藥敏試驗(擴散法)操作方法

1、藥敏試驗（擴散法）操作方法藥敏試驗（擴散法）操作方法河南康星畜禽疫病診斷中心馬長宇容內容: :一、藥物敏感試驗的目的與意義二、常用的藥敏測定方法 三、試驗準備及用品四、藥敏試驗操作步驟五、結果觀察六、影響藥敏結果的因素一、概念一、概念抗菌藥物敏感性試驗（AST，簡稱藥敏試驗）：用于測試抗菌藥物在體外對病原微生物有無抑制作用。（1）MIC：體外能夠抑制細菌生長的最低藥物濃度，臨床醫(yī)師可以根據MIC確定藥物劑量。通常達到穩(wěn)態(tài)的血藥峰濃度（Css）max應為MIC的4-8倍，重癥感染以大于8倍為妥。 （2）為方便臨床給藥，根據MIC提供一個定性的結果是必要的。臨床醫(yī)師根據敏

2、感、中介、耐藥的提示結合MIC可以方便地制定用藥方案。 敏感（S）：表示該藥物對細菌的MIC值低于常規(guī)劑量下的抗菌 藥物血液濃度或組織濃度4-8倍，可以用常規(guī)劑量治愈。 中介（I）：表示該藥物對細菌的MIC值接近于常規(guī)劑量給藥后的血藥濃度或組織藥物濃度，細菌對該藥的敏感性降低，但仍可用于生理性濃集部位的感染或使用高劑量藥物進行治療（注：必須考慮高劑量的安全性）。 耐藥（R）：表示該藥物對細菌的MIC值等于或高于常規(guī)劑量下藥物的血液濃度或組織濃度，細菌不能被該種藥物抑制。意義：意義：1、檢測病原菌對各種抗生素的敏感性，指導臨床合理用藥。避免盲目用藥、濫用藥、大劑量用藥。2、監(jiān)測耐藥性，分析耐藥菌

3、變遷，了解某一地區(qū)致病菌的耐藥變遷、流行病學調查及監(jiān)控，控制和預防耐藥菌株的流行3、為經驗用藥提供所選藥物的參考依據，可預測抗菌治療的效果?！懊舾小敝委熆赡苡行?；“耐藥” 肯定失敗4、新抗菌藥的研究以下情況不需進行藥敏測定：以下情況不需進行藥敏測定：標本污染細菌，非致病菌引起已知某些抗菌藥對某菌有良好的抗菌作用且很少有耐藥菌產生已知細菌全部耐藥的藥物對營養(yǎng)要求高而不易生長的細菌二、常用的藥敏測定方法二、常用的藥敏測定方法 1、擴散法：紙片法、牛津杯法、打孔法等。 紙片法 手工測試的方法，通過測試藥物紙片在固體培養(yǎng)基上的抑菌圈的大小，判斷細菌對該種藥物是否敏感。目前臨床上廣泛使用此法。定性2、稀

4、釋法：瓊脂稀釋法、液體稀釋法（試管、微量） 通過測試細菌在含不同濃度藥物培養(yǎng)基內的生長情況，判斷其最低抑菌濃度（MIC）。自動化儀器均采用液體稀釋法為藥敏試驗的方法。 定量3、E測定法（E test）： 與擴散法相似，但藥物包被于長塑料條上，能夠精確測定MIC值。適于一些特殊病原菌的藥敏測試，但價格較為昂貴。 4、全自動藥敏儀法：三、試驗準備及用品三、試驗準備及用品藥品（單品藥、藥廠的成品藥、中藥）、恒溫培養(yǎng)箱、藥敏片、培養(yǎng)基、平皿（直徑90mm）、燒杯、蒸餾水、濾紙、打孔器（文具店有售）、0.5麥氏比濁管配制方法： 0.048M BaCL2 (1.17% W/V BaCL2.2H2O) 0.

5、5ml 0.36N H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml 將二液混合，置螺口試管中，放室溫暗處保存。用前混勻。有效期為6個月。1 1、培養(yǎng)基、培養(yǎng)基MH肉湯（MHB）Mueller-Hinton Broth用途：用于抗生素敏感試驗配方：（g/L）牛肉粉2.0可溶性淀粉1.5酸水解酪蛋白17.5pH值7.4 0.2 25 原理：牛肉粉和酸水解酪蛋白提供氮源、維生素和氨基酸；可溶性淀粉吸收有毒的代謝產物。用法：稱取本品21.0g,加熱溶解于1000ml 蒸餾水中,121高壓滅菌15分鐘,備用。MH瓊脂（MHA）Mueller-Hinton Agar用途：用于抗生素敏感試驗配方：（g/L）牛

6、肉粉6.0可溶性淀粉1.5酸水解酪蛋白17.5瓊脂17PH值7.3 0.1 25 原理：牛肉粉和酸水解酪蛋白提供氮源、維生素和氨基酸；可溶性淀粉吸收有毒的代謝產物；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。用法：稱取本品 42.0g,加熱溶解于1000ml蒸餾水中,121高壓滅菌15分鐘,待冷至 50，傾入無菌平皿,備用。1、是兼性厭氧菌和需氧菌藥敏試驗標準培養(yǎng)基2、如營養(yǎng)要求高可加0.5%羊血。3、平板直徑為9cm。4、瓊脂板厚度4mm。誤差1mm。5、4保存7天。營養(yǎng)肉湯（營養(yǎng)肉湯（NBNB）Nutrient Broth用途：用途：一般細菌培養(yǎng),轉種,復壯,增菌等（GB標準） 配方：（配方：（g/Lg/L）蛋

7、白胨10牛肉粉3氯化鈉5pH值7.2 0.2 25 原理：原理：蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、維生素、氨基酸和碳源；氯化鈉能維持均衡的滲透壓。用法：用法：稱取本品18.0g,加熱溶解于1000ml蒸餾水中,分裝三角瓶或管, 121高壓滅菌15分鐘備用。營養(yǎng)瓊脂（營養(yǎng)瓊脂（NANA）Nutrient Agar用途：用途：一般細菌培養(yǎng),轉種,復壯,增菌等（GB標準） 配方：（配方：（g/Lg/L）蛋白胨10肉浸粉10氯化鈉 5瓊脂20pH值7.2 0.2 25 原理：原理：蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、維生素、氨基酸和碳源；氯化鈉能維持均衡的滲透壓。用法：用法：稱取本品18.0g,加熱溶解于1000ml蒸

8、餾水中,分裝三角瓶或試管,121高壓滅菌15分鐘備用。MH肉湯（100）、MH瓊脂（250） ；營養(yǎng)肉湯（60） 、營養(yǎng)瓊脂（80）均可以生化試劑店買到。操作步驟：操作步驟：1、玻璃器皿的準備 沖洗、包裹、滅菌、干燥2、記量、稱取原料3、加熱溶解4、校正PH值5、滅菌6、分裝、包裹、備用2 2、藥敏片、藥敏片1、單藥（一種成分） 市場生化試劑店有售，也可自制。但含量及監(jiān)測標準有嚴格界定。建議購買2、成藥（復方成分） 多種聯(lián)合的抗菌藥物制劑應以其成分中某種含量最高的抗菌藥物為標準稀釋成有效濃度。但多數廠家由于產品配方機密，多按產品用量進行配制。藥敏片可由廠家提供，也可自制。3、中藥草藥 將中藥研

9、成粉未，1克加適量的水充分浸泡煮沸,濾液除去雜質后濃縮成1毫升,過濾、高壓滅菌后加入100張紙片干燥備用。制作步驟：1、紙片的準備2、藥液的配制3、抗菌藥敏紙片制作質控：標準菌株的抑菌圈直徑應落在預期范圍內，如果超出該范圍，應視為失控而予以糾正。簡易藥敏片的制法簡易藥敏片的制法紙片的準備：紙片的準備：1、取新華1號定性濾紙，用打孔機打成6毫米直徑的圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔干燥的青霉素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包扎。經15磅15-20分鐘高壓消毒后，放在37溫箱或烘箱中數天，使完全干燥。2、藥片吸水量的測定 在上述藥片用微量移液器進行滴加蒸餾水，最可使藥片完全浸透又不滴水為宜，最終計算出

10、每片藥片的吸水量。一般常用直經6mm的定性濾紙藥片吸水量為0.01ml。藥液的制備（用于商品藥的試驗）：藥液的制備（用于商品藥的試驗）：按獸藥說明書(或標簽)上標明的治療量的10-20倍比例配制藥液。如某藥品：100g兌水100kg，表明該藥治療量為1g兌水1L，配制藥液時就是1g加50-100ml水或1L水加10-20g藥品，即為配制藥敏片所用的藥液濃度。抗菌藥的稀釋劑通常用純化水。說明：不同廠家標示成分及含量相同的成品制劑在用成品做成藥敏時常出現顯著差異（包括同一廠家生產）由于在進行成品制作時常加入一定量的輔助成份，其對藥敏試驗結果常造成較大影響，所以成品藥敏試驗結果并不能完全顯示成品的真

11、實結果。不能用單藥的藥敏結果代替成藥進行用藥。（標示與真實成份及含量有很大差別）建議選用廠家提供的以成品主藥成份制作的藥敏片使用。中藥由于其成份復雜及獨特作用機理，藥敏試驗不能作為唯一的判定標準?？咕幟艏埰谱鳎嚎咕幟艏埰谱鳎悍椒ㄒ环椒ㄒ? : 按每張紙片飽和吸水量為0.01毫升計，在上述含有50片紙片的青霉素瓶內加入藥液0.5毫升，并翻動紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動紙片時不能將紙片搗爛。同時在瓶口上記錄藥物名稱，放37溫箱內過夜，干燥后即密蓋。方法二： 1、將藥液盛于干凈干燥的平皿中。然后將烘干的紙片逐片放入配制好的藥液中，置于4-8浸泡1-2小時，同時要注意翻動，使各紙片充分透藥

12、液。 2、將浸泡好的藥敏片用鑷子夾出，放入另一干燥平皿中。置于恒溫箱中，溫度37，烘干1224小時。（注意經常翻動，避免藥敏片重疊粘連）。 3、將烘干好的藥敏片放入青霉素瓶內進行保存。藥敏紙片的儲存：藥敏紙片的儲存：長期儲存應于20，日常使用的小量紙片可放在4，但應至于含干燥劑的密封容器內。使用時從低溫取出后,放置平衡到室溫后才可打開，用完后應立即將紙片放回冰箱內的密封容器內。 過期紙片不能使用, 應棄去。3 3、高壓滅菌鍋及使用、高壓滅菌鍋及使用4 4、其他用品、其他用品四、藥敏試驗操作步驟：四、藥敏試驗操作步驟：一步法：用病料直接在平板上進行涂抹后貼藥敏片，培養(yǎng)后觀察。二步法：先進行細菌的

13、增值培養(yǎng)后，再取培養(yǎng)菌進行平板藥敏試驗。（紙片法、牛津杯法、打孔法）細菌增值培養(yǎng)：細菌增值培養(yǎng)：1、剖檢已死亡或即將死亡的家禽。2、以無菌手術鑷子陸續(xù)取出病料（心，肝，肺，脾均可）。3、在酒精燈上把手術刀，鑷子，接種環(huán)滅菌，再用接種環(huán)采取病料劃在備好的培養(yǎng)基上，劃線要均勻。（也可用MHB肉湯或營養(yǎng)肉湯上進行增菌培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)一般約需6-8h）1、紙片瓊脂擴散法（1/3）紙片擴散法(disk diffusion test)，K-B法：WHO推薦的全球統(tǒng)一的標準方法。原理：原理：將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中水分溶解后不斷向紙片周圍擴散形成遞減的梯

14、度濃度,在紙片周圍抑菌濃度范圍內測試菌的生長被抑制，從而形成無菌生長的透明圈即為抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的MIC呈負相關關系。1、紙片瓊脂擴散法（2/3）1、細菌涂抹平板 在“超凈臺”中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。 具體方式；用滅菌接種環(huán)取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點涂菌，以每點開始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布于平皿。 （另：可挑取待試細菌于少量生理鹽水中制成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂布均勻

15、致密。） 2、貼藥片： 將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了使能準確的觀察結果，要求藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上；一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若干片（外周一般可貼七片），每種藥敏片的名稱要記住。1、紙片瓊脂擴散法（3/3）3、培養(yǎng)觀察 將平皿培養(yǎng)基置于37溫箱中倒置培養(yǎng)24小時后，觀察效果 2、牛津杯法 第一步同“紙片法”細菌涂抹平板。以無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（內徑6nm、外徑8nm、高10 nm的圓形小管，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養(yǎng)基上，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙，

16、并在小管處標記各種藥物名稱。每個平板可放4-6支小管。待分鐘后，分別向各小管中滴加一定數量的各種藥液，勿使其外溢。置37培養(yǎng)8-18小時，觀察結果。 3、打孔法：第一步同“紙片法”細菌涂抹平板。以無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（外徑為4毫米、孔徑與孔距均為3毫米，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養(yǎng)基上打孔，將孔中的培養(yǎng)基用針頭挑出，并以火焰封底，使培養(yǎng)基能充分的與平皿融合（以防藥液滲漏，影響結果）。加樣：按不同藥液加樣，樣品加至滿而不溢為止。將平皿培養(yǎng)基置于37溫箱中培養(yǎng)24小時后，觀察效果。五、結果觀察：五、結果觀察：在涂有細菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內向四周擴散，其濃度呈梯度

17、遞減，因此在紙片周圍一定距離內的細菌生長受到抑制。培養(yǎng)一定時間后形成一個抑菌圈，抑菌圈越大，說明該菌對此藥敏感性越大，反之越小，若無抑菌圈，則說明該菌對此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線細菌濃度有直接關系。聯(lián)合藥敏試驗抑菌圈邊緣分界清晰、內部潔凈透明,說明該抗菌藥物作用迅速,多半為殺菌劑,邊緣不十分清晰、內部朦朧說明該抗菌藥物可能是慢效抑菌劑或有耐藥的產生、或分解較快維持抗菌時間短。抑菌圈中分層次形成同心年輪樣,可能是聯(lián)合使用抗菌藥物或該抗菌藥物失效過快或細菌產生了耐藥性。藥物敏感實驗判定標準抑菌圈直徑（毫米）敏感度20以上極敏1520高敏1014中敏10以下低敏0不敏 l 多黏菌素抑

18、菌圈；在9毫米以上為高敏，69毫米為低敏，無抑菌圈為不敏。l抗菌中草藥的判定不同于抗菌西藥,通常紙片抑菌直徑達10毫米以上即視為高度敏感。用游標卡尺測量抑菌圈直徑，從平板背面測量最接近的整數毫米數并記錄。抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見不到細菌明顯生長為限。有的菌株可出現蔓延生長，進入抑菌環(huán)，磺胺藥在抑菌環(huán)內出現輕微生長，這些都不作為抑菌環(huán)的邊緣。結果判斷依據鑒定所藥敏紙片判定標準。 六、影響藥敏結果的因素六、影響藥敏結果的因素藥物因素細菌因素培養(yǎng)條件培養(yǎng)基藥敏片藥物因素藥物因素藥物的溶解性 易溶于水的藥物易擴散，難溶性藥物就不易擴散藥物的穩(wěn)定性 如水解（某些內酰胺類藥物）、PH值（青霉素鈉遇酸堿分解、紅霉素遇酸不穩(wěn)定）藥物的抗菌機理 殺菌藥物 環(huán)邊沿明晰 抑菌藥物 環(huán)邊沿模糊細菌恢復生長環(huán)縮小殺菌藥物 氨基糖苷類、喹諾酮類等。抑菌藥物 磺胺類、紅霉素類、林可霉素、四環(huán)素類、氯霉素類等離子的影響 喹諾酮類、四環(huán)素類、