畢業(yè)設(shè)計開題報告活性污泥中反硝化菌的分離與鑒定

1、畢業(yè)設(shè)計（論文）開題報告課題 名稱：活性污泥中反硝化菌的分離與鑒定課題名稱活性污泥中反硝化菌的分離與鑒定課題來源選題的背 景及意義教師科研課題類型應(yīng)用（實(shí)驗(yàn)）研究類隨著工業(yè)的發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，工業(yè)廢水和城市污水中氨氮化合物的含量急劇上升，廢水中的氨氮排入水體，容易引起水中藻類及其他微 生物的大量繁殖，形成富營養(yǎng)化污染，這不僅會使自來水廠處理廠運(yùn)行困難， 造成飲用水的異味，而且嚴(yán)重時會使水中溶解氧下降，魚類大量死亡，甚至導(dǎo) 致湖泊的干涸滅亡，因此廢水的氮處理成為研究熱點(diǎn)之一。目前較為普遍的脫氮方式為活性污泥法，一般把經(jīng)過馴化的活性污泥進(jìn)行固定，而采用單一菌種用于水處理的例子不是很多，

2、活性污泥固定的優(yōu)點(diǎn)在于 活性污泥中各個菌種是互生的關(guān)系，食物鏈較長，可以更為高效的處理污水， 但相對于污水來說，成分較為簡單的污水可以采用純菌進(jìn)行處理。固定化微生 物技術(shù)目前已成為生物工程領(lǐng)域的重要分支，由于該技術(shù)所具有的細(xì)胞濃度 高，反應(yīng)速度快，便于連續(xù)化和自動化控制，易于管理等突出優(yōu)點(diǎn)。但由于活性污泥法脫氮的主體一一硝化菌生長緩慢，為避免其流失，取得 較好的脫氮效果，往往要求污泥在反應(yīng)器中停留很長時間，即需要很大的爆氣 池，從而限制了活性污泥系統(tǒng)的處理能力。為了達(dá)到新的排放標(biāo)準(zhǔn)，必須對原 有的爆氣池進(jìn)行擴(kuò)建，但由于空間的限制，擴(kuò)建活性污泥處理系統(tǒng)往往十分困 難，甚至不可能。因此一種新的廢水

3、生物脫氮技術(shù)，勢在必行。生物脫氮法主 要有傳統(tǒng)硝化反硝化，短程硝化反硝化，同時硝化反硝化，厭氧氨氧化。反硝化菌廣泛存在于水中，尤其是在沉積物中，菌落特征：圓形，白色， 表面有光澤，邊緣整齊，在顯微鏡下為棒形。為革蘭氏陽性菌。它們能將環(huán)境 中的硝酸鹽變成氨和氮。如Pseudo mon asazotge na和perfectomari nus等可能將硝酸鹽還原成游離氮。因此，水中反硝化菌參與了氮的循環(huán)作用，控制著浮游 植物的大量生長鑒定反硝化菌的方法有生化法和分子生物學(xué)法。（一）生化法：1. 革蘭氏染色法：革蘭氏染色陽性細(xì)菌染色結(jié)果為深紫色，革蘭氏染色 陰性細(xì)菌染色結(jié)果為紅色。按操作要求配制結(jié)晶紫

4、混合液，碘液，脫色液，挑 取反硝化菌種進(jìn)行染色后觀察。2鞭毛染色：鏡檢時反硝化菌體為深褐色，鞭毛為褐色。配制好甲乙液， 備好玻片，取接種后 1624小時的菌種染色觀察。3半固體瓊脂穿刺法：根據(jù)有鞭毛的細(xì)菌可以在半固體培養(yǎng)基中游走卻 又不能任意游走的現(xiàn)象，觀察細(xì)菌的生長狀況，判定試驗(yàn)菌是否具有運(yùn)動性。 用直針穿刺接種試驗(yàn)菌于半固體培養(yǎng)基內(nèi)適溫培養(yǎng)。如生長物只生長在穿刺線上，邊緣十分清晰，則表示試驗(yàn)菌無運(yùn)動性；如生長物由穿刺線向四周呈云霧 狀擴(kuò)散，其邊緣呈云霧狀，則表示試驗(yàn)菌有運(yùn)動性。4 甲基紅試驗(yàn)：接種試驗(yàn)菌于指定培養(yǎng)液中，每次兩個重復(fù)，置室溫培 養(yǎng)26天。在培養(yǎng)液中加入一滴甲基紅試劑，紅色為甲

5、基紅試驗(yàn)陽性反應(yīng)，黃 色為陰性反應(yīng)。（因甲基紅變色范圍是 4.4紅至6.0黃）5. V-P測定：取培養(yǎng)液和 40%氫氧化鈉等量相混。加少許肌酸，10min如培養(yǎng)液出現(xiàn)紅色，即為試驗(yàn)菌陽性反應(yīng)，有時需要放置更長時間才出現(xiàn)紅色 反應(yīng)。6 反硝化：配制反硝化培養(yǎng)基，接種反硝化菌種，封管后與不含硝酸鉀 的培養(yǎng)基做對照。培養(yǎng)17天，觀察含有硝酸鉀的培養(yǎng)基中有無生長和是否產(chǎn)生氣泡，如產(chǎn)生氣泡表示有反硝化作用產(chǎn)生氨氣，是陽性反應(yīng)，但如不含硝酸鉀的對照培養(yǎng) 基也產(chǎn)生氣泡表示有反硝化作用產(chǎn)生氣泡，則按陰性反應(yīng)處理，不產(chǎn)則為陽性。7.顯色培養(yǎng)：設(shè)計培養(yǎng)基中含有唯一氮源硝酸鉀和酸堿指示劑溴百里酚， 此指示劑的變色點(diǎn)

6、是 7.6。當(dāng)反硝化菌作用時，ph升高，使最初ph值為7.0的 培養(yǎng)基達(dá)到變色點(diǎn) 7.6,從而使培養(yǎng)基的顏色由綠色變成藍(lán)色，指示硝酸鹽濃 度降低。（二）分子生物學(xué)法現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展及其在各學(xué)科領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，為融合子在分子水平上的鑒定提供了科學(xué)依據(jù)。分子生物學(xué)方法較普通鑒定法更加科學(xué)準(zhǔn)確，也更加令人信服。反硝化的鑒定采用：PCR法和DNA探針法。研究內(nèi)容 擬解決的 主要問題一、研究內(nèi)容1、反硝化菌種的分離培養(yǎng)2、反硝化菌種鑒定。3、反硝化DNA的檢測。4、反硝化菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。5、亞硝化菌種DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。二、擬要解決的問題1、反硝化菌種分離培養(yǎng)方法。2、反

7、硝化菌種DNA的提取與檢測方法。3、反硝化菌DNA的電泳分離及檢測。4、反硝化菌種PCR擴(kuò)增技術(shù)。（2 ）反硝化提DNA的提取。研究方法：一、靈芝原生質(zhì)體的制備與分離將靈芝菌種在PDA培養(yǎng)基中活化?；罨撵`芝菌種在 3%黃豆粉培養(yǎng)基于27 C、120rpm恒溫?fù)u床上培養(yǎng) 4d。過濾收集菌絲球，無菌水沖洗2次宀穩(wěn)滲劑甘露醇沖洗2次t菌絲體轉(zhuǎn)入0.2%巰基乙醇中t搖床30min，溫度28C 過濾收集菌絲體，甘露醇沖洗 t菌絲球l500rpm離心10min，棄上清液取沉淀 t Ig菌絲體以1： 10比例加入復(fù)合酶液（蝸牛酶：纖維素酶：溶壁酶=1% : 1%： 1%）。31 C酶解2.5h T過濾，濾

8、液離心 500rpm , 5min2次，上清液3000rpm離 心10min，沉淀即為原生質(zhì)體 t穩(wěn)滲劑沖洗2次，稀釋后用血球計數(shù)板計數(shù)。二、原生質(zhì)體融合將原生質(zhì)體用穩(wěn)滲劑將濃度調(diào)至107mol/ml，置于無菌帶塞的離心管內(nèi)，以 2000-4000rmp 離心 t 沉淀加入 1ml 50mmol/LCaCI 2 配制的 30%PEG ,28 C 30min t加入數(shù)毫升穩(wěn)滲劑甘露醇，離心 5000rmp棄上清液反復(fù)2次，用0.16 mol /L甘露醇離心洗滌 2次t調(diào)原生質(zhì)體濃度為 107 mol /ml ,取0.1ml涂 于高滲的融合再生培養(yǎng)基及低滲再生培養(yǎng)基中，24 C下培養(yǎng)4d。三、生化

9、檢測1、融合子酯酶同功酶檢測（1）酶液提取。將菌種接入斜面培養(yǎng)基，在 25C下培養(yǎng)7天。取不同菌株的菌絲各 1g, 加入2ml 0.1M TBE （Tris-H 3BO4-EDTA ）浸提液，在4 C下冷卻24h，然后研 磨成勻漿，4000rpm離心20min，取上清液置于冰箱保存?zhèn)溆?。?）電泳及染色。研究方法 技術(shù)路線用垂直板凝膠電泳法。分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為 40%，點(diǎn)樣量75ul，電泳槽緩沖液為 Tris-甘氨酸（pH8.3）,穩(wěn)定電壓300V，電泳3h，用醋 酸-a-萘酯和堅(jiān)牢蘭于 25-30 C下染色20min，清水漂洗數(shù)次，繪圖，然后用薄 層掃描儀在550nm波長下對電

10、泳圖譜進(jìn)行掃描。2、融合子DNA檢測（1） DNA 的提?。–T AB 法）。用滅菌的解剖刀將菌絲體從培養(yǎng)基上刮取0.5g菌絲體，放入事先冷卻的無菌研缽中，加液氮充分研成粉末，轉(zhuǎn)入1.5mL eppendof離心管中。1）加65 C預(yù)熱CTAB高鹽提取液和50卩L1% 3 -巰基乙醇，充分混勻后65 C恒溫3060min，期間顛倒混勻幾次。2）12 000 r/mi n離心 2mi n去沉淀，取上清液 700卩L,轉(zhuǎn)入1.5mL eppe ndof離心管中，冷卻后加入500卩L的飽和酚，輕微倒轉(zhuǎn)離心管數(shù)次后靜置34min，加入300卩L的氯仿/異戊醇（24 : 1）,緩慢倒轉(zhuǎn)離心管使溶液成為乳

11、狀 并靜置34min。3）12 000 r/min離心10min，將上清液再轉(zhuǎn)入另一個離心管中，去蛋白沉淀。移取700卩L上清液，加入300卩L的飽和酚，輕微混勻靜置后再加入500卩L的氯仿/異戊醇（24 ： 1）,在12 000 r/min離心10min。4） 移取750卩L的上清液轉(zhuǎn)入另外一個離心管中，加入等體積的氯仿/異 戊醇（24 : 1）, 12 000 r/ min 離心 10min。5）移取500卩L的上清液，加入 1000卩L的-20 C 預(yù)冷的無水乙醇，于-20 C放置幾分鐘至1h （視量多少而定），用無菌移液槍的槍頭或者是離心方 法取出DNA沉淀，75%乙醇沖洗34次，吸取

12、多余的乙醇，放置在 40C的 電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干68h或過夜或在旋轉(zhuǎn)真空抽干機(jī)中干燥510min ,直到其中的DNA徹底烘干，然后加適量保存緩沖液(TE) , 4C保存待用。(2) DNA瓊脂糖凝膠電泳。1%的瓊脂糖凝膠，0.5 TBE為電泳緩沖液，上樣3卩L 80V電壓下電泳1h檢測DNA樣品純度。技術(shù)路線：取1ml反硝化菌液于1.5ml離心管10000r,離心 1minj棄上清，加1ml 0.9%Nacl10000r，離心 3min棄上清，加450UITE緩沖液,重懸浮，加50ul20%SDS，混勻75 C水浴 5min ,加500ul3:1酚:氯仿，輕輕混勻10000r,離心 5min

13、10000r,離心 5min10000r,離心 5min10000r,離心 5min吸取上清于新1.5ul離心管，補(bǔ)足體積500ul3:1酚:氯仿，輕輕混勻重復(fù)提取，直到看不見中間的蛋白質(zhì)層吸取上清于新1.5ul離心管，補(bǔ)體積到500ul加500ul氯仿，輕輕混勻吸取上清于新1.5ul離心管，加 1/103mol/LNaAc,加等體積異丙醇，上下顛倒吸出上清，加1ml 70%乙醇清洗沉淀10000r,離心 5min去上清，室溫干燥加50ul無菌水溶解沉淀，4C保存(2)反硝化菌DNA電泳瓊脂糖凝膠電泳法：糖膠1.5%,點(diǎn)樣量5ul，電泳槽緩沖液為1 X TAE緩沖液(pH8.0)，穩(wěn)定電壓80

14、V , 電泳1h,檢測DNA樣品純度，然后用薄層掃描儀在 550nm波長下對電泳圖譜 進(jìn)行掃描。2.16SrDNA的PCR擴(kuò)增和測序在硝酸鹽無機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)48小時，挑取單菌落eppendof管中，加入100ml重?zé)A水，旋渦混勻后，沸水浴2min， 12000r/min5min，上清液直接作為DNA摸板用于PCR擴(kuò)增。用于16SrDNA的PCR反應(yīng)的引物為一對通用引物正向引物 BSF8/20 : 5 ' AGAGT TTGATCCTGG CTCAG 3'（Escherichracoli 的 16SrDNA 對應(yīng)位置為 827）;反向引物為 BSR1541/20 : 5&#

15、39; -AAGGAGGTGATCCAG CCGCA - 3 '（ Escherichracoli 的16SrDNA對應(yīng)位置為1541 1522）, PCR反應(yīng)體系（50ul ）為10X Taq聚合酶 緩沖液 5ul，氯化鎂（25mmol） 4ul, DNTP （5mmol ） 3ul，引物 BSF8/20 和 BSR1541/20 各 1ul，模板 DNA2ul , Taq 酶（100094 C 1min , U/L ） 0.5ul，重蒸 水 33.5ul。PCR 程序如下：94 C 預(yù)變性 2min , 55 C 1min , 72 C 1min ;第二步 循環(huán)30次，72C 10

16、min ; 4C放置。PCR產(chǎn)物用QIAgene公司的DNA純化試 劑盒純化。測序由上海申友生物有限責(zé)任公司完成，測序用引物為引物BSF8/20。研究的總 體安排和 進(jìn)度計劃一、總體安排第一學(xué)期：實(shí)驗(yàn)初期準(zhǔn)備兀成開題報告第二學(xué)期：實(shí)驗(yàn)完成論文二、進(jìn)度計劃2010-2011學(xué)年度第二學(xué)期第1-2周：進(jìn)行課題資料搜集、 整理，對實(shí)驗(yàn)可行性進(jìn)行分析，完成開題報告。購買相關(guān)試劑并在食品化學(xué)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)靈芝菌種。第3-6周：制備靈芝原生質(zhì)體，并進(jìn)行原生質(zhì)體融合。第7-12周：靈芝原生質(zhì)體融合子的生化檢測。第13-14周：進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，完成畢業(yè)論文寫作。主要參考 文獻(xiàn)1 曹國民，趙慶祥，龔劍麗，張彤固定化微生物在好氧條件下冋時硝化和反硝化J.環(huán)境工程，2000.10，第18卷第5期.2 呂樂，閆海，杜靜，毛麗娜，周穩(wěn)厭氧氨氧化反應(yīng)器中微生物菌種的篩選及活性研究J.醫(yī)學(xué)動物防制，2009.2，第25卷第2期.3 金贊芳，李文騰，潘志彥，陳英旭，等一株反硝化的分離鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析J.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2006,7 (7): 37-38.4 S