DNA指紋的遺傳分析實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、DN傳旨紋的遺傳分析【實(shí)驗(yàn)原理】“DNA 指紋”是指可以利用 DNA 差異來進(jìn)行與傳統(tǒng)指紋分析相似的身份識別。 DNA 指紋是以 DNA 的多態(tài)性為基礎(chǔ)， 而衛(wèi)星 DNA 的發(fā)現(xiàn)則是其最重要的奠基石。衛(wèi)星 DNA 是由一短序列(即重復(fù)單位或核心序列)多次重復(fù)而成，因此也有人稱其為可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(variablenumbersoftandemreprat,VNTR)，在人類基因組中存在多種由不同重復(fù)單位組成的衛(wèi)星 DNA,重復(fù)單位的堿基序列在不同個體中具有高度的保守性，而衛(wèi)星 DNA 的多態(tài)性則來源于重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)不同，并形成了眾多的等位基因。列如，人類 1 號染色體上的 VNTRD1

2、S80,核心序列由16 個核甘酸組成，拷貝數(shù)在 1441 個之間，已知 29 種不同的等位基因。1984 年 Jefferys 等人首次將分離的人源小衛(wèi)星 DNA 用作基因探針，同人類核DNA 的酶切片段雜交，產(chǎn)生了由 10 多條帶組成的雜交圖譜，不同個體雜交圖譜上帶的位置就像指紋一樣因人而異，因而 Jefferys 等人稱之為 DNA 指紋圖譜。產(chǎn)生DNA 指紋圖譜的過程叫做 DNA 指紋分析，目前包括 PCR、RFLP(限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)性)和 RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA)等方法。DNA 指紋圖譜的基本特點(diǎn)：(1)多位點(diǎn)性：基因組中某些位點(diǎn)的小衛(wèi)星重復(fù)單位含有相同或相似的核

3、心序列。在一定的雜交條件下，一個小衛(wèi)星探針可以同時與十幾個甚至幾十個小衛(wèi)星位點(diǎn)上的等位基因雜交。(2)高變異性：DNA 指紋圖譜反應(yīng)的是多個位點(diǎn)上的等位基因的特征，具有很高的變異性。發(fā)現(xiàn)兩個無血緣關(guān)系個體具有相同 DNA 指紋圖譜的概率僅為 5X10-19,因此，除了同卵雙胞胎，幾乎不可能有兩個人的 DNA 指紋圖譜完全相同。(3)穩(wěn)定的遺傳性：DNA 指紋圖譜中的譜帶能夠穩(wěn)定遺傳，雜合帶遵守孟德爾遺傳規(guī)律。子代 DNA 指紋圖譜中產(chǎn)生與雙親都不同的新帶的概率(基因突變)僅在0.0010.004 之間。DNA 指紋圖譜還具有體細(xì)胞穩(wěn)定性，即用同一個體的不同組織如血液、肌肉、毛發(fā)、精液等的 DN

4、A 作出的 DNA 指紋圖譜是一致的。由于 DNA 指紋圖譜具有這些顯著的特征， 他已經(jīng)成為最具吸引力的遺傳標(biāo)記。Jeffreys 是第一個意識到 DNA 指紋可以建立個人身份識別系統(tǒng)的人， 并且首先將其用于親子鑒定，移民審查和兇殺偵破。1989 年該技術(shù)獲美國國會批準(zhǔn)作為正式法庭物證手段。止匕外，它還被用于醫(yī)生診斷及尋找與疾病連鎖的遺傳標(biāo)記，探明動物種群的起源及進(jìn)化過程，在作物的基因定位及育種上也有非常廣泛的應(yīng)用?！緦?shí)驗(yàn)材料、儀器及試劑】1 .人類口腔細(xì)胞。2 .儀器：微量移液器，小型離心機(jī)，恒溫水浴鍋，漩渦振蕩器，PCR儀，電泳儀，電泳槽，透射式紫外分析儀(或凝膠成像儀)。槍頭，1.5mL

5、,0.2mL 離心管，棉簽，使用前均需 121c 高溫滅菌3 .試劑：NaCl,瓊脂糖，澳化乙錠，Na2-EDTA,SDS,Tris,ProteinaseK,冰醋酸，澳酚藍(lán)，二甲苯月青藍(lán)，蔗糖，甘油，DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)記，Chelex100 樹脂(Bio-Rad),PCRpre-mix(TaKaRa4 .溶液配制：(1)5%Chelex 樹脂：Chelex100(Bio-Rad)0.5g、50mmol/LTris-HCl10mL、用4mol/LNaOH 調(diào) pH 至 11,室溫可保存 3 個月，使用前充分混勻。(2)2.0%瓊脂糖凝膠：稱 2.0g 瓊脂糖放入 250ml 三角燒瓶，加入

6、1XTAE 溶液 100mL 微波爐加熱溶解，冷卻至 60c 左右加入 1g/mL 澳化乙錠(EB),緩慢混勻后倒膠板。(3)澳化乙錠(EB):用無菌水配制 5mg/mL 儲藏液，工作濃度 1 仙 g/mL。注意；澳化乙錠為誘變劑，有致癌作用。配制、稀釋和染色時必須戴手套。(4)0.5mol/LEDTA(pH8.0):Na2-EDTA18.61g、NaOH2g,蒸儲水定容至100mL,室溫保存。(5)10 xTAE 電泳緩沖液：Tris48.4g、冰醋酸 11.42mL、0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL,蒸儲水定容至 1000mL,室溫保存。(6)10 x 上樣緩沖液(Loadi

7、ngdye):澳酚藍(lán) 0.25g、二甲苯月青藍(lán) 0.25g蔗糖50.00g(或甘油 50mL),用 60mL 無菌水(用甘油 50mL 時，49mL)溶解上述試劑，再定至 100mL，室溫保存即可。(7)10%SDS:SDS10g 用無菌水溶解后(可加熱)，定容至 100mL,室溫保存。(8)蛋白酶 K 溶液：20mg/mL 蛋白酶 K 水溶液 5mL、10%SDS1mL、無菌水94mL,冰箱冷藏。(8)無菌水：蒸儲水或去離子水，高溫滅菌。(10) 1mol/LTris-HCl(pH8.0):將 12.1gTris 溶解在 80mL 蒸儲水中， 加鹽酸調(diào)節(jié)pH 至 8.0,加蒸儲水定容至 10

8、0mL。5.引物Primer1:5-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG-3Primer2:5-GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC-3【實(shí)驗(yàn)操作】1. 收集 DNA 樣本(1)先漱口，然后用滅菌的牙簽充分擦刮口腔內(nèi)壁，將該牙簽放入 1.5mL 裝有1mL 無菌水的小離心管中，使粘附在牙簽表面的口腔細(xì)胞懸浮其中(以能看到懸浮物為好)。震蕩 10s,10000r/min 離心 1min。(2)從離心管中吸出 970 仙 L 無菌水，注意不要吸到沉淀。(3)向離心管中加入 200 仙 L5%Chelex100,震蕩 10s 混勻。(4)加入 2L 蛋白酶

9、K,混勻，56c 保溫 5min。(5)劇烈震蕩 10s 沸水浴 8min。(6)10000r/min 離心 3min,離心管中溶液分成上下兩層：下層為 Chelex100和細(xì)胞碎片的沉淀，上層溶液含 DNA 分子，可以直接用作 PCR 模板。此 DNA 樣本可在 4c 或-20C 保存，必要時可在使用前再次加熱并離心，使管內(nèi)物質(zhì)分層。2. PCR 擴(kuò)增 D1S80 等位基因(1)每個人用記號筆在 0.2mLPCR 管上做好標(biāo)記。(2)準(zhǔn)備冰盒，開始反應(yīng)前盡量使 PCR 管保持在冰上。(3)依次加入下列成分，配制 25NL 體系的 PCR 反應(yīng)溶液：PCRpre-mix12.5LL引物 11L

10、L引物 21LL口腔細(xì)胞 DNA 樣本 10NL加無菌水至總體積 25uL。(4)輕彈管壁，混勻溶液。(5)離心 10s,使管壁上的液滴落下。(6)按下列程序開始 PCR 反應(yīng)：94C,1min94C,15s68C,15s72C,15s30 個循環(huán)72C,10min4c 暫時放置，直至開始電泳3. PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定與 D1S80 等位基因分析(1)準(zhǔn)備冰盒。(2)取出完成反應(yīng)的 PCR 管，放冰上待用。(3)取出 10pLD1S80PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物放入 0.5mL 離心管。(4)加入 2 山上樣緩沖液。(5)輕彈管壁混勻，再瞬時離心，使管壁上的液滴下落。(6)用 1kAE 電泳緩沖液配制

11、2.0%瓊脂糖電泳凝膠。(7)60V 預(yù)電泳 12min。(8)在凝膠上選一孔加 6pLDNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)記(DNA100bpLadder)(9)每人將剛剛準(zhǔn)備好的 10pLD1S80PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物+2uL 的上樣緩沖液各自加入凝膠樣孔，注意不要有氣泡進(jìn)入。(10)60V 電泳 3040min。(11)取出凝膠用清水漂洗 510min。(12)凝膠用紫外分析儀觀察，記錄每個個體的 DNA 條帶數(shù)目及其位置。4.觀察和分析 D1S80 多態(tài)性。四、結(jié)果與分析本次實(shí)驗(yàn)所選擇的方法是 D1S80 指紋圖譜分析的常用方法。 人群中 D1S80 座位的雜合率約為 86%。從理論上講，可能存在 43

12、5 種不同的等位基因組合。利用D1S80 座位兩側(cè)序列設(shè)計(jì)的引物(Kasaietal,1990),通過 PCR 反應(yīng)，很容易確定特定個體的 D1S80 等位基因構(gòu)成，純合體只有一條 DNA 帶，而雜合體有兩條不同的DNA 帶。1 .將小組的電泳結(jié)果拍照，附于下：2 .根據(jù)電泳結(jié)果，填寫 D1S80 等位基因分析結(jié)果DlS80DNA 指紋特征小組成員大小/bp長度（重復(fù)數(shù)）雜合/純和小組成員 A60029純和小組成員 B150022純和小組成員 C55025純和注：因?yàn)橹貜?fù)數(shù)為 l 的 DIS80PCR 產(chǎn)物長 161bp,所以，重復(fù)數(shù)每增加一個,序列增加長度 16bp。據(jù)此可以催算：重復(fù)數(shù)=1

13、+（PCR 產(chǎn)物大小161）/16【討論】1.本人的條帶是第二條，不是很清楚，原因可能是樣品濃度過稀，也就是一開始刮取的口腔內(nèi)壁細(xì)胞太少了，水浴時又灑了少許，以至于后來 PCR 也沒擴(kuò)增出。還有一個可能的原因就是 DNA 的純度不夠，帶有太多的雜質(zhì)，從而跑電泳時 DNA 被雜質(zhì)阻滯，因此效果不太好。2.跑出的條帶上的 DNA 是人源小衛(wèi)星 DNADIS80 的 PCRT 物。它是一種具有多位點(diǎn)、高變異、穩(wěn)定遺傳的 DNA 分子，而且每個人的 DIS80DNA 中重復(fù)序列的數(shù)目是不同的，所以它比傳統(tǒng)的指紋分析更方便、快捷、準(zhǔn)確。3.實(shí)驗(yàn)過程中，有兩次水浴的步驟，一定要注意將離心管的蓋子蓋緊，由于

14、離心管是滅菌的，所以如果蓋子蓋的不緊，就會從沸水浴中炸開，自己就是這種情況，導(dǎo)致條帶不清楚。思考題：1,用 PCR、RFLP、RAPD 方法產(chǎn)生 DNA 指紋圖譜各有哪些利弊？答：PCR 作為現(xiàn)代生物學(xué)研究的一種常用方法，具有特異性高、靈敏度高、簡便節(jié)約、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)；但是它最大的缺點(diǎn)是對不同的片段條件不同，所以很難掌握，而且必須要得到目的基因片段。RFLP 這種方法比較穩(wěn)定，但 RFLP 實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，檢測時間長，成本較貴，不太適合大規(guī)模的分子育種。PAPD 相對 RFLP 來說，更加省時省力，不需要進(jìn)行 DNA 多種酶切、轉(zhuǎn)膜以及探針的制備等多個步驟，但是它不能用來測定多態(tài)性是由父本還是母本產(chǎn)生的，而