限制性核酸內(nèi)切酶

1、限制性核酸內(nèi)切酶 限制性核酸內(nèi)切酶是可以識(shí)別特定的核苷酸序列，并在每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵進(jìn)行切割的一類(lèi)酶，簡(jiǎn)稱限制酶。 限制性核酸內(nèi)切酶是由細(xì)菌產(chǎn)生的，其生理意義是提高自身的防御能力. 限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNA。 根據(jù)限制酶的結(jié)構(gòu)，輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類(lèi)型，分別是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而型限制性內(nèi)切酶只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性內(nèi)切酶同時(shí)具有修飾及認(rèn)知切割的作用。 第一型限制酶

2、同時(shí)具有修飾（modification）及識(shí)別切割（restriction）的作用；另有識(shí)別（recognize)DNA上特定堿基序列的能力，通常其切割位點(diǎn)（cleavage site）距離識(shí)別位點(diǎn)（recognition site）可達(dá)數(shù)千個(gè)堿基之遠(yuǎn)。例如：EcoB、EcoK。 第二型限制酶 只具有識(shí)別切割的作用，修飾作用由其他酶進(jìn)行。所識(shí)別的位置多為短的回文序列（palindrome sequence）；所剪切的堿基序列通常即為所識(shí)別的序列。是遺傳工程上，實(shí)用性較高的限制酶種類(lèi)。例如：EcoRI、Hind。 第三型限制酶 與第一型限制酶類(lèi)似，同時(shí)具有修飾及識(shí)別切割的作用。可識(shí)別短的不對(duì)稱序

3、列，切割位與識(shí)別序列約距24-26個(gè)堿基對(duì)。例如：Hinf。生理意義 限制作用實(shí)際就是限制酶降解外源DNA1 ，維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。甲基化是常見(jiàn)的修飾作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受到保護(hù)。通過(guò)甲基化作用達(dá)到識(shí)別自身遺傳物質(zhì)和外來(lái)遺傳物質(zhì)的目的。所以，能產(chǎn)生防御病毒侵染的限制酶的細(xì)菌，其自身的基因組中可能有該酶識(shí)別的序列，只是該識(shí)別序列或酶切位點(diǎn)被甲基化了。但并不是說(shuō)一旦甲基化了，所有限制酶都不能切割。大多數(shù)限制酶對(duì)DNA甲基化敏感，因此當(dāng)限制酶目標(biāo)序列與甲基化位點(diǎn)重疊時(shí)，對(duì)酶切的影響有3種可能，即不影響、部分影響、完全阻止。對(duì)甲基化DNA的切割能力是限制酶內(nèi)在和不可預(yù)測(cè)的特性，

4、因此，為有效的切割DNA，必須同時(shí)考慮DNA甲基化和限制酶對(duì)該類(lèi)型甲基化的敏感性。另外，大部分商業(yè)限制酶如今專(zhuān)門(mén)用于切割甲基化DNA。限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用 自從I型限制酶發(fā)現(xiàn)以來(lái),越來(lái)越多地受到生化學(xué)家的青睞,因?yàn)橄拗泼笇?duì)DNA分子具有專(zhuān)一性的切口,而為人們?cè)诜肿铀缴锨懈罘治?、重組遺傳信息提供了重要的工具。 (一)用于染色體DNA的分析 先將DNA用限制性內(nèi)切酶切割成一系列片段,利用聚丙烯酷胺或瓊脂糖電泳可以輕而易舉地將上述片段分離并且通過(guò)測(cè)定它們?cè)谀z中的遷移速度或直接在電鏡下觀察測(cè)量它們的大小。這些碎片在整個(gè)基因組的排列次序,主要靠幾種不同的限制酶部分水解DNA,再對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。 用

5、同樣的方法也可以進(jìn)行DNA中各脫氧核普酸的順序分析。也就是說(shuō),逐步使用多種限制酶,可將染色體DNA片段切得很小,如果片段之間出現(xiàn)重迭,分析小的重迭DNA片段的脫氧核普酸的序列,用現(xiàn)在的生化方法是毫無(wú)問(wèn)題的。 (二)確定DNA復(fù)制起點(diǎn)或終點(diǎn)的位置在DNA復(fù)制開(kāi)始之后,將DNA分離出來(lái),用限制酶處理,再用電鏡觀察是在什么地方開(kāi)始復(fù)制的,Fareed等利用EeoRI確定了sV40DNA分子的復(fù)制起點(diǎn)。 同理也可以確定RNA在DNA上的轉(zhuǎn)錄位置,例如,將標(biāo)記的RNA與未標(biāo)記的DNA雜交,就可以知道這段RNA是從哪一段DNA上轉(zhuǎn)錄的。(三)基因的甲基化研究由于HPal僅能識(shí)別切割雙鏈DNA分子中ccGG

6、順序,但其中Cyt必需是設(shè)有甲基化的;而MPsI識(shí)別同樣的順序,但其中Cyt必需是被甲基化的。因此有人利用這一對(duì)限制酶對(duì)真核基因的甲基化程度進(jìn)行研究(1。(四）應(yīng)用于DNA重組分子生物學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)的許多核酸酶類(lèi)都可用作基因工程的工具。其中能識(shí)別特定的回文序列并切割DNA雙鏈的類(lèi)限制性核酸內(nèi)切酶在DNA重組技術(shù)中被廣泛應(yīng)用。（五）構(gòu)建載體采用5端引入1個(gè)限制性內(nèi)切酶Xcm 酶切位點(diǎn)的1對(duì)引物,以水稻品種日本晴基兇組DNA作為模板,擴(kuò)增得到一段627 bp的PCR片段.并將其連接到pGEM-T Easy載體上得到名為T(mén)-xia的重組載體.利用限制性內(nèi)切酶Xcm 酶切T-xia載體產(chǎn)生的自制T載體與

7、其他PCR片段連接,檢測(cè)結(jié)果表明,有80%的重組菌能擴(kuò)增出目的片段。限制酶的作用位點(diǎn)質(zhì)粒 質(zhì)粒存在于許多細(xì)菌以及酵母菌等生物中，是細(xì)胞染色體外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子。 把一個(gè)有用的目的DNA片段通過(guò)重組DNA技術(shù)，送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖和表達(dá)的工具叫載體（Vector）。細(xì)菌質(zhì)粒是重組DNA 技術(shù)中常用的載體。質(zhì)粒分子本身是含有復(fù)制功能的遺傳結(jié)構(gòu)。質(zhì)粒還帶有某些遺傳信息，所以會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。其自我復(fù)制能力及所攜帶的遺傳信息在重組DNA操作，如擴(kuò)增、篩選過(guò)程中都是極為有用的。 質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上為適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室操作而進(jìn)行人工構(gòu)建的。與天然質(zhì)粒相比，質(zhì)粒載體通常帶有

8、一個(gè)或一個(gè)以上的選擇性標(biāo)記基因（如抗生素抗性基因）和一個(gè)人工合成的含有多個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量盡可能減少，以便于基因工程操作。大多質(zhì)粒載體帶有一些多用途的輔助序列，這些用途包括通過(guò)組織化學(xué)方法肉眼鑒定重組克隆、產(chǎn)生用于序列測(cè)定的單鏈DNA、體外轉(zhuǎn)錄外源DNA序列、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達(dá)等。一個(gè)理想的克隆載體大致應(yīng)有下列一些特性：分子量小、多拷貝、松弛控制型；具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單切點(diǎn)；能插入較大的外源DNA片段；具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于鑒定和篩選。對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)害。常用的質(zhì)粒載體大小一般在1kb至10kb之間，如P

9、BR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（簡(jiǎn)稱pBS）等。細(xì)胞復(fù)制 質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有兩種類(lèi)型：緊密控制型（Stringent control）和松弛控制型（Relaxed control）。前者只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制，當(dāng)染色體不復(fù)制時(shí)，它也不能復(fù)制，通常每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只含有一個(gè)或幾個(gè)質(zhì)粒分子，如F因子。后者的質(zhì)粒在整個(gè)細(xì)胞周期中隨時(shí)可以復(fù)制，在每個(gè)細(xì)胞中有許多拷貝，一般在20個(gè)以上，如 Col E1質(zhì)粒。在使用蛋白質(zhì)合成抑制劑-氯霉素時(shí)，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、染色體DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂均受到抑制，緊密型質(zhì)粒復(fù)制停止，而松弛型質(zhì)粒繼續(xù)復(fù)制，質(zhì)?？截悢?shù)可由原來(lái)20多個(gè)擴(kuò)

10、增至1000-3000個(gè)，此時(shí)質(zhì)粒DNA占總DNA的含量可由原來(lái)的2%增加至40-50%。質(zhì)粒的不相容性 利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中共同存在，當(dāng)兩種質(zhì)粒同時(shí)導(dǎo)入同一細(xì)胞時(shí), 它們?cè)趶?fù)制及隨后分配到子細(xì)胞的過(guò)程中彼此競(jìng)爭(zhēng)。在一些細(xì)胞中，一種質(zhì)粒占優(yōu)勢(shì)，而在另一些細(xì)胞中另一種質(zhì)粒卻占上風(fēng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)幾代后，占少數(shù)的質(zhì)粒將會(huì)丟失，因而在細(xì)胞后代中只有兩種質(zhì)粒的一種，這種現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同復(fù)制系統(tǒng)的質(zhì)粒則可以穩(wěn)定地共存于同一宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒通常含有編碼某些酶的基因，其表型包括對(duì)抗生素的抗性，產(chǎn)生某些抗生素，降解復(fù)雜有機(jī)物，產(chǎn)生大腸桿菌

11、素和腸毒素及某些限制性內(nèi)切酶與修飾酶等。質(zhì)粒圖譜大腸桿菌質(zhì)粒的分子結(jié)構(gòu)示意圖pBR322質(zhì)粒 pBR322質(zhì)粒DNA分子的長(zhǎng)度為4361bp*（*Sequencing data from Watson (confirmed at New England Biolabs, Inc.) has shown pBR322 to be 4,361 base pairs, not 4,363 base pairs as previously reported.），此載體中有兩個(gè)標(biāo)記基因，一個(gè)是氨芐青霉素抗性基因（Apr），另一個(gè)是四環(huán)素抗性基因（Tetr）。已知pBR322DNA分子共有24種核酸內(nèi)切限

12、制酶的單一識(shí)別位點(diǎn)。其中7種限制酶（從12：00位置按順時(shí)針?lè)较颍┘碋coRV、NheI、BamHI、SphI、SalI、Xma和NruI的識(shí)別位點(diǎn)位于四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，另外有2 種限制酶即ClaI和Hind的識(shí)別位點(diǎn)是存在于這個(gè)基因的啟動(dòng)區(qū)內(nèi)，在這9個(gè)限制位點(diǎn)上插入外源DNA都會(huì)導(dǎo)致tetr的失活。3種限制酶即ScaI、PvuI和PstI的識(shí)別位點(diǎn)位于氨芐青霉素抗性基因內(nèi)，在這些位點(diǎn)插入外源DNA則會(huì)導(dǎo)致ampr基因的失活。 由pBR322質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)可知其具有如下優(yōu)點(diǎn)：具有較小的分子量。經(jīng)驗(yàn)表明，為了避免在DNA的純化過(guò)程中發(fā)生鏈的斷裂，克隆載體的分子大小最好不要超過(guò)10Kb。pBR3

13、22質(zhì)粒這種小分子量的特點(diǎn)，不僅易于自身DNA的純化，而且可容納較大的外源DNA片段；具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)，能指示載體或重組DNA分子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞以及外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。標(biāo)記基因往往可以賦予宿主細(xì)胞一種新的表型，這種轉(zhuǎn)化細(xì)胞可明顯地區(qū)別于非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。當(dāng)我們把一個(gè)DNA片段插入到某一個(gè)標(biāo)記基因內(nèi)時(shí)，該基因就失去了相應(yīng)的功能。當(dāng)把這種重組DNA分子轉(zhuǎn)到宿主細(xì)胞后，該基因原來(lái)賦予的表型也就消失了。要是仍保留了原來(lái)表型的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)含有的DNA分子一定不是重組子。很顯然，既要指示外源DNA是否進(jìn)入了宿主細(xì)胞，又要指示載體DNA分子中是否插入了外源

14、DNA片段，那么這種載體必須至少具有兩個(gè)標(biāo)記基因。另外，pBR322質(zhì)粒載體還具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過(guò)氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞中可積累10003000個(gè)拷貝，這就為重組體DNA的制備提供了極大的方便。 常用的人工質(zhì)粒運(yùn)載體有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四環(huán)素基因（Tcr）和抗氨芐青霉素基因（Apr），并含有27種限制性內(nèi)切酶的單一識(shí)別位點(diǎn)。 pBR322質(zhì)粒作為一種常用的基因克隆載體，在實(shí)際應(yīng)用中有著非常重要的地位，其中一個(gè)突出的例子就是應(yīng)用pBR322 作為克隆載體對(duì)水稻的葉綠體光誘導(dǎo)基因psbA 進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。應(yīng)用實(shí)例 -1 將水稻葉綠體的DNA，用EcoRI核酸限制性內(nèi)

15、切酶消化之后，放入含有溴化乙錠的低熔點(diǎn)（LMP）的1%瓊脂糖凝膠中作電泳分離。從LMP中分離出分子大小為1.82.5kb之間的DNA片段，再與同樣經(jīng)過(guò)了EcoRI核酸限制性內(nèi)切酶切割并用堿性磷酸酶作了脫磷酸處理的pBR322質(zhì)粒連接。然后，將混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌5346菌株，培養(yǎng)在氨芐青霉素選擇平板上，形成Ampr轉(zhuǎn)化子菌落群體。這樣就構(gòu)成了由EcoRI核酸限制性內(nèi)切酶切割的水稻葉綠體DNA基因組庫(kù)。用Ampr轉(zhuǎn)化子菌落與32P放射性標(biāo)記的玉米psbA DNA 探針作菌落雜交，可以分離出其中的陽(yáng)性克隆體。從這些陽(yáng)性克隆體中分離出來(lái)的重組體質(zhì)粒DNA，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的分析，就能測(cè)出水稻葉綠體基因ps

16、bA的序列。應(yīng)用實(shí)例-2 利用pBR322作為載體重組人體的抑生長(zhǎng)激素也是一個(gè)經(jīng)常提到的應(yīng)用例子。其過(guò)程和水稻葉綠體基因重組大同小異，只是除了在質(zhì)粒載體上插入抑生長(zhǎng)激素基因外，還將含有l(wèi)ac操縱子起始部分的片段（包括啟動(dòng)子、操縱區(qū)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和半乳糖苷酶的主要部分）插在抑生長(zhǎng)激素基因的旁邊。由于有了lac操縱子的控制，重組基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)就變得比較容易了。應(yīng)用實(shí)例-3 目的監(jiān)控MSAP甲基化檢測(cè)過(guò)程,以控制MSAP每一反應(yīng)步驟。方法利用PBR322質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照,全程監(jiān)控MSAP分析中酶切、連接、預(yù)擴(kuò)與選擴(kuò)體系。結(jié)果PBR322質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照電泳時(shí)條帶有限,可以根據(jù)條帶有無(wú)和位置對(duì)MSAP甲基化檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行全程監(jiān)控,有助于發(fā)現(xiàn)問(wèn)題的具有所在。結(jié)論該研究可以為MSAP技術(shù)提供可靠保障。 MS