藥物活性篩選實驗(共8頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上實驗計劃實驗目的：采用HEK293/1D-AR/G16細胞模型，通過鈣流實驗評價關(guān)黃柏的四個血中移行成分小檗堿、黃柏內(nèi)酯、黃柏酮及木蘭堿對1D型腎上腺素能受體的阻滯作用，表征成分的抗前列腺炎潛在活性；在22RV1人前列腺癌細胞上，通過MTT及相關(guān)分子生物學分析評價以上四種血中移行成分的治療前列腺癌活性。第一章 關(guān)黃柏血中移行成分抗前列腺炎活性評價1 實驗材料1.1 儀器與試劑1.1.1 實驗儀器：CO2培養(yǎng)箱SANYO 三洋紫外消毒柜泰州安康倒置熒光顯微鏡OLYMPUS倒置顯微鏡OLYMPUS超微量分光光度計元儀離心機盧湘儀干燥箱上海一恒熒光讀板儀PerkinElme

2、r低溫離心機Hettich生物安全柜HDL電子分析天平梅特勒-托利多超純水機優(yōu)普離心機（?。㏕hermo電泳儀Bio-Rad電泳成像儀Bio-Rad熒光PCR儀Bio-Rad梯度PCR儀Bio-Rad磁力攪拌器IKA立式蒸汽壓力滅菌器上海博訊水浴鍋IKA流式細胞儀默克密理博1.1.2 實驗材料：HEK293/1D-AR/G16穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，22RV1人前列腺癌細胞（ATCC），ABT-594和RJR2403陽性化合物（腎上腺素、咖啡因？），96-孔黑邊透明底 Greiner plate（µClear/Clear Bottom）,Millipore viacount reagent，DM

3、EM高糖培養(yǎng)液（Applichem，Germany）,HBSS( Hyclone, USA),臺盼藍（Sigma，USA），RPIM-1640(HyClone),FBS,Antibiotics，DMSO，Trypsin-EDTA，HEPES，MTT,Fluo-4 AM免洗鈣流檢測試劑盒，乙醇其它試劑均為分析純級。2 方法2.1 細胞株培養(yǎng)細胞的復蘇培養(yǎng)  從-80中取出凍存管,立即投入37水浴,并不斷的搖動,使之迅速融化。 將溶解的細胞凍存管取出,用酒精消毒后打開,吸出溶有細胞的凍存液,加入事先裝好培養(yǎng)液（37預熱，810倍體積）離心管內(nèi),稍微吹打混勻,然后1000rpm 5min,

4、去除上清,加入適量培養(yǎng)液,吹打成細胞懸液, 以1×105/mL密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，在37、5CO2及飽和濕度下培養(yǎng)于含有10%FBS的DMEM（High glucose）培養(yǎng)液中，同時加入 400 g/mL G418。消化細胞使用含 0.05%EDTA的Trypsin溶液。2.2 細胞的傳代HEK293/1D-AR/G16細胞48h換液1次，細胞長至60%70%融合時，用0.25%胰酶消化12min，將培養(yǎng)瓶再用手掌輕輕敲打使細胞脫壁、懸浮、分散，為使細胞進一步分散可用吹打管輕輕吹打幾次，獲得細胞懸液，然后加入倍量的培養(yǎng)基，溫和混勻，吸管分裝混合液，傳代擴增細胞。并凍存細胞

5、備用，凍存細胞使用含10%DMSO或甘油、1020%小牛血清的凍存培養(yǎng)液。2.3  細胞形態(tài)的觀察  在倒置顯微鏡下觀察并記錄細胞的生長情況及形態(tài)特征。2.4 細胞的計數(shù)  常規(guī)消化細胞，待細胞變圓、脫壁并浮起，加入少量培養(yǎng)基離心，再用millipore viacount按比例重懸并吹打制成細胞懸液。預熱guava流式細胞儀，進行流式細胞儀的細胞計數(shù)分析。2.5細胞的貼壁率  指數(shù)生長期的細胞，以0.25胰酶消化成單細胞懸液，計數(shù)后分別接種于12個25cm2培養(yǎng)瓶中，每兩小時隨機取出3瓶細胞，吸除培養(yǎng)基及未貼壁細胞，加入胰消化酶消化、計數(shù)已貼壁細胞，取其

6、平均值，按照公式：貼壁率(%)=(已貼壁細胞數(shù)/接種細胞數(shù)) ×100，計算貼壁率。2.6生長曲線 細胞生長曲線是測定細胞絕對生長數(shù)的常用方法，也是判定細胞活力的重要指標，是培養(yǎng)細胞生物學特性的基本參數(shù)之一。一般細胞傳代之后，經(jīng)過短暫的懸浮然后貼壁，隨后度過長短不同的潛伏期，即進入大量分裂的指數(shù)生長期。在細胞達到飽和密度后，停止生長，進入平頂期，然后退化衰亡。為了準確描述整個過程中細胞數(shù)目的動態(tài)變化，典型的生長曲線可分為生長緩慢的潛伏期，斜率較大的指數(shù)生長期，呈平臺狀的平頂期及退化衰亡4個部分。以存活細胞數(shù)(萬/mL)對培養(yǎng)時間(h或d)作圖，即得生長曲線。取指數(shù)生長期的細

7、胞用胰酶消化制成單細胞懸液，以1×104/孔接種于24孔板，每孔加入1mL培養(yǎng)基。每天隨機取3孔，計數(shù)每孔細胞的數(shù)目并計算平均值。連續(xù)計數(shù)10d，繪制細胞生長曲線?；虿捎门_盼藍計數(shù)法：(1)取不同時間段生長的原代小鼠肝細胞，用胰酶消化，用新培養(yǎng)基制成細胞懸液后計數(shù)(2)根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果，以單位細胞數(shù)(細胞數(shù)/mL)為縱坐標，以時間為橫坐標繪制生長曲線。MTT檢測法：（1）細胞接種在96孔板上，200ul/孔，培養(yǎng)基代替細胞懸液做為空白對照。（2） 加入0.1 mL MTT于37孵育4 h。使MTT還原為藍紫色甲贊結(jié)晶。（3）加入150ul/孔的DMSO,搖床上低速震蕩15min,使藍

8、色的結(jié)晶充分溶解后，在酶標儀上在OD值490nm處檢測（4）計算細胞成活率，繪制細胞生長曲線。2.7 細胞形態(tài)觀察并記錄利用倒置相差顯微鏡觀察生長過程中細胞的形態(tài)，并拍照記錄。2.8 鈣流實驗配體門控離子通道受體是繼蛋白偶聯(lián)受體和核激素受體家族之后的又一重要的受體靶標。建立基于配體門控離子通道受體介導的鈣流變化的藥物篩選模型，將細胞與敏感的熒光探針（）共同孵育，使用陽性化合物（）來激動標記細胞，通過加入被測化合物后熒光讀板儀檢測到的鈣流變化，觀察被篩選化合物激動或拮抗鈣流反應的能力，篩選出對1D-AR起拮抗作用的藥物2.8.1鈣流反應緩沖液配制HEPES 10 mmol/L，NaCl 5 mm

9、ol/L，KCl 5 mmol/L，CaCl22 mmol/L,N-methyl-D-glucamine 140 mmol/L，glucose 10 mmol/L，室溫下調(diào) pH 值到 7.4。2.8.2細胞內(nèi)鈣流的檢測方法待細胞融合度達70%-90%時，收集于直徑 10 cm 的細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的HEK293/1D-AR/G16細胞，加入 Fluo-4 5 mol/L 和 2.5 mmol/L Probenecid，室溫下避光孵育 30 分鐘后，使用鈣流反應緩沖液洗滌 2 遍。以 80 l/孔接種到 96 孔黑邊透明底的 Greiner板中，細胞密度約 6×104/孔。使用 PE

10、熒光讀板儀，加入一定濃度的化合物溶液 20 L/孔，在激發(fā)波長 485 nm，發(fā)射波長 525 nm 下檢測熒光強度120 秒。2.8.3 數(shù)據(jù)采集與處理取鈣流曲線的峰值讀數(shù)來量化該點化合物的鈣流反應。數(shù)據(jù)的非線性回歸擬合及作圖采用 GraphPad Prism（GraphPad Software, Inc.，San Diego, CA, USA）軟件。同時可以利用熒光顯微鏡拍照記錄?；衔镆种坡视嬎愎剑夯衔镆种坡?(ABT-594 引發(fā)的峰值讀數(shù)各化合物引發(fā)的峰值讀數(shù)) /ABT-594 引發(fā)的峰值讀數(shù)×100%第二章 關(guān)黃柏血中移形成分抗前列腺癌活性評價1 實驗材料1.2 儀

11、器與試劑1.1.1 實驗儀器：CO2培養(yǎng)箱SANYO 三洋紫外消毒柜泰州安康倒置熒光顯微鏡OLYMPUS倒置顯微鏡OLYMPUS超微量分光光度計元儀離心機盧湘儀干燥箱上海一恒熒光讀板儀PerkinElmer低溫離心機Hettich生物安全柜HDL電子分析天平梅特勒-托利多超純水機優(yōu)普離心機（?。㏕hermo電泳儀Bio-Rad電泳成像儀Bio-Rad熒光PCR儀Bio-Rad梯度PCR儀Bio-Rad磁力攪拌器IKA立式蒸汽壓力滅菌器上海博訊水浴鍋IKA流式細胞儀默克密理博1.1.2 實驗材料：HEK293/1D-AR/G16穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，22RV1人前列腺癌細胞（ATCC），ABT-594和R

12、JR2403陽性化合物，96-孔黑邊透明底 Greiner plate（µClear/Clear Bottom）,Millipore viacount reagent，DMEM高糖培養(yǎng)液（Applichem，Germany）,HBSS( Hyclone, USA),臺盼藍（Sigma，USA），RPIM-1640(HyClone),FBS,Antibiotics，DMSO，Trypsin-EDTA，HEPES，MTT,Fluo-4 AM免洗鈣流檢測試劑盒，乙醇其它試劑均為分析純級。2 方法2.1 細胞株培養(yǎng)細胞的復蘇培養(yǎng)  從-80中取出凍存管,立即投入37水浴,并不斷的搖

13、動,使之迅速融化。 將溶解的細胞凍存管取出,用酒精消毒后打開,吸出溶有細胞的凍存液,加入事先裝好培養(yǎng)液（37預熱，810倍體積）離心管內(nèi),稍微吹打混勻,然后1000rpm 5min,去除上清,加入適量培養(yǎng)液,吹打成細胞懸液, 以1×105/mL密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，在37、5CO2及飽和濕度下培養(yǎng)于含有10%FBS的RPIM-1640培養(yǎng)液中。消化細胞使用含 0.05%EDTA的Trypsin溶液。2.2 細胞的傳代22RV1人前列腺癌細胞長至60%70%融合時，用0.25%胰酶消化12min，將培養(yǎng)瓶再用手掌輕輕敲打使細胞脫壁、懸浮、分散，為使細胞進一步分散可用吹打管輕輕吹

14、打幾次，獲得細胞懸液，然后加入倍量的培養(yǎng)基，溫和混勻，吸管分裝混合液，傳代擴增細胞。并凍存細胞備用，凍存細胞使用含10%DMSO或甘油、1020%小牛血清的凍存培養(yǎng)液。2.3  細胞形態(tài)的觀察  在倒置顯微鏡下觀察并記錄細胞的生長情況及形態(tài)特征。2.4 細胞的計數(shù)  常規(guī)消化細胞，待細胞變圓、脫壁并浮起，加入少量培養(yǎng)基離心，再用millipore viacount按比例重懸并吹打制成細胞懸液。預熱guava流式細胞儀，進行流式細胞儀的細胞計數(shù)分析。2.5細胞的貼壁率  指數(shù)生長期的細胞，以0.25胰酶消化成單細胞懸液，計數(shù)后分別接種于12個25cm2培養(yǎng)

15、瓶中，每兩小時隨機取出3瓶細胞，吸除培養(yǎng)基及未貼壁細胞，加入胰消化酶消化、計數(shù)已貼壁細胞，取其平均值，按照公式：貼壁率(%)=(已貼壁細胞數(shù)/接種細胞數(shù)) ×100，計算貼壁率。2.6生長曲線 細胞生長曲線是測定細胞絕對生長數(shù)的常用方法，也是判定細胞活力的重要指標，是培養(yǎng)細胞生物學特性的基本參數(shù)之一。一般細胞傳代之后，經(jīng)過短暫的懸浮然后貼壁，隨后度過長短不同的潛伏期，即進入大量分裂的指數(shù)生長期。在細胞達到飽和密度后，停止生長，進入平頂期，然后退化衰亡。為了準確描述整個過程中細胞數(shù)目的動態(tài)變化，典型的生長曲線可分為生長緩慢的潛伏期，斜率較大的指數(shù)生長期，呈平臺狀的平頂期及退化

16、衰亡4個部分。以存活細胞數(shù)(萬/mL)對培養(yǎng)時間(h或d)作圖，即得生長曲線。取指數(shù)生長期的細胞用胰酶消化制成單細胞懸液，以1×104/孔接種于24孔板，每孔加入1mL培養(yǎng)基。每天隨機取3孔，計數(shù)每孔細胞的數(shù)目并計算平均值。連續(xù)計數(shù)10d，繪制細胞生長曲線?；虿捎门_盼藍計數(shù)法：(1)取不同時間段生長的原代小鼠肝細胞，用胰酶消化，用新培養(yǎng)基制成細胞懸液后計數(shù)(2)根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果，以單位細胞數(shù)(細胞數(shù)/mL)為縱坐標，以時間為橫坐標繪制生長曲線。MTT檢測法：（1）細胞接種在96孔板上，200ul/孔，培養(yǎng)基代替細胞懸液做為空白對照。（2） 加入0.1 mL MTT于37孵育4 h。使MTT還原為藍紫色甲贊結(jié)晶。（3）加入150ul/孔的DMSO,搖床上低速震蕩15min,使藍色的結(jié)晶充分溶解后，在酶標儀上在OD值490nm處檢測（4）計算細胞成活率，繪制細胞生長曲線。2.7 細胞形態(tài)觀察并記錄利用倒置相差顯微鏡觀察生長過程中細胞的形態(tài)，并拍照記錄。2.8 CCK8、MTT檢測關(guān)黃柏血中移行成分抗前列腺癌活性2.8.1.收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調(diào)密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。2.8.2.5%CO2，37孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板，具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根