真核基因組DNA提取

1、真核基因組真核基因組 DNA提取提取2022-6-9教學(xué)內(nèi)容教學(xué)內(nèi)容 真核生物基因組的結(jié)構(gòu)及特點、人類基因組計劃真核生物基因組的結(jié)構(gòu)及特點、人類基因組計劃 真核基因組提取的實驗原理、操作說明、儀器使用及注意真核基因組提取的實驗原理、操作說明、儀器使用及注意事項事項 基因組提取后的應(yīng)用：基因組文庫、基因組提取后的應(yīng)用：基因組文庫、PCR及及southern blot RNA提取方法簡介提取方法簡介 核酸（核酸（DNA和和RNA）定量及定性方法的介紹）定量及定性方法的介紹2022-6-9實驗?zāi)康?熟悉真核熟悉真核DNA提取的方法和原理提取的方法和原理 掌握真核生物基因組的結(jié)構(gòu)及特點掌握真核生物基因

2、組的結(jié)構(gòu)及特點l分離純化核酸總的原則：分離純化核酸總的原則：應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性；應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性；排除其它分子的污染排除其它分子的污染（蛋白質(zhì)、脂類、糖、有機(jī)溶劑、金屬離子、外蛋白質(zhì)、脂類、糖、有機(jī)溶劑、金屬離子、外源源DNADNA、RNARNA等）等） 。l核酸純化應(yīng)達(dá)到的要求：核酸純化應(yīng)達(dá)到的要求：核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子；屬離子；其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度；其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度；排除其它核酸分子的污染。排除其它核酸分子的污染。核酸制備的一般原則核酸制備

3、的一般原則盡量簡化操作步驟，縮短提取過程。盡量簡化操作步驟，縮短提取過程。減少化學(xué)因素對核酸的降解（如過量酸堿）減少化學(xué)因素對核酸的降解（如過量酸堿） 減少物理因素對核酸的降解：機(jī)械剪切力（強(qiáng)烈震減少物理因素對核酸的降解：機(jī)械剪切力（強(qiáng)烈震蕩、滲透壓急劇改變、反復(fù)凍融）和高溫蕩、滲透壓急劇改變、反復(fù)凍融）和高溫防止核酸的生物降解（核酸酶的預(yù)防）防止核酸的生物降解（核酸酶的預(yù)防） 。 核酸制備時應(yīng)注意的事項核酸制備時應(yīng)注意的事項: :l核酸制備的步驟：核酸制備的步驟：I. I.材料準(zhǔn)備材料準(zhǔn)備II.II.破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放III.III.核酸分離、純化核酸分離、純化

4、IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)V.V.核酸溶解在適量緩沖液或水中核酸溶解在適量緩沖液或水中l(wèi)核酸酶的抑制和抑制劑核酸酶的抑制和抑制劑降低溫度，改變降低溫度，改變pH及鹽的濃度，都利于對核酸酶及鹽的濃度，都利于對核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有利，當(dāng)然，幾個條件并用更好。利，當(dāng)然，幾個條件并用更好。對于對于RNA，因分子較小，不易被機(jī)械剪切力拉斷，因分子較小，不易被機(jī)械剪切力拉斷，但抑制，但抑制RNase活力較難，故在活力較難，故在RNA提取中設(shè)法提取中設(shè)法抑制抑制RNase更重要。更重要。核酸制備的一般方法

5、和原理核酸制備的一般方法和原理核酸酶的抑制和抑制劑核酸酶的抑制和抑制劑 DNase抑制抑制加入少量加入少量金屬離子螯合劑金屬離子螯合劑，如，如0.01 mol/L EDTA或檸檬酸鈉，或檸檬酸鈉，DNase基本可以全部失活?；究梢匀渴Щ?。 去垢劑、蛋白變性劑及去垢劑、蛋白變性劑及DNase抑制劑抑制劑也可使也可使DNase失活。失活。核酸酶的抑制和抑制劑核酸酶的抑制和抑制劑RNase抑制抑制 操作要帶手套。操作要帶手套。 所有器皿要嚴(yán)格消毒，所有器皿要嚴(yán)格消毒， 試劑處理試劑處理 低溫操作低溫操作 在分離過程中要加入一定的在分離過程中要加入一定的RNase抑制劑。抑制劑。 核酸制備中常用的

6、去垢劑核酸制備中常用的去垢劑用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑，用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑，去垢劑的作用：去垢劑的作用：1溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂；溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂；2溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出來；放出來；3對對RNase、DNase有一定的抑制作用。有一定的抑制作用。如：如：SDSSDS、脫氧膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、4-4-氨基水楊酸鈉、萘氨基水楊酸鈉、萘-1.5-1.5-二磺酸鈉二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑 蛋白質(zhì)變性

7、劑的作用：蛋白質(zhì)變性劑的作用：1.1.使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。防造成蛋白污染。2.2.使蛋白質(zhì)變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。使蛋白質(zhì)變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。3.3.某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制RNaseRNase活性和破裂細(xì)胞的活性和破裂細(xì)胞的作用。作用。 如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPCDEPC1 1）破碎細(xì)胞（防止核酸酶的作用）破碎細(xì)胞（防止核酸酶的作用） 微生物：溶菌酶、微生物：溶菌酶、SDSSDS裂解。裂解。 高等植物：搗碎器破碎、液氮研磨。高等

8、植物：搗碎器破碎、液氮研磨。 酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰凍法：反復(fù)凍融或液氮凍后組織搗碎。冰凍法：反復(fù)凍融或液氮凍后組織搗碎。 動物：液氮處理后用勻漿器破碎。動物：液氮處理后用勻漿器破碎。 細(xì)胞器細(xì)胞器DNADNA：首先純化細(xì)胞器。：首先純化細(xì)胞器。 以上處理時均要同時加入核酸酶抑制劑以上處理時均要同時加入核酸酶抑制劑核酸提取的一般過程核酸提取的一般過程2 2）破碎抽提核酸除去雜質(zhì)）破碎抽提核酸除去雜質(zhì) 1 1首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋白與其它成分分離白與其它成分分離 2 2使核酸與蛋白質(zhì)分離使核酸與蛋白質(zhì)分離

9、 3 3除去脂類除去脂類 4 4多糖的除去多糖的除去核酸提取的一般過程核酸提取的一般過程3 3）核酸的純化）核酸的純化 根據(jù)所需核酸的性質(zhì)和特點除去其它核根據(jù)所需核酸的性質(zhì)和特點除去其它核酸污染酸污染, ,并除去提取過程中的系列試劑并除去提取過程中的系列試劑( (鹽鹽、有機(jī)溶劑等）雜質(zhì)，最后得到均一的核、有機(jī)溶劑等）雜質(zhì)，最后得到均一的核酸樣品。酸樣品。 核酸提取的一般過程核酸提取的一般過程4 4）核酸樣品的保存）核酸樣品的保存 核酸保存的主要條件是溫度和介質(zhì)核酸保存的主要條件是溫度和介質(zhì) 溫度：溫度： 4 4 最佳和最簡單最佳和最簡單 -70 -70是長期保存的良好溫度，為一次性保存是長期保

10、存的良好溫度，為一次性保存 -20 -20保存保存 保存介質(zhì)：保存介質(zhì)： TE TE緩沖溶液緩沖溶液( (最常用最常用) ) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0核酸提取的一般過程核酸提取的一般過程 最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融復(fù)凍融 提取血液基因組提取血液基因組DNADNA時，要選擇有核細(xì)胞時，要選擇有核細(xì)胞 組培細(xì)胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成組培細(xì)胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成DNADNA降解降解

11、含病毒的液體材料含病毒的液體材料DNADNA含量較少，提取前先富集含量較少，提取前先富集 材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純量少，純度低度低 針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式： 植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨 動物組織勻漿或液氮研磨動物組織勻漿或液氮研磨 組培細(xì)胞蛋白酶組培細(xì)胞蛋白酶K 細(xì)菌溶菌酶破壁細(xì)菌溶菌酶破壁 酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠 高溫溫浴時，定時輕柔振蕩高溫溫浴時，定時輕柔振蕩 采用吸附材料吸附的方式分離采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應(yīng)提供相時，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系應(yīng)的緩沖

12、體系 采用有機(jī)（酚采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動作要輕柔作要輕柔 離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間 當(dāng)沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更當(dāng)沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分充分 沉淀后應(yīng)用沉淀后應(yīng)用70的乙醇洗滌，以除去鹽離子等的乙醇洗滌，以除去鹽離子等 晾干晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)，讓乙醇充分揮發(fā) 若長期儲存建議使用若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解緩沖液溶解 TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+離子，抑制離子，抑制DNase pH值為值為8.0，可防止，可

13、防止DNA發(fā)生酸解發(fā)生酸解 DNADNA中含有蛋白、中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)多糖、多酚類雜質(zhì)DNADNA在溶解前，有在溶解前，有酒精殘留，酒精抑酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)制后續(xù)酶解反應(yīng)DNADNA中殘留有金屬中殘留有金屬離子離子重新純化重新純化DNADNA，去，去除蛋白、多糖、多酚除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)等雜質(zhì)重新沉淀重新沉淀DNADNA，讓，讓酒精充分揮發(fā)酒精充分揮發(fā)增加增加7070乙醇洗滌乙醇洗滌的次數(shù)（的次數(shù)（2-32-3次）次）q問題一：問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。反應(yīng)。原因原因?qū)Σ卟逜260/2801.8材料不新鮮或反復(fù)凍材料不

14、新鮮或反復(fù)凍融融未很好抑制內(nèi)源核酸未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性酶的活性提取過程操作過于劇提取過程操作過于劇烈，烈，DNADNA被機(jī)械打斷被機(jī)械打斷外源核酸酶污染外源核酸酶污染反復(fù)凍融反復(fù)凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料避盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的的DNADNA時，可增加裂解液中螯合劑時，可增加裂解液中螯合劑的含量的含量細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高所有試劑用無菌

15、水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌溫滅菌將將DNADNA分裝保存于緩沖液中，避免分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融反復(fù)凍融q問題二：問題二：DNA降解降解對對策策原因原因?qū)嶒灢牧喜患鸦蛄可賹嶒灢牧喜患鸦蛄可倨票诨蛄呀獠怀浞制票诨蛄呀獠怀浞殖恋聿煌耆恋聿煌耆礈鞎r洗滌時DNADNA丟失丟失盡量選用新鮮（幼嫩）的材盡量選用新鮮（幼嫩）的材料料動植物要勻漿研磨充分；動植物要勻漿研磨充分；G G菌、酵母裂解前先用生物酶菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁或機(jī)械方式破壁高溫裂解時，時間適當(dāng)延長高溫裂解時，時間適當(dāng)延長（對于動物細(xì)胞、細(xì)菌可增（對于動物細(xì)胞、細(xì)菌可增加加PKPK的用量）的用量）低溫沉淀，延長沉淀時間

16、低溫沉淀，延長沉淀時間加輔助物，促進(jìn)沉淀加輔助物，促進(jìn)沉淀洗滌時，最好用槍頭將洗滌洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒液吸出，勿傾倒q問題三：問題三：DNA提取量少提取量少對對策策原因原因?qū)嶒炘?想要制備基因組想要制備基因組DNA，必須，必須破碎細(xì)胞膜破碎細(xì)胞膜，去除蛋白質(zhì)去除蛋白質(zhì)、脂類和糖類脂類和糖類等生物大分子且等生物大分子且避避免被細(xì)胞內(nèi)核酸酶降解免被細(xì)胞內(nèi)核酸酶降解即保證即保證DNA的完整性。的完整性。 在在EDTA（螯合二價陽離子以抑制（螯合二價陽離子以抑制DNase）存在的情況下，）存在的情況下，將分散好的真核生物組織、細(xì)胞用將分散好的真核生物組織、細(xì)胞用蛋白酶蛋白酶K消化消

17、化真核細(xì)胞真核細(xì)胞或組織并分解蛋白質(zhì)，或組織并分解蛋白質(zhì)， 用用SDS溶解細(xì)胞質(zhì)并使蛋白質(zhì)變性從而與溶解細(xì)胞質(zhì)并使蛋白質(zhì)變性從而與DNA分子分離，分子分離，使使DNA分子以可溶形式存在于溶液中。分子以可溶形式存在于溶液中。 DNA在在高鹽低高鹽低pH的條件下，與硅基質(zhì)膜特異性結(jié)合，在的條件下，與硅基質(zhì)膜特異性結(jié)合，在低低鹽高鹽高pH值條件下，吸附的值條件下，吸附的DNA被洗脫下來。被洗脫下來。實驗步驟實驗步驟處死小鼠，取肝臟處死小鼠，取肝臟20-50mg，剪碎剪碎，加入加入1.5mL離心管內(nèi)離心管內(nèi)加入加入600LLysisBufferA，振蕩混勻振蕩混勻加入加入10L蛋白酶蛋白酶K，60水浴

18、水浴1h，其間顛倒混勻數(shù)次其間顛倒混勻數(shù)次1.裂解組織細(xì)胞，變性蛋白，沉淀生物大分子裂解組織細(xì)胞，變性蛋白，沉淀生物大分子組織塊盡量剪碎，組織塊盡量剪碎，否則影響裂解及消化否則影響裂解及消化主要含有主要含有SDSSDS（溶解細(xì)胞質(zhì)并使蛋白質(zhì)變性溶解細(xì)胞質(zhì)并使蛋白質(zhì)變性）EDTAEDTA（螯合二價陽離子以抑制螯合二價陽離子以抑制DNaseDNase）和和Tris-HCl Tris-HCl （緩沖體）（緩沖體）消化降解蛋白質(zhì)消化降解蛋白質(zhì)2022-6-9離心離心5min，將，將上清上清轉(zhuǎn)入離轉(zhuǎn)入離心柱中，靜置心柱中，靜置2min加入加入10LRNaseA，混勻，混勻，室溫放置室溫放置10min加入

19、加入400LLysisBufferB，劇烈震蕩，劇烈震蕩30s核酸內(nèi)切酶、核酸內(nèi)切酶、去除去除DNADNA制品中的污染制品中的污染RNARNA沉淀作用，內(nèi)含有醋酸，沉淀作用，內(nèi)含有醋酸，提供低提供低pHpH環(huán)境環(huán)境上清可能出現(xiàn)少量白色漂浮物，上清可能出現(xiàn)少量白色漂浮物，此為未消化完全的細(xì)胞和蛋白質(zhì)此為未消化完全的細(xì)胞和蛋白質(zhì)2.DNA吸附在硅基質(zhì)膜上，清洗去除鹽等雜質(zhì)吸附在硅基質(zhì)膜上，清洗去除鹽等雜質(zhì)12,000rpm離心離心1min，棄廢液，棄廢液加入加入700LWashbufferA，12,000rpm離心離心1min，棄廢液，棄廢液加入加入700LWashbufferB，12,000rp

20、m離心離心1min，棄廢液，棄廢液加入加入500LWashbufferB，12,000rpm離心離心1min，棄廢液，棄廢液再次再次12,000rpm離心離心2min，將離心柱置于，將離心柱置于新的新的離心管離心管中，并打開離心柱蓋，于室溫或中，并打開離心柱蓋，于室溫或37恒恒溫箱放置溫箱放置510min，直至無明顯乙醇味，直至無明顯乙醇味Wash buffer AWash buffer A（含含60%60%的乙醇）的乙醇）Wash buffer BWash buffer B（含含80%80%的乙醇）的乙醇）主要去除鹽等雜主要去除鹽等雜質(zhì)質(zhì)3.洗脫洗脫DNA在硅基質(zhì)膜中央加入在硅基質(zhì)膜中央加入

21、50LElutionBuffer（EB）(事先預(yù)熱事先預(yù)熱5565)置于室溫置于室溫2min12,000rpm離心離心2min所得液體即為基因組所得液體即為基因組DNA溶液。溶液。 Elution Buffer（EB）：主要是）：主要是TE buffer,提供提供高高pH值環(huán)境，使吸附的值環(huán)境，使吸附的DNA被洗脫下來被洗脫下來注意事項注意事項 材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低。量少，純度低。 由于真核生物基因組較大，操作時應(yīng)注意由于真核生物基因組較大，操作時應(yīng)注意輕柔，最大限度地減少機(jī)械和化學(xué)作用對輕柔，最大限度地減少機(jī)械和化學(xué)作用對DNA的

22、剪切，從而獲得相對完整的的剪切，從而獲得相對完整的DNA。實驗結(jié)果實驗結(jié)果核酸（核酸（DNA及及RNA）的鑒定及定量）的鑒定及定量紫外分光光度法紫外分光光度法瓊脂糖凝膠電泳法瓊脂糖凝膠電泳法 紫外分光光度法紫外分光光度法 測定測定DNA的的純度和濃度純度和濃度原理：原理： DNA或或RNA鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫外光區(qū)具鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫外光區(qū)具有較強(qiáng)的吸收有較強(qiáng)的吸收,其其吸收峰在吸收峰在260 nm處。當(dāng)處。當(dāng)DNA樣品中樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其他小分子污染時，會影響含有蛋白質(zhì)、酚或其他小分子污染時，會影響DNA吸收光的準(zhǔn)確測定。吸收光的準(zhǔn)確測定。蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)在280 nm處有最大的吸

23、處有最大的吸收峰，收峰，鹽和小分子則集中在鹽和小分子則集中在230 nm處。因此，一般處。因此，一般情況下同時檢測同一樣品的情況下同時檢測同一樣品的OD260、OD280 和和OD230計計算其比值來衡量樣品的純度。算其比值來衡量樣品的純度。即即OD2601時：時： dsDNA(雙鏈雙鏈DNA)濃度約為濃度約為50 g/mL ssDNA(單鏈單鏈DNA)濃度約為濃度約為37g/ml RNA濃度約為濃度約為40g/ml 寡核苷酸寡核苷酸濃度約為濃度約為30g/ml濃度的計算濃度的計算dsDNA濃度（濃度（g/L）=OD260稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)50/1000RNA濃度（濃度（g/L）=OD260稀釋

24、倍數(shù)稀釋倍數(shù)40/1000純度的檢測純度的檢測DNA純品的純品的OD260/OD280 約為約為1.8。 OD260/OD2801.9說明含有說明含有RNA污染；污染； OD260/OD2801.6 說明有殘余的蛋白質(zhì)、酚等說明有殘余的蛋白質(zhì)、酚等存在。存在。OD230/OD260的比值應(yīng)在的比值應(yīng)在0.40.5之間，若比值較高之間，若比值較高說明有殘余的鹽存在。說明有殘余的鹽存在。有些分光光度計則顯示有些分光光度計則顯示OD260/OD230，其比值應(yīng)在，其比值應(yīng)在22.5之間，偏小則說明有殘余鹽剩余。之間，偏小則說明有殘余鹽剩余。瓊脂糖凝膠電泳法 分離鑒定分離鑒定核酸的常規(guī)方法 用瓊脂糖作

25、支持介質(zhì)的一種電泳方法。用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。 瓊脂糖（瓊脂糖（Agarose，AG）是瓊脂中）是瓊脂中不帶電荷不帶電荷的中性的中性組成成份（幾乎不含硫酸根，主要成分為多糖），組成成份（幾乎不含硫酸根，主要成分為多糖），其水溶液可以制成凝膠，具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。其水溶液可以制成凝膠，具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。結(jié)果觀察：結(jié)果觀察： 制備凝膠時先加入少量制備凝膠時先加入少量熒光染料熒光染料，其分子，其分子可插入可插入DNA的堿基之間，可在的堿基之間，可在紫外燈紫外燈下直接觀下直接觀察到察到DNA片段片段在凝膠上的位置在凝膠上的位置（熒光條帶），（熒光條帶），也可在經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)中直接拍照也可在經(jīng)

26、凝膠成像系統(tǒng)中直接拍照。瓊脂糖凝膠制備及電泳瓊脂糖凝膠制備及電泳凝膠制備倒膠點樣電泳紫外燈下觀察1、凝膠準(zhǔn)備凝膠準(zhǔn)備（0.8%）:用1TAE配制1瓊脂糖凝膠。 稱0.8 g瓊脂糖置三角瓶中，加100 mL 1TAE 微波爐加熱大約大約1分鐘分鐘，熔化瓊脂糖 熔化的瓊脂糖自然冷卻到自然冷卻到6070，加入熒光染加入熒光染料料 2L，并輕輕混勻。2、倒膠倒膠： 將冷卻60的凝膠緩慢倒入制膠模具倒入制膠模具中，在膠一端插上梳子插上梳子。 室溫下靜置20 min，凝膠凝固凝膠凝固。撥出梳子，將帶凝膠的膠床置于電泳槽中，并使樣品孔位于電場負(fù)極電場負(fù)極。3、點樣：點樣： 向電泳槽中加入加入1TAE電泳緩沖

27、液電泳緩沖液，讓液面高于膠面1mm。 樣品準(zhǔn)備：吸取5 L已提取的基因組DNA點在點樣紙上，加入1 L 6上樣緩沖液上樣緩沖液，用移液器輕輕混勻。上樣：用移液器吸取樣品，輕輕的加入到凝膠的樣品孔中。上樣緩沖液（loading buffer）作用：指示劑；沉降作用（含甘油），防止漂樣。4、電泳、電泳： 蓋上電泳槽，接通電源，開始電泳 。電泳條件：電壓80v（恒壓）；時間30 min左右（根據(jù)指示劑遷移位置，判斷是否終止電泳） 電泳結(jié)束后，切斷電源，取出凝膠。5、紫外燈下觀察并分析結(jié)果紫外燈下觀察并分析結(jié)果：紫外檢測儀直接觀察電源條帶 攝影記錄 小鼠肝臟DNA 1 2 3實驗討論 提取后的基因組提

28、取后的基因組DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，條帶彌散，分析其可能原因。條帶彌散，分析其可能原因。思考題 1. 簡述真核基因組結(jié)構(gòu)特點。簡述真核基因組結(jié)構(gòu)特點。 2. 如何從動物組織中提取基因組如何從動物組織中提取基因組DNA，簡，簡述其原理。述其原理。43提取真核基因組DNA的應(yīng)用u基因組基因組包含了某物種生長、發(fā)育、繁殖等各項生理活動包含了某物種生長、發(fā)育、繁殖等各項生理活動的幾乎全部信息量，因而對真核細(xì)胞基因組的結(jié)構(gòu)組成，以的幾乎全部信息量，因而對真核細(xì)胞基因組的結(jié)構(gòu)組成，以及表達(dá)調(diào)控的研究至關(guān)重要。及表達(dá)調(diào)控的研究至關(guān)重要。u高純度、相對完整的基因組高純度、相對完整的基因組

29、DNA是進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和功能研是進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和功能研究的重要起始步驟。究的重要起始步驟。u應(yīng)用于應(yīng)用于構(gòu)建基因組文庫構(gòu)建基因組文庫southern雜交雜交PCR技術(shù)技術(shù)441.構(gòu)建基因組文庫基因組基因組DNA文庫（文庫（genomic DNA library） 從生物組織細(xì)胞從生物組織細(xì)胞提取出基因組提取出基因組DNA，用物理方法（超聲，用物理方法（超聲波、攪拌剪力等）或酶法（限制性核酸內(nèi)切酶的不完全酶解）波、攪拌剪力等）或酶法（限制性核酸內(nèi)切酶的不完全酶解）將將DNA降解成預(yù)期大小的片段降解成預(yù)期大小的片段，然后將這些片段，然后將這些片段與適當(dāng)?shù)妮d與適當(dāng)?shù)妮d體體（常用噬菌體、粘?；颍ǔＳ檬删w

30、、粘?；験AC載體）載體）連接連接，轉(zhuǎn)入受體細(xì)菌或轉(zhuǎn)入受體細(xì)菌或細(xì)胞細(xì)胞，這樣每一個細(xì)胞接受了含有一個基因組，這樣每一個細(xì)胞接受了含有一個基因組DNA片段與載片段與載體連接的重組體連接的重組DNA分子，而且可以繁殖擴(kuò)增，分子，而且可以繁殖擴(kuò)增，許多細(xì)胞一起許多細(xì)胞一起組成一個含有基因組各組成一個含有基因組各DNA片段克隆的集合體片段克隆的集合體。構(gòu)建基因組文庫的目的：構(gòu)建基因組文庫的目的： 以穩(wěn)定的重組體形式保存某種生物的全部遺傳以穩(wěn)定的重組體形式保存某種生物的全部遺傳信息和分離克隆有用的目的基因；信息和分離克隆有用的目的基因； 染色體染色體DNA非常復(fù)雜，單個基因所占比例十分非常復(fù)雜，單個基

31、因所占比例十分微小，若想從龐大的基因組中將其分離出來，一般微小，若想從龐大的基因組中將其分離出來，一般需要先進(jìn)行擴(kuò)增，所以需要構(gòu)建基因組文庫。需要先進(jìn)行擴(kuò)增，所以需要構(gòu)建基因組文庫。 基因組文庫構(gòu)建 構(gòu)建基因組文庫用載體構(gòu)建基因組文庫用載體噬菌體置換型載體或黏粒載體噬菌體置換型載體或黏粒載體質(zhì)粒載體：小，只能用于構(gòu)建葉綠體基因組文庫。質(zhì)粒載體：小，只能用于構(gòu)建葉綠體基因組文庫?；境绦蚧境绦?（1）基因的克?。┗虻目寺?（2）克隆基因的分離）克隆基因的分離 （3）分離基因的檢測與分析）分離基因的檢測與分析分離到的基因用于分離到的基因用于： 基因治療（例如正常的人的腺苷脫氫酶基因治療（例如正

32、常的人的腺苷脫氫酶 （ADA）基因成功植）基因成功植入入ADA缺乏癥患者的淋巴結(jié)構(gòu)缺乏癥患者的淋巴結(jié)構(gòu)）、）、DNA疫苗（疫苗（HIV-9P160核酸疫核酸疫苗）、蛋白質(zhì)產(chǎn)品（胰島素、干擾素、生長因子等）苗）、蛋白質(zhì)產(chǎn)品（胰島素、干擾素、生長因子等）2. Southern blot 指將電泳分離的指將電泳分離的待測待測DNA片段片段結(jié)合到一定的結(jié)合到一定的固相固相支持物支持物上，然后與存在于液相中的標(biāo)記上，然后與存在于液相中的標(biāo)記核酸探針核酸探針進(jìn)行進(jìn)行雜交雜交的過程，是目前最常用的核酸分子雜交的過程，是目前最常用的核酸分子雜交方法。方法。 由于由于Southern 印跡雜交的高靈敏度和高特異

33、性，印跡雜交的高靈敏度和高特異性，它廣泛被應(yīng)用在遺傳病檢測、它廣泛被應(yīng)用在遺傳病檢測、DNA指紋分析和指紋分析和PCR產(chǎn)物判斷等研究中。產(chǎn)物判斷等研究中。核酸雜交: Southern blot：用于DNA分析Northern blot：用于RNA分析3. PCR PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可以從復(fù)雜的材料：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可以從復(fù)雜的材料中擴(kuò)增中擴(kuò)增 特殊特殊DNA序列的強(qiáng)有力的技術(shù)。用序列的強(qiáng)有力的技術(shù)。用采用特意引物的采用特意引物的PCR直接從基因組直接從基因組DNA中分中分離基因。離基因。 缺點：由于缺點：由于PCR酶的持續(xù)合成能力的不足和酶的持續(xù)合成能力的不足和校正能力的缺陷，僅對較短產(chǎn)物的擴(kuò)增有校正能力的缺陷，僅對較短產(chǎn)物的擴(kuò)增有效（效（5Kb）。）?？偪俁NA的提取的提取提取提取RNA實驗的關(guān)鍵實驗的關(guān)鍵 _嚴(yán)格防止嚴(yán)格防止RNase的污染的污染核糖核酸酶核糖核酸酶(RNase): 催化降解催化降解RNA為小分子片段的核酸酶為小分子片段的