組織工程學材料替代輸尿管缺損的動物實驗及臨床應用

1、組織工程學材料替代輸尿管缺損的動物實驗及臨床應用摘要目的尋求理想的輸尿管替代材料。方法將20只兔雙側(cè)輸尿管脫細胞處理后制成輸尿管細胞外基質(zhì)(ECM)；另60只兔分為3組：輸尿管ECM移植組(實驗組)，對照組1及對照組2。結(jié)果實驗組術(shù)后組織學檢查顯示1周時ECM邊緣部腔內(nèi)面已見移行上皮細胞，管壁有肌細胞長入。6周時取材ECM區(qū)已修復近正常輸尿管組織結(jié)構(gòu)。12、24周時IVU檢查；輸尿管顯影良好，通暢。對照組1術(shù)后710天，移植的異體輸尿管均壞死。對照組2輸尿管缺損區(qū)6周時均被纖維包裹而明顯增粗。在實驗取得滿意結(jié)果的基礎上成功應用于臨床。結(jié)論異體脫細胞輸尿管細胞外基質(zhì)為理想的輸尿管替代材料。關(guān)鍵詞

2、輸尿管細胞外基質(zhì)移植Histo-engineering material for the replacement of ureterLIU Liu?,LIANG Dejiang,SHEN Pengfei,et al.Department of Urology,Beijing Ji Shui Tan Hospital,Beijing 100035AbstractObjectiveTo experiment the possibility of allodecellular extracellular matrix for the replacement of ureter.MethodsExtr

3、acellular matrix was obtained from the ureters of 20 rabbits by decellularization process.60 experimental rabbits were used and a 4cm segment of left ureter was resected in each.In the experimental group of 20 rabbits,the resected ureter was replaced by the allo-ureter ECM.In the first control group

4、 of 20 rabbits the resected ureter was replaced by allograft transplantation of untreated ureter.In the second control group of rabbits the resected ureter site was left untreated for autoregeneration.The neoureter segment was studied with electron-microscopy and immunohistochemical procedures.Resul

5、tsIn the experimental animals,transitional epithelial cells and monocytes could be seen in the ECM area and fully filled up the area after 3 weeks.No stenosis and hydronephrosis were observed on IVU 24 weeks after replacement of the resected ureter.The histological structure was not much different f

6、rom a normal ureter.In the first control group with allograft transplantation,rejection and necrosis occurred 710 days after the transplantation.In the second conrol group of autoregeneration the studied area was embeded with fibrosis tissue.On the basis of the experiment,ureter ECM has been success

7、fully used in clinical practice.ConclusionsAlloureter ECM might be an ideal replacement material for ureter.Key wordsUreterExtracellular matrixTransplantation為尋求理想的輸尿管替代材料，我們應用組織工程學材料同種異體脫細胞輸尿管細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)作為輸尿管替代材料,并在動物實驗取得滿意結(jié)果的基礎上,成功應用于臨床。報告如下。材料與方法一、材料1.實驗動物:新西蘭兔80只,雌雄不限,體重2.54

8、.0kg。2.脫細胞輸尿管ECM的制作:無菌下取20只兔雙側(cè)輸尿管置于固定液中,對輸尿管的ECM進行交聯(lián)保護后利用低滲緩沖液對已固定的輸尿管內(nèi)細胞進行初次提取,再利用RNA酶，DNA酶和一些化學試劑對輸尿管內(nèi)的細胞成分進行第二次提取,消化掉可引發(fā)免疫排斥反應的細胞成分后獲得輸尿管ECM,經(jīng)組織學檢查確定無細胞存在。提取后的ECM按所需長度分裝,無菌保存于4冰箱內(nèi)。二、實驗方法60只兔分為3組,每組20只。第一組為異體輸尿管ECM移植組(實驗組),第二組為異體輸尿管移植組(對照組1),第三組為輸尿管再生組(對照組2)。1.實驗組:每次3只全麻下無菌手術(shù)將左側(cè)輸尿管上中段切除4cm,用同樣長度異體

9、輸尿管ECM移植,上下端分別吻合。直徑0.2cm空心硅膠管作支架,一端經(jīng)輸尿管進入腎盂,另一端進入膀胱。2.對照組1:操作方法同實驗組,但用異體輸尿管替代異體ECM。3.對照組2:操作同前兩組,但切除輸尿管部分后僅將輸尿管兩側(cè)殘端固定于支架上。三、術(shù)后觀察術(shù)后3天,1、3、24周部分兔查血、尿常規(guī)及血生化。術(shù)后1、3、6、12、24周每次3只兔取材行組織學檢查。3只兔術(shù)后1、12周及移植前ECM行免疫組化檢查。1、12周每次2只兔取材行電鏡檢查。術(shù)前和術(shù)后1、2、3周(實驗組),1周(對照組1)每次2只兔行淋巴細胞毒實驗檢查。術(shù)后12、24周每次3只兔行IVU。結(jié)果一、肉眼及組織學觀察1.實驗

10、組: 20只兔中3只死亡。余17只分別于術(shù)后1、3、6、12、24周時每次3只全麻下取材,取材范圍包括雙腎及輸尿管全程。肉眼觀察:不同時期所取左側(cè)腎臟外觀與兔自身對側(cè)腎臟無明顯差別。輸尿管:1周時ECM呈半透明粉紅色,與輸尿管連接邊緣部有少量肌層長入管壁,腔內(nèi)亦有少量粘膜覆蓋。3周時ECM區(qū)外觀及結(jié)構(gòu)已近似于自體輸尿管。6、12、24周取材ECM外觀與3周時無明顯差異。3周及24周時取輸尿管行注水試驗,管腔通暢,5分鐘無外滲。組織學檢查:每次從ECM中部橫行,兩端縱行取材,行HE,VG染色。1周時ECM邊緣部腔面已見移行上皮細胞,管壁有肌細胞長入,縱斷面切片觀察證實肌層及粘膜與輸尿管自體段肌層

11、、粘膜相連接。VG染色證明與輸尿管連接ECM邊緣部為平滑肌纖維。3周時ECM區(qū)管壁由平滑肌繞行形成管壁結(jié)構(gòu),腔內(nèi)被覆移行上皮(1)。VG染色顯示管壁內(nèi)大量平滑肌纖維,與輸尿管自體段肌層相同。6周時取材ECM區(qū)已修復近正常輸尿管組織結(jié)構(gòu)。12、24周取材觀察與6周時相似。 13周時ECM中間部橫行取材。腔內(nèi)被覆類似于兔正常輸尿管的移行上皮，部分區(qū)域可見粘膜缺損，管壁有完整的肌細胞層，可見炎性細胞2.對照組1:術(shù)后710天,移植的異體輸尿管均壞死。3.對照組2:20只兔中7只死亡,余13只在術(shù)后6周時全麻下取材。肉眼觀察:腎臟外觀與兔自身對側(cè)腎臟無明顯差別。輸尿管缺損區(qū)均被周圍組織及纖維包裹而明顯

12、增粗,管腔內(nèi)徑1.01.5cm。腔內(nèi)有35ml混濁尿液,部分區(qū)域為粘膜覆蓋,部分為壞死區(qū)。腔壁為纖維組織構(gòu)成,未見肌層。注水實驗通暢,5分鐘時7只出現(xiàn)外滲現(xiàn)象。組織學檢查:從輸尿管再生區(qū)中部，兩端取材,行HE,VG染色。腔壁為纖維組成,腔內(nèi)部分區(qū)域被覆類似兔正常輸尿管移行上皮及間有大量壞死組織。有大量炎性細胞浸潤。VG染色管壁未見平滑肌纖維。二、免疫組化及電鏡檢查移植前ECM及自體輸尿管取材行免疫組化,結(jié)果顯示均為、型膠原,結(jié)構(gòu)相同。12周時ECM區(qū)和自體輸尿管取材免疫組化結(jié)果顯示,ECM區(qū)、型膠原數(shù)量、形態(tài)與移植前及同期自體輸尿管無明顯差異。移植前ECM及移植后1周,12周ECM區(qū)取材行電鏡

13、檢查,1周時可見ECM邊緣區(qū)長入移行上皮及合成型平滑肌細胞。其膠原纖維結(jié)構(gòu)與移植前無明顯變化。12周時ECM膠原結(jié)構(gòu)與移植前無明顯變化。三、IVU檢查6周時經(jīng)膀胱取出輸尿管支架,于12、24周時每次3只行IVU檢查，結(jié)果:(1)腎盂、腎盞或腎臟均顯影,其中顯影良好4只,部分顯影1只,顯影不佳1只。(2)輸尿管顯影良好并通暢3只,ECM區(qū)管腔輕度擴大,未見吻合部狹窄,近端無擴大。輸尿管未顯影1只,顯示不清2只。四、淋巴細胞毒實驗移植前取實驗組和對照組1各2只兔腸系膜淋巴結(jié)和靜脈血,計算出存活淋巴細胞數(shù),術(shù)后1、2、3周分別取實驗組及1周時對照組1各2只兔靜脈血,計算出存活淋巴細胞數(shù),將兩組存活的

14、淋巴細胞數(shù)用t檢驗統(tǒng)計方法計算。結(jié)果:實驗組移植后1、2、3周的淋巴細胞存活數(shù)與移植前差異無顯著性(P0.05);對照組1術(shù)后1周與移植前差異有顯著性(P0.05)。五、血、尿常規(guī)和血生化檢查實驗組血常規(guī)術(shù)后3天時白細胞輕度增高,1周時恢復正常。尿常規(guī)1周內(nèi)鏡下血尿,3周時正常。術(shù)后不同時期血生化檢驗與術(shù)前相比無差異。臨床資料患者，男性,55歲。因左腎積水,左輸尿管中下段狹窄于1998年1月入院。經(jīng)檢查確診為左輸尿管中下段狹窄,于1998年2月在硬膜外麻醉下手術(shù),術(shù)中發(fā)現(xiàn)左輸尿管中下段約3cm長管腔明顯狹窄,將此段輸尿管切除,用術(shù)前所備異體輸尿管ECM移植替代缺損區(qū),輸尿管內(nèi)留置支架導管。術(shù)后

15、4周拔除支架管,1個月時IVU造影劑順利通過修補區(qū)進入膀胱,修補區(qū)管腔內(nèi)徑稍大于正常輸尿管。術(shù)后6個月IVU檢查,左輸尿管修補區(qū)管腔內(nèi)徑稍大于正常輸尿管.BUN低于術(shù)前稍高于正常。病人一般情況良好。討論輸尿管長段狹窄或缺損的處理是目前臨床上比較棘手的問題,為尋找理想的輸尿管替代材料,國內(nèi)外進行了大量的實驗研究1,2。較早開展的異體組織替代輸尿管因移植后免疫排斥反應而失敗。自體組織移植替代輸尿管由于組織結(jié)構(gòu)不同,難以保證治療效果。也有人嘗試輸尿管缺損后自身再生3，雖然輸尿管缺損區(qū)可被自身輸尿管旁的纖維組織包繞支架管,但因少量尿液從輸尿管斷端滲出,纖維包裹的結(jié)果往往是形成一個較大的纖維樣尿液囊腫,

16、且無正常的輸尿管結(jié)構(gòu)。隨著組織工程學技術(shù)的發(fā)展,組織工程學材料之一ECM作為修復缺損區(qū)的材料得到了廣泛應用4,5。該材料具備二個特點:(1)作為異體組織材料,在經(jīng)特殊脫細胞處理后,已無含細胞抗原的細胞成分,僅保留了由膠原蛋白,蛋白多糖,糖蛋白等低抗原物質(zhì)構(gòu)成的ECM。ECM的種屬差異小,抗原性弱,移植后不易產(chǎn)生排斥反應6。(2)該材料可為細胞提供生存的三維空間,有利于細胞獲得足夠的營養(yǎng)物質(zhì),進行氣體交換并排除廢物。將輸尿管ECM移植于缺損區(qū)后,保持輸尿管完整性,保證尿液流通的作用,同時還可作為自體輸尿管細胞生長框架,誘導自體細胞長入其內(nèi)。因輸尿管有極強的再生能力,移植后自體輸尿管將形成新的具有原來功能和形態(tài)的輸尿管,達到修復和重建的目的。自體輸尿管細胞在ECM中的生長與一般再生方式不同。一般的輸尿管缺損區(qū)再生修復早期是由周圍纖維組織包繞支架形成封閉結(jié)構(gòu),腔內(nèi)可被再生的輸尿管移行上皮細胞覆蓋,但無平滑肌組織再生,缺損的輸尿管各層組織需6個月以上方可全部完成再生3。而ECM中的細胞生長方式是自體輸尿管細胞全層式長入7，但因條件所限,實驗中未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細胞生長的證據(jù)。目前國外對ECM的研究及應用主要為人工合成的ECM替代物和天然ECM。前者主要由聚乳