清 學(xué) 等 一系列試驗(yàn)鑒定，證明復(fù)壯后的菌種與原種完全一致。 菌種的鑒定與復(fù)壯 微生物鑒定系統(tǒng)是基于不同的分析方法，其局限性與方法和數(shù)據(jù)庫(kù)的局限性有關(guān)。 微生物鑒定需通過(guò)已建立的標(biāo)準(zhǔn)微生物如模式菌株的特征(基因型和/或表型)相匹配來(lái)完成。否則將得不到鑒定的結(jié)果. 明確鑒定系統(tǒng)局限性和需要的鑒定水平(屬、種、型)。 菌種的鑒定鑒定方法傳統(tǒng)方法 增菌分離(純菌)確認(rèn)試驗(yàn)(氧化酶

11、試驗(yàn) 革蘭氏陰性菌、非發(fā)酵的棒狀細(xì)菌+ 腸道菌-過(guò)氧化氫酶試驗(yàn) 葡萄球菌+ 鏈球菌-凝固酶試驗(yàn)+ 葡萄球菌可能為致病菌以上信息對(duì)大部分類(lèi)型的生產(chǎn)環(huán)境中的微生物的調(diào)查及日常分析，已可提供足夠的信息。 2015版-指導(dǎo)原則 菌種的鑒定 純菌的分離 微生物的表型表型微生物鑒定通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)對(duì)微生物細(xì)胞的恢復(fù)、增殖是有限的，如有些環(huán)境中的微生物在普通微生物增殖培養(yǎng)基不能恢復(fù)。此外，分離出的受損的培養(yǎng)物可能不能完整表達(dá)其表型屬性。基因型微生物鑒定 菌種的鑒定微生物分類(lèi)中使用的表型特征分類(lèi) 特征培養(yǎng)物 菌落形態(tài)學(xué)、 菌落顏色、形狀、大小和產(chǎn)色素形態(tài)學(xué) 細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞大小、細(xì)胞形狀、鞭毛類(lèi)型、內(nèi)容 物、革

12、蘭氏染色、芽孢和抗酸染色、孢子形成模式生理學(xué) 氧氣耐受性、pH范圍、最適溫度和范圍、耐鹽性生化反應(yīng) 碳源的利用、碳水化合物的氧化或發(fā)酵、酶的模式抑制性 膽鹽耐受性、抗生素敏感性、染料耐受性血清學(xué) 凝集反應(yīng)、熒光抗體化學(xué)分類(lèi) 脂肪酸構(gòu)成、微生物毒素、全細(xì)胞組分 生態(tài)學(xué)微 生物來(lái)源 菌種的鑒定保藏環(huán)境 冷藏或冷凍保存。專(zhuān)用的冰箱，上鎖。專(zhuān)人保管 按操作規(guī)程和有關(guān)要求進(jìn)行保管鑒定,或定期更換凍 干菌種。 發(fā)現(xiàn)污染和變異現(xiàn)象，立即報(bào)告、處理。 菌種的管理 菌種的管理使用菌種的單位，應(yīng)具備從事微生物工作的條件和設(shè)備。 菌種應(yīng)由專(zhuān)人負(fù)責(zé)管理。 管理人員應(yīng)具有微生物專(zhuān)業(yè)知識(shí)和技術(shù)水平，并應(yīng)具有較 強(qiáng)的責(zé)任心。 菌種的管理實(shí)驗(yàn)室必須建立菌種保存和使用文件化的程序管理制度；實(shí)驗(yàn)室必須建立菌種保存和使用文件化的程序管理制度； 朔源性朔源性 貯藏貯