NCI-H446人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株細(xì)胞亞群克隆異質(zhì)性與腫瘤干細(xì)胞的實驗

1、NCI-H446人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株細(xì)胞亞群克隆異質(zhì)性與腫瘤干細(xì)胞的實驗    背景隨著腫瘤干細(xì)胞研究的深入,越來越多的證據(jù)表明除白血病外,乳腺癌、腎癌、腦腫瘤也存在腫瘤干細(xì)胞,肺癌等實體瘤也可能存在腫瘤干細(xì)胞,但肺癌腫瘤干細(xì)胞研究相對滯后。動物實驗?zāi)Ｐ吞崾灸[瘤干細(xì)胞的存在。犬的正常支氣管上皮沒有型肺泡上皮,但型肺泡上皮細(xì)胞可出現(xiàn)在重度不典型增生和侵蝕性病灶中。型肺泡上皮存在增殖分子標(biāo)記物Ki267和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA),提示其可能是支氣管癌的多潛能干細(xì)胞。2005年Kim等報道支氣管肺泡干細(xì)胞很可能就是肺癌的源頭。他們在非小細(xì)胞肺癌小鼠模型從小鼠腫

2、瘤的最初階段分離到這種干細(xì)胞,并將其命名為支氣管肺泡干細(xì)胞(brochioalveolar stem cells,BASCs)。他們利用流式細(xì)胞儀篩選發(fā)現(xiàn),BASCs表達(dá)干細(xì)胞抗原Scal(stem cellantigen1)和CD34,但不表達(dá)血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子PECAM(plateletendothelial cell adhesion molecule,PECAM/CD31)和CD45,即具有Sca1+CD45- PECAM- CD34+特征的腫瘤干細(xì)胞。BASCs在正常情況處于靜止?fàn)顟B(tài),當(dāng)體內(nèi)支氣管和肺泡損傷時發(fā)生增殖。BASCs表現(xiàn)出明顯的自我更新特性,能夠分化成其它類型的肺上皮

3、細(xì)胞,表現(xiàn)出干細(xì)胞的特性。他們認(rèn)為BASCs是遠(yuǎn)端肺上皮的干細(xì)胞,可能局限于支氣管Clara細(xì)胞和肺泡型及型細(xì)胞。在Kras基因突變活化的終未支氣管和肺泡上皮的不典型增生和腺瘤中,可以觀察到BASCs數(shù)量明顯增加,提示BASCs可能是肺腺癌的起源細(xì)胞(亦即腫瘤干細(xì)胞)。Maziers等證實了在肺癌細(xì)胞信號轉(zhuǎn)道通路中存在與上述干細(xì)胞相似的Wnt過渡表達(dá),非經(jīng)典途徑JNK通路激活和Wnt拮抗劑W IF1的抑制和失活調(diào)節(jié)作用。黃盛東等研究A549肺癌細(xì)胞株中腫瘤干細(xì)胞與克隆形成的關(guān)系,觀察克隆形態(tài)是否與腫瘤細(xì)胞的不斷自我更新相關(guān)。他們將A549肺癌細(xì)胞株單細(xì)胞懸液接種到96孔板,觀察克隆形成率和克隆

4、形態(tài)及傳代情況,測量克隆大小,計數(shù)細(xì)胞數(shù)目,分別觀察早期、中間和晚期的黏附細(xì)胞數(shù)目,檢測其細(xì)胞增殖活性和細(xì)胞免疫表型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)A549肺癌細(xì)胞株可形成3種類型的克隆集落,其中Holoclone型占總克隆數(shù)的4%,克隆體積大,可連續(xù)傳代20代以上,并可分化為其他兩種類型的集落,增殖活性不隨時間延長而降低,并表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記,認(rèn)為A549肺癌細(xì)胞株Holoclone型克隆集落存在不斷自我更新的腫瘤干細(xì)胞。董強(qiáng)剛等研究人肺腺癌干細(xì)胞分離及鑒定,采用磁性細(xì)胞分選(magnetic activated cellsorting,MACS)技術(shù)將肺腺癌細(xì)胞分成多個亞群,然后應(yīng)用流式細(xì)胞及RT-PCR技術(shù)檢測干

5、細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志表達(dá),通過NOD-SCID小鼠移植評估其致瘤性。結(jié)果在A549和SPC-A肺腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一個新穎的癌細(xì)胞亞群,此類癌細(xì)胞的表型特征為CD 24+IGF-.1R+,具有高侵襲性和高致瘤性,在NOD-SCID小鼠中僅需移植100個細(xì)胞即可形成腫瘤,其致瘤能力是上述標(biāo)志陰性細(xì)胞的1000倍。此外,這些細(xì)胞表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)志(OCT4和Bmi-1)及肺干細(xì)胞標(biāo)志(CCSP,SP-C,TTF-1和Gremlin),類似小鼠肺臟細(xì)支氣管肺泡干細(xì)胞(bronchioalveolar stem cells,BASCs),并具有自主生長特性,能夠在無血清條件下長期培養(yǎng)。他們認(rèn)為人體肺腺癌中CD24

6、+IGF-1R+細(xì)胞屬于BASCs樣癌干細(xì)胞。當(dāng)前腫瘤干細(xì)胞相關(guān)研究中細(xì)胞表面標(biāo)志物是分選肺癌腫瘤干細(xì)胞的關(guān)鍵。研究顯示白血病腫瘤干細(xì)胞、腦腫瘤腫瘤干細(xì)胞、毛細(xì)血管瘤、前列腺癌腫瘤干細(xì)胞均表達(dá)CD133分子,腫瘤干細(xì)胞可能與正常組織干細(xì)胞有相似的表面標(biāo)志物,Hilbe等在非小細(xì)胞肺癌內(nèi)皮祖細(xì)胞發(fā)現(xiàn)CD133分子表達(dá),腫瘤中的內(nèi)皮祖細(xì)胞可能來源于肺癌的腫瘤干細(xì)胞。由此推論肺腺癌腫瘤干細(xì)胞亦可能存在與BASCs相似的表現(xiàn)標(biāo)志物,如:Sca1+、CD45-、Pecan-、CD34+等。腫瘤干細(xì)胞包括肺癌腫瘤干細(xì)胞是否具有能夠與正常組織干細(xì)胞區(qū)分開來的特異性細(xì)胞表面標(biāo)志物尚需探索。關(guān)于BMI-1與腫瘤

7、干細(xì)胞的關(guān)系研究中,僅有有關(guān)白血病腫瘤干細(xì)胞的報道。Lessard等發(fā)現(xiàn),表達(dá)BMI-1的小鼠外周血白血病細(xì)胞明顯高于BMI-1缺失純合子小鼠,后者的骨髓細(xì)胞輸注給第2供者小鼠后沒有使之發(fā)生AMI,再將第2供者小鼠的骨髓細(xì)胞經(jīng)BMI-1轉(zhuǎn)染后再移植小鼠,受者小鼠即可發(fā)生AML。對BMI-1-/-白血病細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)10 d后,小鼠白血病細(xì)胞數(shù)較對照組明顯下降,細(xì)胞阻滯于G1期且凋亡細(xì)胞增加,這類細(xì)胞的集落形成能力也有所下降。提示BMI-1對白血病干細(xì)胞的增殖與致白血病的能力具有決定性作用。本研究擬通過對NCI-H446小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株單細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),觀察克隆形成率和克隆形態(tài)

8、;通過體外實驗探索研究多靶點(diǎn)抗腫瘤新藥索拉非尼(Sorafenib)是否對不同克隆腫瘤細(xì)胞有效及療效之間存在差別,指導(dǎo)臨床化療失敗患者的治療。進(jìn)一步比較不同克隆細(xì)胞周期分布差別;檢測比較表面標(biāo)記物CD133、ABCG_2、BMI-1基因表達(dá)。探討NCI-H446小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株克隆異質(zhì)性與腫瘤干細(xì)胞的關(guān)系,即其細(xì)胞生物學(xué)行為表明肺癌腫瘤干細(xì)胞存在,為下一步肺癌腫瘤干細(xì)胞分離鑒定提供實驗依據(jù)和基礎(chǔ)。本研究國內(nèi)外尚未見同類報道,具備創(chuàng)新性及一定臨床指導(dǎo)價值。目的1.研究NCI-H446小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株克隆形態(tài)、異質(zhì)性、細(xì)胞周期差別。2.研究多靶點(diǎn)抗腫瘤新藥索拉非尼對NCI-H446小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株

9、不同克隆細(xì)胞的體外療效差別。3.研究NCI-H446小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株不同克隆細(xì)胞干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD133、ABCG_2、BMI-1表達(dá)情況。方法1.細(xì)胞培養(yǎng):實驗取對數(shù)生長期的細(xì)胞。NCI-H446小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株以RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng),實驗取對數(shù)生長期的細(xì)胞,細(xì)胞數(shù)為0.5×106-1×106個/ml。2.有限稀釋法克隆培養(yǎng)制備單細(xì)胞懸液:對數(shù)生長期的細(xì)胞貼壁生長鋪滿培養(yǎng)瓶后,應(yīng)用有限稀釋法將單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng),標(biāo)記單個細(xì)胞生長的培養(yǎng)孔,23周后細(xì)胞形成克隆,觀察不同克隆形態(tài)和生長速度。轉(zhuǎn)移到普通培養(yǎng)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)23周。3.MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率:

10、不同克隆細(xì)胞傳代制備單細(xì)胞懸液。將實驗藥物索拉非尼按終濃度分別為6mol/L、3mol/L、1.5mol/L進(jìn)行MTT實驗,96孔板用酶標(biāo)儀于570納米(nm)處測定各孔吸光度(A)值,細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1實驗組吸光度值/陰性對照組吸光度值)×100%。4.流式細(xì)胞術(shù)測定各克隆細(xì)胞周期:各克隆培養(yǎng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶壁后按細(xì)胞傳代常規(guī)方法制備細(xì)胞懸液,流式細(xì)胞儀常規(guī)檢測細(xì)胞周期分布。5.免疫組化染色干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、ABCG_2檢測:各克隆培養(yǎng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶壁后按細(xì)胞傳代常規(guī)方法行細(xì)胞爬片。免疫組化法檢測干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、ABCG_2。6.不同克隆核蛋白Western-b

11、lotting法免疫印跡分析檢測BMI-1蛋白:將不同克隆細(xì)胞核蛋白應(yīng)用Western-blotting法免疫印跡分析檢測BMI-1蛋白。7.統(tǒng)計學(xué)處理:實驗所得CD133和ABCG_2陽性率采用卡方分析檢驗,細(xì)胞周期分布以配對t檢驗,實驗所得細(xì)胞增殖抑制率以組間比較檢驗采用卡方分析檢驗,數(shù)據(jù)處理采用SPSS11.5軟件統(tǒng)計分析。結(jié)果1.15個單細(xì)胞克隆生長形成克隆,形態(tài)上大致分為兩種克隆,索拉非尼對NCI-H446人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株克隆A細(xì)胞增殖抑制作用不隨時間及濃度變化,抑制率為4.96%-6.49%;對克隆B抑制率為3.86%-30.39%,呈劑量-時間依賴效應(yīng)。索拉非尼對兩種克隆細(xì)胞增

12、殖抑制具有顯著性差異。2.15個單細(xì)胞克隆生長形成克隆,形態(tài)上大致分為兩種克隆?？寺共染色6片次,CD133、ABCG2表達(dá)陽性率為(66.67±8.57)%、(33.33±5.17)%;克隆B共染色26片次,CD133、ABCG2表達(dá)陽性率為(15.38±2.68)%、(7.69±1.64)%?？寺與克隆B的CD133、ABCG2表達(dá)具有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(2=38.12,40.24,P0.05)?？寺細(xì)胞處于G0/G1者多于克隆B,分別是(70.13+3.26)%和(54.61±1.38)%。3.15個單細(xì)胞克隆生長形成克隆,形態(tài)上大致

13、分為兩種克隆,克隆A的BMI-1蛋白陽性表達(dá)率為75.00%,克隆B的BMI-1蛋白陽性表達(dá)率為12.50%,NCI-H446人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株BMI-1蛋白陽性表達(dá)率為33.33%,克隆A和克隆B的BMI-1蛋白陽性表達(dá)率具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論1.NCI-H446人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株細(xì)胞存在異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞克隆,可能來源于腫瘤干細(xì)胞的分化。2.索拉非尼能抑制NCI-H446人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株細(xì)胞增殖,部分呈劑量-時間依賴效應(yīng),索拉非尼對不同克隆細(xì)胞增殖抑制率不同,可能與不同克隆細(xì)胞生物學(xué)特性有關(guān)。3.克隆形態(tài)觀察,肯定2種克隆形態(tài)差別明顯,BMI-1蛋白在小細(xì)胞肺癌不同克隆細(xì)胞亞群的表達(dá)可能與

14、其發(fā)生發(fā)展生物學(xué)行為和異質(zhì)性有密切關(guān)系,高表達(dá)BMI-1蛋白克隆可能存在肺癌腫瘤干細(xì)胞?！鞠嗨莆墨I(xiàn)】1. 朱德球,李森華.假性肺腫瘤(附三例報告)J.實用放射學(xué)雜志, 1987,(02)2. 拳頭大的肺腫瘤可以"燙殺"J.家庭醫(yī)學(xué), 2005,(03)3. 任樂榮,劉玉琴.腫瘤干細(xì)胞研究進(jìn)展J.四川腫瘤防治, 2004,(01)4. 孫昌明,尉繼偉,劉治幫.肺癌誤診原因分析附31例報告J.中國肺癌雜志, 2005,(02)5. 王紹奎,董紅梅,邱欽紅,張愛云.肺癌合并感染252例臨床分析J.腫瘤防治雜志, 2005,(02)6. 王林,秦鴻雁,韓驊.腫瘤干細(xì)胞的研究現(xiàn)狀J.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2005,(S1)7. 劉玉清,盧云濤,楊林瀛,賴光輝.肺癌168例分析J.中國誤診學(xué)雜志, 2002,(09)8. 朱玉珍,王惠琴,孫衛(wèi)民.腫瘤干細(xì)胞研究進(jìn)展J.中國腫瘤生物治療雜志, 2004