禽流感實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)方案

1、禽流感實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)方案一、實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)設(shè)置實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制 所國家流感中心和省級(jí)流感實(shí)驗(yàn)室兩級(jí)組成。二、實(shí)驗(yàn)室條件及生物安全操作的要求1、省級(jí)流感實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)條件及生物安全的操作要求 (1實(shí)驗(yàn)生物安全要求:安全級(jí) +(BSL-2 級(jí) +或 安全級(jí)(BSL-3 級(jí) 。(2特異性 H5 的 RT-PCR 病毒核酸檢測、血清學(xué)檢 測中用到的血凝抑制實(shí)驗(yàn) (HI 可以在安全級(jí) +(BSL-2 級(jí) +實(shí)驗(yàn)室里操作。(3 特異性 H5 的 RT-PCR 病毒核酸檢測在安全級(jí) + (BSL-2級(jí) +實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜里提取病毒的核酸,進(jìn) 行病毒核酸檢測的實(shí)驗(yàn)室要求請(qǐng)參照國家有關(guān)核

2、酸檢測要 求的規(guī)定。(4微量中和實(shí)驗(yàn)、特異性 H5 的 RT-PCR 病毒核酸 檢測陽性的采樣標(biāo)本的病毒分離、尸檢標(biāo)本的檢測必須在安 全級(jí)(BSL-3 級(jí)實(shí)驗(yàn)室里操作。(5省級(jí)流感實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)條件:具備進(jìn)行禽流感相關(guān) 臨床標(biāo)本初篩所需的生物安全柜、 離心機(jī)、 PCR 儀、 電泳儀、 紫外線檢測儀等配套設(shè)備。2、國家流感中心實(shí)驗(yàn)生物安全要求:生物安全級(jí) +(BSL-2 級(jí) +和生 物安全級(jí)(BSL-3 級(jí)實(shí)驗(yàn)室。3、省級(jí)流感實(shí)驗(yàn)室職責(zé)(1 禽流感采樣標(biāo)本的臨床標(biāo)本特異性 H5 的 RT-PCR 病毒核酸檢測;(2禽流感 H5 的血清學(xué)檢測工作;(3特異性 H5 的 RT-PCR 病毒核酸檢測陽性標(biāo)

3、本的 病毒分離必須在生物安全級(jí)(BSL-3 級(jí)實(shí)驗(yàn)室;(4沒有生物安全級(jí)(BSL-3 級(jí)實(shí)驗(yàn)室的,將標(biāo) 本送國家流感中心做病毒的分離工作。4、國家流感中心實(shí)驗(yàn)室職責(zé)(1國家流感中心設(shè)立在中國疾病預(yù)防控制中心病毒 病預(yù)防控制所流感室;(2對(duì)各省報(bào)告的禽流感疑似病例或確診病例進(jìn)行復(fù) 核、確認(rèn);(3對(duì)不具備禽流感病毒分離條件的省份送檢標(biāo)本的 檢測、分離和確認(rèn);(4對(duì)需要做微量中和實(shí)驗(yàn)的血清標(biāo)本進(jìn)行微量中和 試驗(yàn);(5對(duì)各省級(jí)實(shí)驗(yàn)室檢測人員的培訓(xùn);(6對(duì)各省級(jí)流感實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制。三、原始標(biāo)本采集1、標(biāo)本采集人員醫(yī)療機(jī)構(gòu)的醫(yī)生、護(hù)士或當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心專業(yè)人 員負(fù)責(zé)標(biāo)本采集并填寫標(biāo)本登記表,標(biāo)本采集

4、人員按照禽 流感職業(yè)暴露人員防護(hù)原則做好個(gè)人防護(hù)。2、標(biāo)本采集種類和時(shí)限(1采集標(biāo)本的種類:疑似禽流感患者的咽、鼻拭子 或含漱液、血清以及死亡病例的尸檢肺組織、氣管分泌物。 (2采集標(biāo)本時(shí)間:咽、鼻拭子或含漱液在發(fā)病的頭 3 天采集;急性期血清在發(fā)病后 7 天內(nèi)采集, 恢復(fù)期血清在發(fā)病 后 2-4周采集;尸檢標(biāo)本尸檢時(shí)采集。3、標(biāo)本的運(yùn)送:所有采集的標(biāo)本應(yīng)在醫(yī)院采集時(shí)立即 分裝,一式二份,其中一份單獨(dú)保存,以備復(fù)核。采集的標(biāo) 本若不能在 24 小時(shí)內(nèi)送達(dá),則應(yīng)盡快在-70 以下保存。 無-70 條件的需在-20冰箱短時(shí)間暫存,并盡快聯(lián)系 遞送標(biāo)本。4、標(biāo)本采集的方法:詳見國標(biāo)流行性感冒診斷標(biāo)準(zhǔn)

5、 及處理原則 。四、送流感中心的標(biāo)本包裝、運(yùn)送與接收1、標(biāo)本的包裝(1標(biāo)本必須放在大小適合的帶螺旋蓋內(nèi)有橡膠圈的 塑料管里,擰緊。(2將密閉后的標(biāo)本放入大小適合的塑料袋內(nèi)密封; 每袋裝一份標(biāo)本。(3直接在塑料管上用油性記號(hào)筆寫明樣本的種類、 采樣時(shí)間、編號(hào)、姓名,同時(shí)也將標(biāo)本有關(guān)信息填在禽流感 人體標(biāo)本送檢登記表,連同塑料管用另一塑料袋內(nèi)密封。 (4將裝標(biāo)本的密封袋放入專用運(yùn)輸箱內(nèi)(或疫苗冷 藏包 ,放入冰排,然后以柔軟物質(zhì)填充,內(nèi)襯具吸水和緩 沖能力的材料。 同一患者 2 份以上的密封標(biāo)本, 可以放在同 一個(gè)塑料袋內(nèi)再次做密封。若將進(jìn)行病毒分離,可將密封好 的裝有標(biāo)本的容器直接放入液氮運(yùn)輸罐

6、內(nèi)運(yùn)輸。所有容器必 須印有生物危險(xiǎn)標(biāo)識(shí)。2、標(biāo)本運(yùn)送(1航空或鐵路運(yùn)送。(2專人專車運(yùn)送:主要用于近距離樣品運(yùn)送。 3、標(biāo)本的接收(1各省級(jí)中心實(shí)驗(yàn)室應(yīng)公布標(biāo)本接收聯(lián)系方式,并 實(shí)行 24 小時(shí)標(biāo)本接收制;(2國家實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本接收:需送國家流感中心實(shí)驗(yàn)室檢測的原始標(biāo)本、病毒分離物、可疑陽性標(biāo)本、血清等,填寫標(biāo)本送檢登記表,在低溫 保存條件下,于 24小時(shí)內(nèi)送至中國疾病預(yù)防控制中心病毒 病預(yù)防控制所流感中心進(jìn)行復(fù)核。國家流感中心標(biāo)本接收聯(lián) 系方式為:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所, 地址:北京市宣武區(qū)迎新街 100 號(hào),聯(lián)系人:郭元吉、王敏,聯(lián)系 電話 010-6

7、3581337, 傳真:(010 63534632。 五、標(biāo)本檢測方法1、禽 H5 病毒核酸檢測:材料:疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液,死亡病 例的尸檢肺組織、氣管分泌物。方法:RT-PCR , 用于禽 H5 亞型流感病毒的快速檢測、 測序及排除工作。試劑:特異性 H5 及甲型流感病毒的引物、 病毒 RNA 提 取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄酶、 Taq DNA 聚合酶等試劑 , 建議使用德 國 QIAGEN 的 Rneasy Mini Kit (病 毒 核 酸 提 取 和 QIAquick Gel Extraction Kit(PCR 產(chǎn)物純化產(chǎn)品。2、病毒分離及鑒定:材料 : 疑似禽流感患者的咽、鼻

8、拭子或含漱液,死亡病 例的尸檢肺組織、氣管分泌物。方法:采用雞胚和 MDCK 細(xì)胞分離方法,血凝及血凝 抑制試驗(yàn)(HAI 具體方法詳見國標(biāo)流行性感冒診斷標(biāo)準(zhǔn) 及處理原則 。經(jīng)特異性 H5 RT-PCR 病毒核酸檢測陽性的采樣標(biāo)本的病毒分離及鑒定工作必須在安全級(jí)（BSL-3 級(jí)） 實(shí)驗(yàn)室里操作。 試劑：雞胚接種采用 SPF 雞胚，MDCK 細(xì)胞等。 3、疑似病例的血清學(xué)檢測： 材料：疑似病例的急性期和恢復(fù)期的雙份血清。 方法：血凝抑制實(shí)驗(yàn)具體方法詳見國標(biāo)流行性感冒診 斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則 。 試劑：H5 滅活病毒。 4、微量中和試驗(yàn) 材料：疑似病例的急性期和恢復(fù)期的雙份血清。 試劑：H5 活病毒，必

9、須在生物安全級(jí) (BSL-3 級(jí)實(shí) 驗(yàn)室里操作。 六、檢測結(jié)果的確認(rèn) 以下情況的原始標(biāo)本及分離物送國家流感中心檢測、復(fù) 核、確認(rèn)。 1、標(biāo)本分離物血凝實(shí)驗(yàn)（HA）陽性，同時(shí) H5 血凝抑 制試驗(yàn)（HI）陰性，H5 的 RT-PCR 檢測陽性。 2、標(biāo)本分離物血凝實(shí)驗(yàn)（HA）陽性，同時(shí) H5 血凝抑 制試驗(yàn)（HI）陽性或 H5 的 RT-PCR 檢測陽性。 3、 標(biāo)本分離物血凝實(shí)驗(yàn) （HA） 陽性， 同時(shí) H5 的 RT-PCR 檢測陽性。 4、病人恢復(fù)期血清比急性期血清的 H5 抗體有 4 倍或 以上增高。 5、標(biāo)本分離陽性，H5 血凝抑制試驗(yàn)陰性，并已排除了 是當(dāng)前流行的甲、乙型毒株的可能。 七、檢測結(jié)果報(bào)告 一般情況下, 實(shí)驗(yàn)室收到的