第3章基因組學物理圖繪制2

1、第三章第三章 物理作圖物理作圖(physical mapping)物理作圖物理作圖: 應(yīng)用分子生物學技術(shù)直接將應(yīng)用分子生物學技術(shù)直接將DNA分子標記、分子標記、基因或克隆標定在基因組的實際位置基因或克隆標定在基因組的實際位置物理圖的距離物理圖的距離: 依作圖方法而異依作圖方法而異,輻射雜種作圖的計算單位為輻射雜種作圖的計算單位為厘鐳厘鐳(cR);限制性片段作圖與克隆作圖的圖距單位限制性片段作圖與克隆作圖的圖距單位為為堿基對堿基對(bp)物理作圖的方法物理作圖的方法 o 限制酶作圖限制酶作圖(Restriction Mapping)(Restriction Mapping)o 依靠克隆的基因組作

2、圖依靠克隆的基因組作圖(clone-based mapping)(clone-based mapping)o 熒光原位雜交熒光原位雜交(Fish, Fluorescent in situ (Fish, Fluorescent in situ hybridization)hybridization)o 序列標簽位點作圖序列標簽位點作圖 (STS(STS，Sequence tagedSequence taged site) site)1.1 限制酶作圖限制酶作圖(Restriction Mapping)基本原理基本原理1Kb EcoR I待檢的待檢的DNABamHI15Kb6Kb5Kb10Kb9K

3、bEBBH H EH H H H E+BEB6KbEH 4KbEB 5KbBH 瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳用于小片段用于小片段DNADNA的分析，的分析，精度非常高精度非常高聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳垂直交變電場 ,兩個電場方向成為直角 一般的凝膠電泳30Kb 以下，脈沖凝膠是提高了2個數(shù)量級，達到 10Mb DNA 片段 50Kb 4的n次方，n是限制酶識別的堿基數(shù)凝膠濃度、電場強度、緩沖液凝膠濃度、電場強度、緩沖液YAC: YAC: 酵母人工染色體酵母人工染色體 230-1700Kb 1984230-1700Kb 19842. 基于克隆的基因組作圖基于克隆的基因組作圖自主復(fù)制起始點自主

4、復(fù)制起始點端粒端粒標記基因標記基因標記基因標記基因著絲粒著絲粒大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制起始點大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制起始點質(zhì)粒擴增篩選標記質(zhì)粒擴增篩選標記2.1 大片段大片段DNA的克隆載體的克隆載體克隆位點克隆位點缺點缺點v插入子不穩(wěn)定插入子不穩(wěn)定v交換效應(yīng)交換效應(yīng)vGC區(qū)克隆效率低區(qū)克隆效率低 標準的標準的YAC操作程序克隆的操作程序克隆的DNA平均為平均為600kb，改進，改進的程序可獲得的程序可獲得1400kb BAC: BAC: 細菌人工染色體細菌人工染色體 300Kb 1992300Kb 1992與一般質(zhì)粒有與一般質(zhì)粒有2點不同點不同:單拷貝復(fù)制單拷貝復(fù)制(不會發(fā)生不會發(fā)生重組嵌合重組嵌合)相對分

5、子量大相對分子量大(具有較具有較大容量大容量)介導介導F因子因子單向復(fù)制單向復(fù)制維持低水平維持低水平質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)?？截悢?shù)Southern印跡法印跡法DNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上與放射性標記與放射性標記DNA探針雜交探針雜交放射自顯影放射自顯影帶有帶有DNA片片段的凝膠段的凝膠凝膠凝膠濾膜濾膜用緩沖液用緩沖液轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移DNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜3. 熒光原位雜交熒光原位雜交(Fish, Fluorescent in situ hybridization) 將探針用熒光標記，與細胞分裂中期的染色體雜交

6、，用將探針用熒光標記，與細胞分裂中期的染色體雜交，用熒光顯微鏡觀察信號所處的位置，將探針標定在連鎖圖上。熒光顯微鏡觀察信號所處的位置，將探針標定在連鎖圖上。 4. 序列標簽位點作圖序列標簽位點作圖 (STS, Sequence Taged Site)長度長度: 100-500 bp序列已知序列已知, 可以設(shè)計可以設(shè)計PCR反應(yīng)反應(yīng)單拷貝單拷貝, 在染色體上的位置是唯一的在染色體上的位置是唯一的EST(Expressed sequence tag) 大部分可以作大部分可以作STSESTESTESTEST是一個是一個cDNAcDNA克隆快速大規(guī)模測序后所獲得的克隆快速大規(guī)模測序后所獲得的33端和端和55端部分端部分cDNAcDNA隨機片段，每個隨機片段，每個ESTEST長度約長度約200200600bp,600bp,代表了一個單拷貝基因的部分代表了一個單拷貝基因的部分cDNAcDNA表達序列。表達序列。不能合成胸苷激酶(TK)或次黃嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶(HP