第5章分子發(fā)光

1、121 1、分子熒光和磷光分析、分子熒光和磷光分析 3 圖圖1 單重態(tài)及三單重態(tài)及三重態(tài)激發(fā)示意圖重態(tài)激發(fā)示意圖 T1S1S04圖圖2 2 熒光和磷光體系能級圖熒光和磷光體系能級圖 5 6圖圖2 2 熒光和磷光體系能級圖熒光和磷光體系能級圖 能量以熱的能量以熱的形式發(fā)出形式發(fā)出1010-12-12s s7兩個電子能級振動能級有重疊時兩個電子能級振動能級有重疊時( (相同多重態(tài)間）相同多重態(tài)間）高能級高能級注意：注意：高激發(fā)單重態(tài)的高激發(fā)單重態(tài)的電子，通過內(nèi)轉(zhuǎn)移及振電子，通過內(nèi)轉(zhuǎn)移及振動弛豫，均躍回到第一動弛豫，均躍回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。能級。低能級低能級無輻射躍

2、遷無輻射躍遷8激發(fā)波長激發(fā)波長 1 1 2 2 熒光波長熒光波長 2 2 2 2 1 1 2 2注意：不論電子開始被激發(fā)至什么高注意：不論電子開始被激發(fā)至什么高能級，最終將只發(fā)射出波長為能級，最終將只發(fā)射出波長為2 2的的熒光。熒光。振振動動弛弛豫豫內(nèi)內(nèi)部部轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移輻射輻射1010-9-9 - 10 - 10-7-7s s熒光熒光9T1S1S010 自旋禁阻自旋禁阻 發(fā)光速度很慢發(fā)光速度很慢外光源照射停止后，磷光外光源照射停止后，磷光仍可持續(xù)一短時間仍可持續(xù)一短時間。系間跨躍系間跨躍振動弛豫振動弛豫 輻射輻射磷光波長磷光波長 3 3 3 3 2 2磷光波長比熒光波長長磷光波長比熒光波長長101

3、04 410s10s磷光磷光11 1213 14 激發(fā)光激發(fā)光( (吸收吸收) )發(fā)射光發(fā)射光激發(fā)光譜激發(fā)光譜發(fā)射光譜發(fā)射光譜15 16 17萘的激發(fā)光譜、熒光萘的激發(fā)光譜、熒光和磷光光譜和磷光光譜 18 19 芘的苯溶液的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜芘的苯溶液的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜20 21 22 n n n n或或振動弛豫振動弛豫其他無輻射躍遷其他無輻射躍遷 有機(jī)化合物的熒光有機(jī)化合物的熒光的較大的摩爾較大的摩爾吸光系數(shù)吸光系數(shù)壽命比壽命比n n 短短23 容易實(shí)現(xiàn)容易實(shí)現(xiàn) 激發(fā)的芳香族化合物容易發(fā)生熒光。激發(fā)的芳香族化合物容易發(fā)生熒光。 此外，此外，增加體系的共軛度，熒光效率一般也將增大增加

4、體系的共軛度，熒光效率一般也將增大。 例如，在苯中的熒光效率例如，在苯中的熒光效率 phph（CH=CHCH=CH）2 2 ph 0.28 ph 0.28 ph ph（CH=CHCH=CH）3 3 ph 0.68 ph 0.68 由于增大熒光物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)，有利于由于增大熒光物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)，有利于產(chǎn)生更多的激發(fā)態(tài)分子，從而有利于熒光的發(fā)產(chǎn)生更多的激發(fā)態(tài)分子，從而有利于熒光的發(fā)生。生。24 在在0.1mol0.1molL L-1-1的的NaOHNaOH溶液中，熒光黃溶液中，熒光黃熒光效率達(dá)熒光效率達(dá)0.920.92，而酚酞卻沒有熒光。，而酚酞卻沒有熒光。 又如芴與聯(lián)二苯又如芴與聯(lián)二苯(

5、(左圖所示左圖所示) )，由于，由于芴中的亞甲基使分子的剛性平面增加，芴中的亞甲基使分子的剛性平面增加，導(dǎo)致兩者在熒光性質(zhì)上的顯著差別，前導(dǎo)致兩者在熒光性質(zhì)上的顯著差別，前者熒光產(chǎn)率接近于者熒光產(chǎn)率接近于1 1，后者僅為，后者僅為0.180.18。 萘與維生素萘與維生素A A都具有都具有5 5個共軛個共軛鍵鍵( (左左圖所示圖所示) )，而前者為平面結(jié)構(gòu)，后者為非，而前者為平面結(jié)構(gòu)，后者為非剛性結(jié)構(gòu)，因而前者的熒光強(qiáng)度為后者剛性結(jié)構(gòu)，因而前者的熒光強(qiáng)度為后者的的5 5倍。倍。 = 0.92 0 1 = 0.182526 27 。28 當(dāng)入射光強(qiáng)度當(dāng)入射光強(qiáng)度I0 和和l一定時：一定時： 注意：

6、注意：當(dāng)當(dāng) l c 0.050.05時才成立時才成立29 溫度對熒光強(qiáng)度的影響溫度對熒光強(qiáng)度的影響 30 例：例： GaGa3+3+與與2 2，2-2-二羥基偶氮苯二羥基偶氮苯 pH3-4pH3-4 生成生成1 1：1 1的配合物，的配合物，發(fā)射熒光發(fā)射熒光 pH6-7pH6-7 生成生成1 1：2 2的配合物，的配合物，不發(fā)射熒光不發(fā)射熒光。 31 溶液中若存在能吸收激發(fā)或熒光物質(zhì)所發(fā)射溶液中若存在能吸收激發(fā)或熒光物質(zhì)所發(fā)射光能的物質(zhì)，就會使熒光減弱，這種現(xiàn)象稱為光能的物質(zhì)，就會使熒光減弱，這種現(xiàn)象稱為“內(nèi)濾光作用內(nèi)濾光作用”。 熒光物質(zhì)的熒光發(fā)射光的短波長的一端與該熒光物質(zhì)的熒光發(fā)射光的短

7、波長的一端與該物質(zhì)的吸收光譜的長波長一端有重疊物質(zhì)的吸收光譜的長波長一端有重疊。 在溶液濃度較大時，一部分熒光發(fā)射被自身在溶液濃度較大時，一部分熒光發(fā)射被自身吸收，產(chǎn)生吸收，產(chǎn)生“自吸收自吸收”現(xiàn)象而降低了溶液的熒光現(xiàn)象而降低了溶液的熒光強(qiáng)度。強(qiáng)度。32 熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象稱為作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象稱為熒光猝滅熒光猝滅。 能引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱為能引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱為猝滅劑猝滅劑。 33 34 35 原因：原因：36 熒光分析法的光譜比較簡單，特征性強(qiáng)，而且熒光分析法的光譜比較簡單，特征性

8、強(qiáng)，而且有激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，選擇的余地大。有激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，選擇的余地大。 激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、熒光強(qiáng)度、熒光效率、激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、熒光強(qiáng)度、熒光效率、熒光壽命等多種物理參數(shù)。熒光壽命等多種物理參數(shù)。 37 校準(zhǔn)曲線法校準(zhǔn)曲線法 比較法比較法 無機(jī)化合物的分析無機(jī)化合物的分析 直接熒光法直接熒光法 待測元素與有機(jī)試劑所組成的能發(fā)熒光的配合待測元素與有機(jī)試劑所組成的能發(fā)熒光的配合物，通過檢測配合物的熒光強(qiáng)度以測定該元素的含量。這種方物，通過檢測配合物的熒光強(qiáng)度以測定該元素的含量。這種方法稱為直接熒光法。法稱為直接熒光法。 現(xiàn)在可以利用有機(jī)試劑以進(jìn)行熒光分析的元素已達(dá)現(xiàn)在可以利用有機(jī)試劑

9、以進(jìn)行熒光分析的元素已達(dá)到到7070多種。較常用有機(jī)試劑進(jìn)行熒光法測定的元素為多種。較常用有機(jī)試劑進(jìn)行熒光法測定的元素為鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、鋅、鎘及某些稀土元素等。鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、鋅、鎘及某些稀土元素等。38 熒光猝滅法熒光猝滅法 某些元素可以從其他會發(fā)熒光的金屬離子某些元素可以從其他會發(fā)熒光的金屬離子-有機(jī)試劑配合物中取代金屬離子或有機(jī)試劑，組成更穩(wěn)定的不發(fā)有機(jī)試劑配合物中取代金屬離子或有機(jī)試劑，組成更穩(wěn)定的不發(fā)熒光配合物或難溶化合物，而導(dǎo)致溶液熒光強(qiáng)度的降低，由熒光熒光配合物或難溶化合物，而導(dǎo)致溶液熒光強(qiáng)度的降低，由熒光強(qiáng)度降低的強(qiáng)度來測定該元素的含量，這種方法稱為熒光猝滅法。

10、強(qiáng)度降低的強(qiáng)度來測定該元素的含量，這種方法稱為熒光猝滅法。 間接熒光法間接熒光法 間接熒光法常用于某些陰離子如間接熒光法常用于某些陰離子如F F- -、CNCN- -等的等的分析，它們可以從某些不發(fā)熒光的金屬有機(jī)配合物中奪取金屬離分析，它們可以從某些不發(fā)熒光的金屬有機(jī)配合物中奪取金屬離子，而釋放出能發(fā)熒光的配位體，從而測定這些陰離子的含量。子，而釋放出能發(fā)熒光的配位體，從而測定這些陰離子的含量。 催化熒光法催化熒光法 某些反應(yīng)的產(chǎn)物雖能發(fā)生熒光，但反應(yīng)速某些反應(yīng)的產(chǎn)物雖能發(fā)生熒光，但反應(yīng)速度很慢，熒光微弱，難以測定。度很慢，熒光微弱，難以測定。 若在某些金屬離子的催化作用下，反應(yīng)將加速進(jìn)行，利

11、用這若在某些金屬離子的催化作用下，反應(yīng)將加速進(jìn)行，利用這種催化動力學(xué)的性質(zhì)，可以測定金屬離子的含量。種催化動力學(xué)的性質(zhì)，可以測定金屬離子的含量。 銅、鈹、鐵、鈷、鋨、銀、金、鋅、鉛、鈦、釩、錳、過氧銅、鈹、鐵、鈷、鋨、銀、金、鋅、鉛、鈦、釩、錳、過氧化氫及氰離子等都曾采用這種方法測定。化氫及氰離子等都曾采用這種方法測定。39 有機(jī)化合物的分析有機(jī)化合物的分析 芳香族化合物具有共軛的不飽和結(jié)構(gòu)，多能發(fā)射芳香族化合物具有共軛的不飽和結(jié)構(gòu)，多能發(fā)射熒光，可以直接進(jìn)行熒光測定。熒光，可以直接進(jìn)行熒光測定。 如如維生素、氨基酸和蛋白質(zhì)、胺類和甾族化合物、酶和輔酶以及各維生素、氨基酸和蛋白質(zhì)、胺類和甾族化

12、合物、酶和輔酶以及各種藥物、毒物和農(nóng)藥等，這些復(fù)雜化合物許多均能發(fā)射熒光，種藥物、毒物和農(nóng)藥等，這些復(fù)雜化合物許多均能發(fā)射熒光， 40抗體抗體( (或抗原或抗原) ) 熒光抗體（或抗原）熒光抗體（或抗原） 熒光素?zé)晒馑?相應(yīng)抗原（或抗體）相應(yīng)抗原（或抗體） 復(fù)合物復(fù)合物 41 42 在在20082008年年1010月月8 8日日, ,諾貝爾化學(xué)獎，綠色熒光蛋白諾貝爾化學(xué)獎，綠色熒光蛋白成了主角。諾貝爾委員會將化學(xué)獎授予美籍日裔科成了主角。諾貝爾委員會將化學(xué)獎授予美籍日裔科學(xué)家學(xué)家下村修下村修、美國科學(xué)家、美國科學(xué)家馬丁馬丁沙爾菲沙爾菲 和美籍華裔科和美籍華裔科學(xué)家學(xué)家錢永健錢永健 三人，以表彰

13、他們發(fā)現(xiàn)和發(fā)展了綠色熒三人，以表彰他們發(fā)現(xiàn)和發(fā)展了綠色熒光蛋白質(zhì)技術(shù)。光蛋白質(zhì)技術(shù)。 43什么是綠色熒光蛋白什么是綠色熒光蛋白 綠色熒光蛋白分子的形狀呈圓柱形，就像一個綠色熒光蛋白分子的形狀呈圓柱形，就像一個桶，當(dāng)它受到藍(lán)光照射時，會吸收藍(lán)光的部分能量，桶，當(dāng)它受到藍(lán)光照射時，會吸收藍(lán)光的部分能量，然后發(fā)射出綠色的熒光。然后發(fā)射出綠色的熒光。 利用這一性質(zhì)，生物學(xué)家們可以用綠色熒光蛋利用這一性質(zhì)，生物學(xué)家們可以用綠色熒光蛋白來標(biāo)記幾乎任何生物分子或細(xì)胞，然后在藍(lán)光照白來標(biāo)記幾乎任何生物分子或細(xì)胞，然后在藍(lán)光照射下進(jìn)行顯微鏡觀察。原本黑暗或透明的視場馬上射下進(jìn)行顯微鏡觀察。原本黑暗或透明的視場馬

14、上變得星光點(diǎn)點(diǎn)變得星光點(diǎn)點(diǎn)那是被標(biāo)記了的活動目標(biāo)。對生那是被標(biāo)記了的活動目標(biāo)。對生物活體樣本的實(shí)時觀察，在綠色熒光蛋白被發(fā)現(xiàn)和物活體樣本的實(shí)時觀察，在綠色熒光蛋白被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用以前，是根本不可想象的。應(yīng)用以前，是根本不可想象的。 這種徹底改變了生物學(xué)研究的蛋白質(zhì)，最初是這種徹底改變了生物學(xué)研究的蛋白質(zhì)，最初是從一種廣泛生活于太平洋海域的發(fā)光水母體內(nèi)分離從一種廣泛生活于太平洋海域的發(fā)光水母體內(nèi)分離得到的。得到的。 44 45 通常應(yīng)在低溫下測量磷光！通常應(yīng)在低溫下測量磷光！46 液氮是最常用的合適的液氮是最常用的合適的冷卻劑。冷卻劑。 對溶劑要求對溶劑要求: : 在液氮溫度（在液氮溫度（77K77

15、K）下）下應(yīng)具有足夠的粘度并能形應(yīng)具有足夠的粘度并能形成透明的剛性玻璃體，對成透明的剛性玻璃體，對所分析的試樣應(yīng)具有良好所分析的試樣應(yīng)具有良好的溶解特性的溶解特性 溶劑應(yīng)易于提純?nèi)軇?yīng)易于提純，以除溶劑應(yīng)在所研究的光溶劑應(yīng)在所研究的光譜區(qū)域內(nèi)沒有很強(qiáng)的吸收譜區(qū)域內(nèi)沒有很強(qiáng)的吸收和發(fā)射和發(fā)射47 48 49膠束增穩(wěn)的溶液室溫磷光法（膠束增穩(wěn)的溶液室溫磷光法（MS-RTPMS-RTP） 50 敏化磷光躍遷示意圖敏化磷光躍遷示意圖 51 在熒光分光光度計上配上磷光配件后，即可用于磷光測在熒光分光光度計上配上磷光配件后，即可用于磷光測定。如將樣品放在盛有液氮的石英杜瓦瓶內(nèi)，即可用于低定。如將樣品放在盛

16、有液氮的石英杜瓦瓶內(nèi)，即可用于低溫磷光測定。溫磷光測定。 磷光分析主要用于測定有機(jī)化合物，如石油產(chǎn)品、多環(huán)磷光分析主要用于測定有機(jī)化合物，如石油產(chǎn)品、多環(huán)芳烴、農(nóng)藥、藥物等方面。（教材列出了一些有機(jī)化合物芳烴、農(nóng)藥、藥物等方面。（教材列出了一些有機(jī)化合物的磷光分析實(shí)例）的磷光分析實(shí)例）522 2、化學(xué)發(fā)光分析、化學(xué)發(fā)光分析 53 54 I Iclcl （t t）= = clcl dc/dt dc/dt I Iclcl化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的速率化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的速率55 A + B C* + D C* C + h 56 A + B C* + D C*+ F F* + E F* F + h 例如：例如：熒光棒發(fā)光機(jī)理熒光棒發(fā)光機(jī)理苯基草酸酯苯基草酸酯 H H2 2O O2 2酚酚中間物中間物*中間物中間物*染料染料染料染料*中間物中間物染料染料*染料染料h 57、58 59 60 化學(xué)發(fā)光測試儀原理方框圖化學(xué)發(fā)光測試儀原理方框圖 6162 化學(xué)發(fā)光分析最大的特點(diǎn)是靈敏度高，對氣體和化學(xué)發(fā)光分析最大的特點(diǎn)是靈敏度高，對氣體和痕量金屬離子的檢出限都可達(dá)痕量金屬離子的檢出限都可達(dá)ngngmLmL1 1級。級。 在環(huán)境監(jiān)測、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)在環(huán)境監(jiān)測、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)研究中，化學(xué)發(fā)光分析也是一種重要的手段。研究中，化學(xué)發(fā)光分析也是一種重要的手段。 6