實(shí)驗(yàn)室文章li3ppqq博士

1、復(fù)旦大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)博士研究生畢業(yè)論文吡咯喹啉醌三鋰干預(yù)阿爾茨海默病的實(shí)驗(yàn)研究Beneficial effectsof trilithiumpyrroloquinoline quinoneinon behaviorsand pathologyina mouse model ofAlzheimerS disease系(部)醫(yī)院：博士生姓名： 學(xué)科專業(yè)：中山醫(yī)院趙蕾神經(jīng)病學(xué)導(dǎo)師：鐘春玖教授徐天樂研究員導(dǎo)師組成員：萬方數(shù)據(jù)|JIII I I I II III Il UlII II JIfY2701 787目錄本文縮略一一一一一一一一一一一1 中文摘要一一一一一一一一一3 英文摘要一一一一一一一一6 弓l

2、言一一一一一9第一部分：吡咯喹啉醌三鋰的合成、急性毒性研究及血液、生化指標(biāo)檢測嘀刖百吾言一一一一一一一一一一 3第一章吡咯喹啉醌三鋰急性毒性研究一一一16 材料和方法一一一一16結(jié)果一一一一一一一一一一一1 8、坌占一一一一一一22第二章慢性口服Li3PQQ后APPPSl轉(zhuǎn)基因小鼠的血液及生化指標(biāo)檢鋇4一一一一一22 材料和方法- 一一22 結(jié)果一J、結(jié)一一討t侖一一一一一一一一一一一27第二部分：吡咯喹啉醌三鋰的藥效及改善認(rèn)知功能研究剛吾材料矛口方法一一一一一一一3 1 坌占果一一一一39 t寸t臺一-一一-一一一一一48第三部分：吡咯喹啉醌三鋰減輕APPPSl小鼠病理損害的實(shí)驗(yàn)研究日1一j

3、LU舌一一5l材料和方法一一一5 1 結(jié)果一一一一62 討古臺一一一一67第四部分：吡咯喹啉醌三鋰防治阿爾茨海默病的作用機(jī)制研究月U菁一一一68 材料和方法一一一一一一68 結(jié)果一一一一-一一一一一一72 討古臺一一一一一一76 j三文J、坌吉一一801LL萬方數(shù)據(jù)參考文獻(xiàn)一綜述-89綜述參考文獻(xiàn)一一一一一一101發(fā)表文章目錄-_-一一一致謝-i08萬方數(shù)據(jù)復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)燮一-_-_-_一本文縮略詞p淀粉樣多肽A1313-amyloid peptideAp結(jié)合乙醇脫氫酶A13-binding alcohol dehydrogenaseABAD親和素生物素過氧化avidin biotin per

4、oxidase complexABC物酶復(fù)合物人工腦脊液artificial cerebrospinalfluidACSF阿爾茨海默病ADAlzheimerS diseases(絲氨酸蘇氨酸)蛋白kinase BAKTPKBprotein激酶B13淀粉樣蛋白前體蛋白APPamyloid 13-proteinprecursor3，3二氨基聯(lián)苯胺四DAB3,3一diaminobenzidinetetrahydrochloride鹽酸鹽多奈哌齊糖原合成酶激酶3DNPdonepezilGSK3glycogen synthase kinase-3enzyme-linked immunosorbent a

5、ssay酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)興奮性突觸后電位ELISAfEPSPsfield excitatory postsynaptic potentials谷氨酸Gluglutamate免疫組織化學(xué)染色高效液相色譜法IHCimmunohistochemicalstainingHPLChigh Performance LiquidChromato-graphyLCMS液相色譜質(zhì)譜法liquid Chromatography-Mass Spectrometrytri-lithium pyrroloquinoline吡咯喹啉醌三鋰Li3PQQquinonein氯化鋰LiCl1ithium chloridemedi

6、an lethal doseLD50半數(shù)致死量長時(shí)程增強(qiáng)LTPlong-term potentiationMMTmemantine美金剛N甲基一D天冬氨酸NMDAN··methyl·-D-aspartatePBSphosphate-buffered saline磷酸鹽緩沖液聚合酶鏈反應(yīng)PCRpolymerase chain reaction1萬方數(shù)據(jù)復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文多聚甲醛早老素1PFAparaformaldehydePSlpresenilin-1早老素2PS2presenilin一2磷酸化tau蛋白phosphorylated tauPtau十二烷基磺酸鈉一

7、聚丙烯酰胺凝膠電泳0節(jié)律刺激蛋白印跡sodium dodeeyl sulfateSDSPAGEpolyacrylamide gel electrophoresisthem-burst stimulateTBSWBwestem blot2萬方數(shù)據(jù)復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文吡咯喹啉醌三鋰干預(yù)阿爾茨海默病的實(shí)驗(yàn)研究中文摘要阿爾茨海默病(AlzheimerS disease，AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病， 臨床上以進(jìn)行性的認(rèn)知功能損害和特征性的病理學(xué)改變?yōu)橹饕卣?。迄今為止?仍然缺乏有效的防治阿爾茨海默病的藥物和治療手段，目前臨床使用的腦內(nèi)膽堿酯酶抑制劑(如石杉堿甲和多奈哌齊等)和非競爭性NMDA受

8、體拮抗劑(美金 剛)并不能阻止AD病情的進(jìn)展；被認(rèn)為最有前景的p淀粉樣蛋白(13-amyloid， AD)疫苗治療也被證明不能抑制癡呆癥狀和病情的進(jìn)展，盡管它確實(shí)有清除腦內(nèi)AB沉積和老年斑的作用，近年來，基于Ap假說研究的諸多新藥臨床試驗(yàn)相繼失敗促使我們反思目前的AD治療研究策略，尋找低毒、多作用靶點(diǎn)的新藥或“雞尾酒療法"成為AD防治研究中的熱點(diǎn)。糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase一3，GSK-3)是一種多功能的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，是參與糖代謝的主要限速酶之一。GSK3在腦中高表達(dá)， 除了參與糖代謝外，還與很多生理病理學(xué)過程相關(guān)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，G

9、SK一3也是參與AD發(fā)病過程的重要因素，AD患者腦內(nèi)GSK3活性顯著增高，GSK-3 信號通路能通過雙通道作用機(jī)制同時(shí)調(diào)控AD產(chǎn)生和Tau蛋白磷酸化而受到AD 研究學(xué)者的廣泛重視。因此，通過調(diào)制GSK3信號通路功能防治AD被賦予極高的期望。然而，包括氯化鋰等在內(nèi)的、目前已知的GSK3抑制劑由于毒性過 大而限制了其臨床應(yīng)用。鋰鹽作為第一個(gè)被證明的GSK3抑制劑雖然用于臨床 治療雙相精神障礙已經(jīng)超過50年，但由于極窄的治療窗和對老年人群過大的副 作用而難以用于AD的臨床治療。因而，尋找低毒性的GSK一3抑制劑也成為AD 研究熱點(diǎn)之一。吡咯喹啉醌三鋰(trilithium pyrroloquinol

10、ine quinonein，Li3PQQ，分子式： C14H3N208Li，分子量：348)是我們自己合成的、具有自主知識產(chǎn)權(quán)的小分子 有機(jī)鋰鹽。鋰鹽作為GSK3抑制劑已經(jīng)證明顯著抑制AB沉積和Tau蛋白磷酸化、減少它們在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外的沉積和改善胰島素抵抗與糖代謝紊亂的作用。吡咯喹啉醌作為新近發(fā)現(xiàn)的B族維生素，被證明具有顯著促進(jìn)細(xì)胞線粒體增生和功能、拮抗氧化損傷、減少A13集聚和毒性等多種作用。因而，Li3PQQ兼具改善線粒體功能、抗氧化損傷和抑制GSK3介導(dǎo)的tau蛋白磷酸化與AB形成、抑制神經(jīng)變性性病理損害發(fā)生等作用，是有效的多靶點(diǎn)防治AD候選藥物之一。這里，我 們采用昆明鼠進(jìn)行急性毒性試

11、驗(yàn)，研究Li3PQQ的毒性作用；利用APPPSl雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究Li3PQQ的藥理藥效以及作用機(jī)制。萬方數(shù)據(jù)復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文論文的第一部分研究Li3PQQ急性毒性試驗(yàn)及對血液學(xué)相關(guān)指標(biāo)的影響： 通過觀察昆明鼠口服受試物L(fēng)i3PQQ后的中毒反應(yīng)及死亡情況，用于初步評價(jià)受 試物安全性，并為后續(xù)試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)提供參考依據(jù)。挑選健康昆明小鼠，采用上下法，根據(jù)在AOT425StatPgm 10中設(shè)定的給藥劑量給藥，同時(shí)設(shè)陽性對照氯化鋰(1ithiumchloride，LiCl)組。Li3PQQ按790mgkg、2500mgkg給藥后1 015min觀察到部分小鼠活動(dòng)減少，約20min-lh后恢復(fù)

12、；5000mgkg給藥后1 0min左右觀察到活動(dòng)減少和閉眼，部分動(dòng)物約2小時(shí)后恢復(fù)，部分動(dòng)物在給藥后死亡，死亡發(fā)生在48小時(shí)以內(nèi)。LiCl370mgkg，1160mgkg給藥后無明顯異常，5000mgkg組全部死亡，死亡發(fā)生在給藥后2-20小時(shí)內(nèi)，Li3PQQ組雄性(->2500rngkg)及雌性(5000mgkg)與較低劑量組(790mgkg)相比體重增長緩慢。本次試驗(yàn)測得Li3PQQ的半數(shù)致死量(Mediandose，LD50)為雄lethal性>5000mgkg，雌性5000mgkg(95可信區(qū)間為3308 mgkg-5400 mgkg)。陽性對照品LiCI的LD50為25

13、12mgkg(95可信區(qū)間為1160 mgkg-5000 mgkg)。8周的APPPSl雙轉(zhuǎn)基因小鼠的血常通過檢測給予Li3PQQ 15、3、6mgkg規(guī)及生化指標(biāo)，來評價(jià)Li3PQQ的毒性作用。20周齡的APPPSl雙轉(zhuǎn)基因及同 窩野生型對照小鼠分別給予Li3PQQ 15、3、6mgkg，安理申(donepezil，DNP) 15mgkg，美金剛(memantine，MMT)3mgkg，野生型溶劑(WT，vehicle)組， 轉(zhuǎn)基因溶劑(TG，vehicle)組。給藥8周后取血檢測血常規(guī)，肝腎功，血糖，血 甘油三酯，膽固醇等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)Li3PQQ三個(gè)劑量組均不影響APPPSl雙轉(zhuǎn)基因 小鼠的

14、血常規(guī)及生化指標(biāo)，為證實(shí)其毒性及副作用小又提供了一個(gè)有力的證據(jù)。論文的第二部分研究Li3PQQ的藥效作用、改善認(rèn)知功能研究及突觸可塑性研究。以不同年齡(20周齡、40周齡)的APPPSl雙轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對象， 采取灌胃的給藥方式，分別給予Li3PQQ 15mgkg、3mgkg、6mgkg、12mgkg， 陽性對照藥安理申(donepezil，DNP)15mgkg，鋰鹽對照藥LiCl 5mgkg、l OOmgkg，吡咯喹啉醌對照組Na3PQQ 14mgkg，野生型溶劑(WT，vehicle)組，轉(zhuǎn)基因溶劑(TG，vehicle)組。給藥8周后，進(jìn)行Morris水迷宮行為學(xué)試驗(yàn)，研究Li3PQQ

15、不同劑量組空間學(xué)習(xí)記憶功能的變化；同時(shí)研究APPPSl小鼠海馬CAl區(qū)0節(jié)律刺激(Theta-burststimulate，TBS)誘導(dǎo)的長時(shí)程增強(qiáng)的變化，進(jìn)行突觸可塑性研究。研究證實(shí)：Li3PQQ 3mgkg，6mgkg口服給藥8周均能改善El服20周齡APPPSl雙轉(zhuǎn)基因小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶損害，同時(shí)Li3PQQ 12mgkg給藥8周均能改善20周齡、40周齡APPPSl雙轉(zhuǎn)基因小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶損害及海馬CAl區(qū)的長時(shí)期增強(qiáng)，增強(qiáng)其突觸可塑性。本論文的第三部分及第四部分研究Li3PQQ給藥后APPPS 1小鼠的病理學(xué)表現(xiàn)及作用機(jī)制。采用免疫組織化學(xué)染色檢測AD的兩大病理指標(biāo)：淀粉樣斑塊和4

16、萬方數(shù)據(jù)復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文神經(jīng)原纖維纏結(jié)，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測皮層的ABl42含量，免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測皮層的磷酸化tau蛋白含量；同時(shí)通過免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)和酶活試劑盒檢測GSK3，GSK3Q，GSK3p，13淀粉樣結(jié)合乙醇脫氫酶(913bindingalcoholdehydrogenase，ABAD)的表達(dá)量及活性，探討相關(guān)作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)Li3PQQ 3、6、12mgkg均能夠減少APPPSl雙轉(zhuǎn)基因小鼠皮層淀粉樣斑塊的數(shù)目、面積及磷酸化tau蛋白的表達(dá)量，而這一作用是通過抑制GSK-3，GSK30r，GSK一3p 的活性及增強(qiáng)ABAD的活性來實(shí)現(xiàn)的。本文通過急性毒性試驗(yàn)及血液生化指標(biāo)

17、檢測證實(shí)Li3PQQ是低毒的有機(jī)小分 子鋰鹽，同時(shí)又利用不同年齡段的APPPSl雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究其藥理藥效 和相關(guān)的作用機(jī)制，從而證實(shí)吡咯喹啉醌三鋰是低毒、高效的多靶點(diǎn)治療AD的候選分子，有可能給AD病程修飾治療帶來突破性影響，產(chǎn)生巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。關(guān)鍵詞：阿爾茨海默病；吡咯喹啉醌；鋰鹽；糖合酶激酶3；13淀粉樣結(jié)合乙醇脫氫酶；中圖分類號：R741萬方數(shù)據(jù)effects of trMithium pyrroloquinolineBeneficialquinoneinonand pathology ina mouse model of Alzheimersbehaviorsdisease

18、Abstracta devastating disease characterizedAlzheimerSdisease(AD)isby pathologicalwell asinthe brain：amyloid plaques，neurofibrillarytangles，asalterationssynapse-and neuron10ssUnfortunately,efficient disease-modifying therapies are unavailablesupported by numerous experimentalandBecause the13-amyloid(

19、AS)hypothesisison the clearance ofclinical studies。current treatmentstrategies for AD have focusedall the clinical trialseliminating ADatplaquesHowever,almostamyloidtargetedfunctionThis frustrating situation hasdeposit havedone little toimprove cognitivepromoted US to reconsider therapeutic strategi

20、eslithiumthisa neworganicsalt，trilithiumInstudy,we synthesizedpyrroloquinoline quinonein(Li3PQQ)Lithiumis the first discovered and the mostthe inhibitor ofsynthase kinase-3(GSK-3)in multipleextensivelytestedglycogenanimal modelsGSK3 has beendemonstrated to be involved inAD pathogenesis bymodulating

21、tau phosphorylation and AS productionPyrroloquinolinequinone(PQQ)serves tois a newly identified redox-cofactor vitaminfor mammals，whichonlynotin the mitochondrialalsomediate redox reactionschain，butrespiratoryplaysaoxygen species and attenuatingpotential rolein scavenging reactiveoxidativestressin m

22、itochondriaAsa cofactor of Ap-binding alcohol dehydrogenase(ABAD)，PQQmitochondriafrom oxidativeinnoveldamageADTherefore，thismight protectchemicalincould exhibitbeneficial effectsADLi3PQQpowerfulhaltingmechanismsneurodegenerative progression by targeting multiple ADcausingmiceevaluation inIn the firs

23、tconductedKumingbyasafetypart，wemedian lethaltoxicity of Li3PQQThedoses(LD50)weretheacutedetermining509kg for males，which arefor femalesand overshown tobe509kg body weightsignificantly higher than those oflithium chloride(LiCl，259kg body weight)Li3PQQlearning andtested the effect of chronic treatmen

24、tofonSecondly,wememoryThe drug(15，3，6 and12mgkg body weight)was gastrically gavaged dailyweeks)，a mouse model of AD and 1 2mgkgfor 8 weeks to the APPPS 1mice(20286萬方數(shù)據(jù)weeks to the APPPS 1mice(40-48for 8was gastrically gavaged dailybody weightweeks)for 5four trials perIn tlle Morris water maze test，m

25、icewere traineddaysdayand then tested on the sixth dayWe showed that mice administered withLi3PQQ(3，6thantransgenic(TG)andsignificantlybetter1 2mgkg body weight)performedin the Morris water maze learning and memory testvehicle controlsandsynaptic mechanisms underlying the enhancedlearningTo further

26、study thethe APPPS 1recorded fieldexcitatory postsynaptictransgenic mice，wememoryinslicesBoth LiCI(100mgkgarea of hippocampalpotentials(fEPSPs)from theCAlincreased theLi3PQQ(1 2mgkg bodyweight)significantlybodyweight)andmagnitude of TBSinduced LTP,indicating that both drugs facilitate the hippocampa

27、lsynaptic plasticity ofAPPPSl transgenic micethe numbers andimmunochemicalin corticalstainingslices，weanalyzedBytreatmentWemice after theareain APPPS 1transgenicof amyloid plaquesdrugfound that chronic treatmentboth the number ofof Li3PQQ significantlyreducedimmunosorbentand area ofenzyme-linkedamyl

28、oid plaquesByamyloid plaquesthe concentration of Ap l-42，which is known as theassay(ELSIA)in codex，we testedconcentration ofharmfulmostreduced theamyloid proteinLi3PQQsignificantlyreduced the number of theApl-42Furthermore，Li3PQQ(6，12 mgkg)significantlyimmunochemicalcells，as shown byin corticalphosp

29、horylated taupositivestainingslicesBy western blotting，we found that the phosphorylation oftau in serine 396 wasof LiCl andreducedin theLi3PQQbutnot intheofgroupsignificantlygroupdonepezilTo confirm thatat ABAD andtheindeedLi3PQQtestedGSK-3，wetargetsexpression and activities of these enzymes in the

30、codexof the APPPS 1 mice after thetreatmentWe showed thatwas effectivethechronicLi3PQQinmodulatingdrugand ABAD in vivoLi3PQQ at 6mgkg and 1 2mgkgdid not affectactivities of GSK·3theofitincreased theenzymatic activityoflevelABAD，butdose-dependentlydid nottheABADBy contrast，while Li3PQQchangeof G

31、SK-3 in theexpressioncodex of theAPPPS 1increased the ratio ofmice，itdose-dependentlyandphospho-GSK-3a(Ser2 1)GSK一3aphosphoGSK-3p(Ser9)GSK一3pIncreasedGSK一3 a(Ser2 1)and GSK-3 p(Ser9)indicatedecreasedlevels ofphosphorylationat 6 and 1 2activities for bothenzymesConsistently,Li3PQQmgkg significantlyde

32、creased the enzyme activity oftotal GSK3，as well as that ofGSK一3僅and GSK一36。7萬方數(shù)據(jù)復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文Given that drugs against singletargets are insufficient to prevent AD progression，the development of new drugs against multiple targets involvedin AD pathogenesisorcocktailtherapies representattractivefor AD t

33、reatmentOuranapproachstudybeneficial effects on behaviors andshowed thatLi3PQQexhibitedsignificantlyinpathology through modulatingmodel ofAlzheimerS disease。a mousemultiple pathophysiological processesKeywords：AlzheimerSquinonein，lithium，glycogendisease，pyrroloquinolinesynthase kinase-3，Apbindingalc

34、ohol dehydrogenase8萬方數(shù)據(jù)復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文正文部分引言隨著人口老齡化進(jìn)程加速，阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)以其高患病率、高經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)越來越引起社會(huì)的普遍關(guān)注。AD是好發(fā)于老年人的常見的 進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是癡呆最常見的類型，在65歲以上人群中約為5，85歲以上人群中超過20I¨。本病常散發(fā)，女性多于男性，女性患者的病程 常較男性患者長。其臨床表現(xiàn)為認(rèn)知和記憶功能不斷惡化，日常生活能力進(jìn)行性減退，并有各種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙。隨著人口的老齡化，AD的發(fā)病率逐 年上升，嚴(yán)重危害老年人的身心健康和生活質(zhì)量，給病人造

35、成深重的痛苦，給家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)，已成為嚴(yán)重的社會(huì)問題，引起各國政府和醫(yī)學(xué)界的普遍關(guān)注【21。迄今為止，我們?nèi)匀蝗狈τ行ё柚够蜓泳廇D疾病進(jìn)展的藥物和治療手段。 目前臨床使用的腦內(nèi)膽堿酯酶抑制劑(如石杉堿甲和多奈哌齊等)和非競爭性 NMDA受體拮抗劑(美金剛)并不能阻止AD病情的進(jìn)展；被認(rèn)為最有前景的D 淀粉樣蛋白(13-amyloid，A13)疫苗治療也被證明不能抑制癡呆癥狀和病情的進(jìn)展， 盡管它確實(shí)有清除腦內(nèi)A13沉積和老年斑的作用【3】，多項(xiàng)臨床試驗(yàn)的失敗促使我 們反思目前AD的研究策略。腦內(nèi)老年斑形成和神經(jīng)原纖維纏結(jié)是AD的兩大特征性病理改變，AB和過 磷酸化tau蛋白是形成老

36、年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)的基礎(chǔ)和主要成分【4。5】。AB前體蛋 白(A13 precursor protein，APP)代謝異常導(dǎo)致AD產(chǎn)生過多和清除減少【68】、受累神經(jīng)元內(nèi)蛋白激酶和或蛋白磷酸酯酶磷酸化系統(tǒng)失衡導(dǎo)致tau蛋白異常磷酸化p。1 UJ被認(rèn)為是導(dǎo)致AD兩大特征性病理損害發(fā)生的主要機(jī)制，如B分泌酶(p-secretase，BACE)111-12】和丫分泌酶(y-secretase)13-141活性增高導(dǎo)致AB產(chǎn)生增 加、包括糖合酶激酶一3(glycogen synthase kinase3，GSK3)在內(nèi)的某些蛋白激酶活性升高引發(fā)的tau蛋白相關(guān)位點(diǎn)磷酸化【1516】等。在針對這些可能病

37、理機(jī)制而設(shè)計(jì)的防治策略中，由于p分泌酶和1，分泌酶抑制劑僅能減少Ap產(chǎn)生、而不能阻止tau蛋白磷酸化等原因，臨床試驗(yàn)效果令人失望【1718】?，F(xiàn)實(shí)促使我們從更為廣泛的視角重新思考AD的防治策略。雖然家族性AD和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型研究顯示早老素1(presenilin1，PSl)、早老素2(presenilin2， PS2)和APP等基因突變可以導(dǎo)致AD發(fā)病，但散發(fā)性AD的發(fā)病卻難以用單基 因異常機(jī)制來解釋。新近大量臨床與基礎(chǔ)研究表明，散發(fā)性AD不是單一病理損害機(jī)制導(dǎo)致的簡單疾病，而是糖(脂)和能量代謝紊亂【19-21、線粒體功能異常和q萬方數(shù)據(jù)復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文氧化應(yīng)激【22q3等多種機(jī)制參與的

38、，以蛋白質(zhì)(多肽)異常集聚和突觸異常減少為 顯著病理特征的復(fù)雜疾病。特別值得一提的是，神經(jīng)元具有高度特化的亞細(xì)胞結(jié) 構(gòu)，如突觸和軸突、樹突等，突觸是介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞間信號傳導(dǎo)的基本單位，神經(jīng) 突觸結(jié)構(gòu)及功能的異常改變可引起神經(jīng)系統(tǒng)信號網(wǎng)絡(luò)功能異常并導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng) 疾病。線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和蛋白質(zhì)(多肽)異常聚集可導(dǎo)致突觸功能與 結(jié)構(gòu)損害。在AD發(fā)病早期，突觸數(shù)量和突觸蛋自己顯著下降，腦組織活檢發(fā)現(xiàn) AD發(fā)病后24年，患者海馬的突觸數(shù)量減少已高達(dá)4455【24】。隨著病程進(jìn)展， 突觸丟失不斷增加，且與認(rèn)知功能損害程度密切相關(guān)，AD也被認(rèn)為是突觸功能障礙(synaptic failure)性疾病【

39、25J。因而，解除和削弱突觸損害的病因?qū)W因素或機(jī)制也是防治AD研究熱點(diǎn)之一?，F(xiàn)有的AD治療藥物或手段之所以不能達(dá)到滿意的治療效果，可能與它們不 能兼顧導(dǎo)致AD沉積、tau蛋白異常磷酸化和突觸損害等多方面的病理損害機(jī)制 有關(guān)。因而，尋找低毒、多作用靶點(diǎn)的新藥或“雞尾酒療法"成為AD防治研究中的熱點(diǎn)?；A(chǔ)與臨床研究發(fā)現(xiàn)，AD患者和動(dòng)物模型腦細(xì)胞葡萄糖代謝障礙與能量代 謝顯著降低、而且明顯早于臨床癥候和特征性病理損害的形成【2睨71，糖代謝障礙已被認(rèn)為是癡呆和AD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素【2鼬91，部分學(xué)者甚至建議將AD歸類為III 型糖尿病【301。因而，在糖代謝和穩(wěn)態(tài)維持中具有重要和核心作用的線

40、粒體功能 和GSK3活性與AD發(fā)病的關(guān)系廣受研究者關(guān)注。線粒體是調(diào)控細(xì)胞能量代謝、細(xì)胞凋亡以及活性氧(reactive oxygen species， ROS)和自由基產(chǎn)生的關(guān)鍵部位，與AD發(fā)生發(fā)展密不可分【31。321。臨床和實(shí)驗(yàn)研 究業(yè)已證明，AD患者和模型動(dòng)物腦細(xì)胞線粒體數(shù)目減少【33】、形態(tài)和功能異常34-35】、線粒體相關(guān)的酶活性(如細(xì)胞色素c氧化酶和Q酮戊二酸脫氫酶等)顯著下降【3637】等。線粒體功能和氧化磷酸化過程等異常不僅減少細(xì)胞生理活動(dòng)必需的ATP產(chǎn)生3s_391，而且導(dǎo)致鈣穩(wěn)態(tài)失衡40411、ROS和自由基產(chǎn)生增加【42431、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)(多肽)異常磷酸化m45】和細(xì)胞

41、凋亡【46】等病理生理過程發(fā)生。盡管目前我們尚不能最終確定線粒體功能障礙究竟是AD發(fā)生的原因還是結(jié)果，但通過線 粒體功能保護(hù)來減少氧化損傷等病理生理過程發(fā)生已經(jīng)是AD防治的重要靶標(biāo)，專(，一【4748】 O此外，GSK3與細(xì)胞糖代謝穩(wěn)態(tài)維持密切相關(guān)，其活性增高導(dǎo)致或加重“胰島素抵抗，發(fā)生f49-矧，而研究也顯示AD患者腦內(nèi)GSK3活性顯著增副”52】。GSK3信號通路能通過雙通道作用機(jī)制同時(shí)調(diào)控Ap產(chǎn)生和tau蛋白磷酸化而受 到AD研究學(xué)者的廣泛重視(圖1)153。GSK3是一個(gè)與多方面生理機(jī)能和疾病發(fā)病機(jī)制關(guān)聯(lián)的蛋白激酶，有兩個(gè)同功異構(gòu)體，分別是GSK一3a(51KD)和萬方數(shù)據(jù)GSK3D(

42、47KD)，二者氨基酸序列有85的-致性、催化亞基更是有98的同源 性【541。研究證明，GSK3a通過特異性底物調(diào)控Y-分泌酶活性和APP加工的p 通路功能，GSK3 cc活性升高導(dǎo)致Ap產(chǎn)生增加，鋰鹽可以通過抑制GSK-3a活性顯著減少AD產(chǎn)生【551。此外，由于tau蛋白在體內(nèi)是GSK3的磷酸化底物之一， GSK3、特別是GSK3B介導(dǎo)的tau蛋白過磷酸化在AD發(fā)病機(jī)制中的作用也被廣泛研列56。571。在體動(dòng)物模型研究證明，GSK3B基因過表達(dá)導(dǎo)致的酶活性增高誘發(fā)腦內(nèi)tau蛋白過度磷酸化和神經(jīng)變性性病理損害發(fā)生158|，而抑制或下調(diào)GSK3D表達(dá)或活性可以減少Ap的產(chǎn)生和tau蛋白磷酸化

43、而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用p， GSK3抑制劑也被證明具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用【6m61j。因而，通過調(diào)制GSK一3信號通路功能防治AD被賦予極高的期望。雕圖1糖合酶激酶-3通過雙通道作用增加AD產(chǎn)生和tau蛋白異常磷酸化示意圖【531遺憾的是，包括氯化鋰等在內(nèi)的、目前已知的GSK3抑制劑由于毒性過大 而限制了其臨床應(yīng)用。鋰鹽作為第一個(gè)被證明的GSK3抑制劑雖然用于臨床治 療雙相精神障礙(bipolar disorder)已經(jīng)超過50年，但由于極窄的治療窗和對老年人群過大的副作用而難以用于AD的臨床治療【55621。因而，尋找低毒性的GSK3抑制劑也成為AD研究熱點(diǎn)之一。吡咯喹啉醌三鋰(分子式：C14H

44、3N20SLi3；分子量：348；見圖2)是我們 自己合成的、具有自主知識產(chǎn)權(quán)的小分子有機(jī)鋰鹽【63】。鋰鹽作為GSK3抑制劑已經(jīng)證明顯著抑制Ap沉積和tau蛋白磷酸化、減少它們在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外的沉積55J和改善胰島素抵抗與糖代謝紊亂的作用【471。吡咯喹啉醌作為新近發(fā)現(xiàn)的B族維生素，被證明具有顯著促進(jìn)細(xì)胞線粒體增生和功能、拮抗氧化損傷、減少AB 集聚和毒性等多種作用【64擊7】。因而，吡咯喹啉醌三鋰兼具改善線粒體功能、抗氧化損傷和抑制GSK-3介導(dǎo)的tau蛋白磷酸化與AD形成、抑制神經(jīng)變性性病理損萬方數(shù)據(jù)復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文害發(fā)生等作用，是有效的多靶點(diǎn)防治AD候選藥物之一。因而，吡咯喹啉醌三鋰

45、 是低毒、高效的多靶點(diǎn)防治AD候選分子，有可能給AD病程修飾治療帶來突破性影響，產(chǎn)生巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。圖2吡咯喹啉醌三鋰分子結(jié)構(gòu)萬方數(shù)據(jù)復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文第一部分吡咯喹啉醌三鋰的合成、急性毒性研究及血液、生化指標(biāo)檢測前言吡咯喹啉醌三鋰(trilithiumpyrroloquinoline quinonein，Li3PQQ)是一個(gè)結(jié)構(gòu)相對簡單的有機(jī)小分子鋰鹽(Li3PQQ，分子量：348；分子式：C14H3N208Li3)，其分子結(jié)構(gòu)(見圖2)保證了吡咯喹啉醌三鋰具有較為穩(wěn)定的理化性質(zhì)。我們前期研究中業(yè)已研究成功成熟的Li3PQQ合成工藝(已經(jīng)申報(bào)國家發(fā)明專利和國際發(fā)明專利，生產(chǎn)工藝流程見

46、圖11)，高效液相色譜法(Hi曲Liquid Chromatography,HPLC)及液相色譜質(zhì)譜分析(LiquidPerformanceMassSpectrometry,LC-MSl均證實(shí)原料藥純度能保證在990Chromatography以上(圖12，上海日馨生物科技有限公司提供)。目前，上海日馨生物科技有限公司已經(jīng)將上述合成工藝順利放大為千克級合成工藝路線，完全能夠保證Li3PQQ臨床前研究的原料藥供應(yīng)，為本課題的完成 奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。為了初步驗(yàn)證Li3PQQ的安全性，我們進(jìn)行了Li3PQQ口服給藥的小鼠急性毒性試驗(yàn)及慢性口服Li3PQQ后小鼠血液學(xué)指標(biāo)檢測和血生化指標(biāo)檢測，來探討其

47、是否低毒及有成藥的可能。萬方數(shù)據(jù)復(fù)旦大學(xué)博士NHCHO五面湎麗面麗1EtOH，HCI。NaN02Ac20-_L-2HBF4，EtOHHCOOHNHCHODMFNH2OCH3PQl02PQl03PQl01彳H3冒&HN-N-B-呲'C-HC-。OCH3EEOEtHCI，acetoRe幽些基NHCHONH2PQl05PQl06PQl08OMePQl09EH1LOHTHF·-2H2S04OCH3PQlllPQll2圖11吡咯喹啉醌三鋰生產(chǎn)工藝流程14復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文一4O昔。|I眥坤wI柏·舢g·'O。15：13：2tO鼬bO10k端ES，+

48、?sIC'H”I烈靖U扣，00，Sk潞：0，S1tSG：磚。l C零3j孫7游?m錨瑚磚i |! i鬈錯(cuò)li摹q霸琳l搿抽睜j三蔓。羔。6 x鯊|-。5工董j；：k。薹!芰k。一礎(chǔ)l、，f舢湖湖糯撇渤糯弱o020103040min圖1-2吡咯喹啉醌三鋰的結(jié)構(gòu)及HPLC(A)、LCMS(B)圖。A圖示原料藥峰值在分子量34706處，基本符合Li3PQQ的分子量大?。籅圖示14403分鐘時(shí)出現(xiàn)出峰峰值，峰值的分子量為350左右，也符合Li3PQQ的分子量，提示峰值位置為Li3PQQ。15萬方數(shù)據(jù)復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文第一章Li3PQQ的急性毒性研究材料和方法1實(shí)驗(yàn)材料11實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明種叫)

49、小鼠，SPF級，68周齡。提供單位：上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。所有涉及到動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)均按照復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院相關(guān)指導(dǎo)規(guī)定進(jìn)行，符合動(dòng)物倫理委員會(huì)要求。共分四批：第l批34只，雌雄各 半，體重130"1819；第2批24只，雌雄各半，體重121"-1819；第3批12 只，雌雄各半，體重134-一1779；第4批：10只，雌雄各半，體重123"-2059。給藥開始時(shí)體重：雄性190"2299，雌性1 83'2219。飼養(yǎng)條件及環(huán)境：SPF級實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，溫度2025，濕度4070， 噪聲60分貝，換氣次數(shù)10"-'20次糾、時(shí)

50、，明暗交替時(shí)間：12h明12h暗。小鼠 自由飲食、飲水，1"-'2天換水1次，1周換12次墊料。留驗(yàn)觀察時(shí)間：動(dòng)物入室后適應(yīng)性飼養(yǎng)13天。12實(shí)驗(yàn)藥物121藥物名稱吡咯喹啉醌三鋰(Li3PQQ)：起始劑量為790mgkg；配制方法：稱取LiaPQQ， 加純水分別配制成所需濃度79mgmL，250mgmL和500medrnL，充分混勻。給 藥當(dāng)天配制。對照品氯化鋰(LiCl)：起始劑量為370mgkg；配制方法：稱取LiCl，加純水分別配制成所需濃度37mgmL，116mgmL和500mgmL，充分混勻。給藥當(dāng)天配制。122劑量設(shè)置及依據(jù)根據(jù)上下法(Up and down me

51、thod)，按預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)資料，進(jìn)行主試驗(yàn)， 在AOT425StatPgm 10中設(shè)定給藥劑量，并根據(jù)動(dòng)物存活情況向上或向下調(diào)整劑量。123給藥途徑及選擇理由：灌胃給藥，與受試物的臨床給藥途徑一致。給藥容量：10mLkg。給藥次數(shù)：單次給藥。2實(shí)驗(yàn)方法萬方數(shù)據(jù)復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文21動(dòng)物分組：分為給藥組和陽性對照組。挑選健康小鼠，按上下法進(jìn)行主試驗(yàn)設(shè)定如下給藥程序：表11Li3PQQ與LiCI的給藥程序(動(dòng)物編號、性別和劑量)22動(dòng)物標(biāo)識：給藥組及對照組雌雄分籠飼養(yǎng)，根據(jù)需要用苦味酸按頭、背、尾、條、白等標(biāo)記。23給藥方法：給藥前禁食不禁水3h。根據(jù)在AOT425StatPgml0中設(shè)定的

52、給藥劑量給藥。在此給藥程序中，每次給藥1只動(dòng)物，間隔48 h，觀察動(dòng)物死亡或存活情況(X死亡，O存活)，并向上或向下調(diào)整劑量，直到滿足試驗(yàn)停止標(biāo)準(zhǔn)之一時(shí)，即停止試驗(yàn)。停止試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)連續(xù)3只動(dòng)物存活；(2)任意連續(xù)6 只試驗(yàn)動(dòng)物中有5只連續(xù)發(fā)生存活死亡轉(zhuǎn)化；(3)第一只動(dòng)物發(fā)生轉(zhuǎn)換之后至少有4只動(dòng)物進(jìn)入試驗(yàn)，并且LD50估算值的范圍超過臨界值(25倍)。24檢測指標(biāo)241一般癥狀觀察：小鼠給藥當(dāng)天嚴(yán)密觀察，尤其是給藥后4h內(nèi)。然后對存活 動(dòng)物每天觀察1次，連續(xù)14天，包括動(dòng)物體重變化、飲食、外觀、行為、分泌 物、排泄物、動(dòng)物異常反應(yīng)的癥狀、起始時(shí)間、嚴(yán)重程度、持續(xù)時(shí)間、是否可逆17萬方數(shù)據(jù)復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文以及動(dòng)物死亡情況。242小鼠體重：在給藥當(dāng)天(給藥前)測定，其后每周1次。243病理檢查：動(dòng)物死亡及時(shí)解剖檢查，其他動(dòng)物在觀察期結(jié)束后進(jìn)行大體解 剖，記錄病變情況，主要觀察心臟、肺臟、腎臟、肝臟、脾臟、胃腸道等內(nèi)臟， 觀察是否有出血點(diǎn)、水腫等異常情況，并作記錄。當(dāng)發(fā)現(xiàn)器官出現(xiàn)體積、顏色、