第六章分子雜交技術(shù)

1、第六章第六章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 探針的選擇和標(biāo)記探針的選擇和標(biāo)記第二節(jié)第二節(jié) 雜交和洗膜雜交和洗膜第三節(jié)第三節(jié) 檢測(cè)與分析檢測(cè)與分析 1、原理、原理 堿基互補(bǔ)配對(duì)堿基互補(bǔ)配對(duì) 探針（探針（probe） 同特異性目標(biāo)作用同特異性目標(biāo)作用 有效檢測(cè)有效檢測(cè)2、基本步驟、基本步驟 探針的選擇和標(biāo)記探針的選擇和標(biāo)記 轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜 預(yù)雜交、雜交預(yù)雜交、雜交 洗膜洗膜 檢測(cè)檢測(cè)第一節(jié)第一節(jié) 探針的選擇和標(biāo)記探針的選擇和標(biāo)記1、克隆探針和合成的寡核苷酸探針、克隆探針和合成的寡核苷酸探針 特異性特異性 靈敏度靈敏度 雜交時(shí)間雜交時(shí)間2、寡核苷酸探針的類型和應(yīng)用、寡核苷酸探針的類型和應(yīng)用 特定序

2、列的單一寡核苷酸探針特定序列的單一寡核苷酸探針 較短而簡(jiǎn)并性較高的成套的寡核苷酸探針較短而簡(jiǎn)并性較高的成套的寡核苷酸探針 對(duì)少量高度純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)序；按照遺傳密碼推導(dǎo)對(duì)少量高度純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)序；按照遺傳密碼推導(dǎo) 較長(zhǎng)而簡(jiǎn)并性較低的寡核苷酸探針較長(zhǎng)而簡(jiǎn)并性較低的寡核苷酸探針只含有所有可能密碼中的一部分只含有所有可能密碼中的一部分簡(jiǎn)并位點(diǎn)上帶上一個(gè)簡(jiǎn)并位點(diǎn)上帶上一個(gè)“中性中性”堿基，如次黃苷酸堿基，如次黃苷酸例：根據(jù)氨基酸序列選擇長(zhǎng)例：根據(jù)氨基酸序列選擇長(zhǎng)17個(gè)核苷酸的寡核苷個(gè)核苷酸的寡核苷酸探針?biāo)崽结榣 數(shù)目數(shù)目22 24=323、寡核苷酸探針的選擇原則寡核苷酸探針的選擇原則 長(zhǎng)度長(zhǎng)度1

3、8-50bp G、C堿基組成在堿基組成在40%-60% 分子內(nèi)不存在互補(bǔ)區(qū)分子內(nèi)不存在互補(bǔ)區(qū) 避免在序列中連續(xù)出現(xiàn)一個(gè)堿基的多次重復(fù)避免在序列中連續(xù)出現(xiàn)一個(gè)堿基的多次重復(fù)4、探針的標(biāo)記方法、探針的標(biāo)記方法 雙鏈雙鏈DNA探針的制備探針的制備 切口平移；隨機(jī)引物切口平移；隨機(jī)引物 使用前變性；雜交過程中可能發(fā)生自退火使用前變性；雜交過程中可能發(fā)生自退火 單鏈單鏈DNA探針的制備探針的制備 在單鏈模板上進(jìn)行引物延伸反應(yīng)；化學(xué)合成；在單鏈模板上進(jìn)行引物延伸反應(yīng)；化學(xué)合成；PCR 單鏈單鏈RNA探針的制備探針的制備雙鏈雙鏈DNA的切口平移標(biāo)記法的切口平移標(biāo)記法DNA的隨機(jī)引物標(biāo)記法的隨機(jī)引物標(biāo)記法ba

4、ck酶切位點(diǎn)要選擇在酶切位點(diǎn)要選擇在正好處于插入的正好處于插入的目標(biāo)目標(biāo)DNA的下游的下游使轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物使轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不含載體序列不含載體序列 利用體外轉(zhuǎn)錄體系產(chǎn)生單鏈利用體外轉(zhuǎn)錄體系產(chǎn)生單鏈RNA探針探針5、標(biāo)記物的選擇、標(biāo)記物的選擇 放射性同位素放射性同位素 非放射性同位素非放射性同位素地高辛（地高辛（Digoxigenin）-11-dUTP的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)第二節(jié)第二節(jié) 雜交和洗膜雜交和洗膜1、雜交的速率與探針長(zhǎng)度及復(fù)雜性、雜交的速率與探針長(zhǎng)度及復(fù)雜性示示t1/2和雜交探針長(zhǎng)度之間的關(guān)系和雜交探針長(zhǎng)度之間的關(guān)系2、雜交的最適條件、雜交的最適條件 雜交分子的穩(wěn)定性雜交分子的穩(wěn)定性 溫度溫度 雜交的嚴(yán)緊性

5、雜交的嚴(yán)緊性 高溫高溫/低鹽低鹽第三節(jié)第三節(jié) 檢測(cè)與分析檢測(cè)與分析非放射性非放射性DNA標(biāo)記和檢測(cè)程序標(biāo)記和檢測(cè)程序例：轉(zhuǎn)基因植物的檢測(cè)例：轉(zhuǎn)基因植物的檢測(cè)抗生素篩選、抗生素篩選、PCR、Southern、Northern、Western 雙酶切檢測(cè)雙酶切檢測(cè) 單酶切檢測(cè)單酶切檢測(cè)R0代轉(zhuǎn)化子的代轉(zhuǎn)化子的Southern分析分析轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子R1后代的后代的Southern分析分析 如何判斷插入拷貝數(shù)？如何判斷插入拷貝數(shù)？與含有不同拷貝數(shù)（與含有不同拷貝數(shù)（1、5、10）的質(zhì)粒雜交結(jié)果做對(duì)照）的質(zhì)粒雜交結(jié)果做對(duì)照通過多個(gè)單酶切結(jié)果判斷通過多個(gè)單酶切結(jié)果判斷 通過選擇酶切位點(diǎn)和探針位置，可進(jìn)行通過

6、選擇酶切位點(diǎn)和探針位置，可進(jìn)行comprehensive雜交雜交，以判斷外源插入片段是否串，以判斷外源插入片段是否串聯(lián)排列，以及排列方向聯(lián)排列，以及排列方向 原位雜交（原位雜交（in situ hybridization，ISH） 利用含有互補(bǔ)序列的利用含有互補(bǔ)序列的DNA或或RNA探針直接檢測(cè)在染色體、探針直接檢測(cè)在染色體、細(xì)胞或組織內(nèi)特定細(xì)胞或組織內(nèi)特定DNA或或RNA序列的技術(shù)序列的技術(shù) 廣泛應(yīng)用于檢測(cè)染色體的結(jié)構(gòu)變異、外源染色體的滲入和廣泛應(yīng)用于檢測(cè)染色體的結(jié)構(gòu)變異、外源染色體的滲入和轉(zhuǎn)基因的分子細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定等轉(zhuǎn)基因的分子細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定等 熒光原位雜交熒光原位雜交 （fluoresc

7、ence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）習(xí)題習(xí)題1 某人在做某人在做Southern雜交時(shí)，為節(jié)省時(shí)間，完成凝膠電泳后，雜交時(shí)，為節(jié)省時(shí)間，完成凝膠電泳后，未經(jīng)未經(jīng)NaOH溶液浸泡凝膠，就直接將溶液浸泡凝膠，就直接將DNA從凝膠轉(zhuǎn)至硝酸從凝膠轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，然后應(yīng)用標(biāo)記探針雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)放射自顯纖維素膜上，然后應(yīng)用標(biāo)記探針雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)放射自顯影后膠片上一片空白。請(qǐng)問應(yīng)如何解釋這一結(jié)果。影后膠片上一片空白。請(qǐng)問應(yīng)如何解釋這一結(jié)果。習(xí)題習(xí)題2 2個(gè)正常個(gè)體生育一個(gè)患有唐氏綜合癥（個(gè)正常個(gè)體生育一個(gè)患有唐氏綜合癥（21號(hào)染色體三體）號(hào)染色體三體）的病兒，利用的病兒，利用1段段21號(hào)染色體探針，